Fabricage van Amperometrisch Elektroden

Summary

Dit protocol beschrijft hoe het genereren van carbon fiber elektroden. De elektroden worden vervolgens gebruikt om de catecholamine vrijlating detecteren van blaasjes met koolstofvezel amperometrie.

Abstract

Carbon fiber elektroden zijn cruciaal voor de detectie van catecholamine vrijlating uit de blaasjes in enkele cellen voor amperometrie metingen. Hier beschrijven we de technieken die nodig zijn om een ​​laag geluidsniveau (<0,5 pA) elektroden te genereren. De technieken zijn aangepast op basis van gepubliceerde beschrijvingen van eerdere onderzoekers (1,2). Elektroden worden gemaakt door het bereiden van koolstofvezels en threading ze individueel in elke capillair met behulp van een vacuüm met een filter om de vezels zuigen. Vervolgens wordt de capillaire buis met glasvezel getrokken door een trekker elektrode, het creëren van twee helften, elk met een fijne puntige tip. De elektroden zijn gedrenkt in hete, vloeibare epoxy gemengd met verharder aan een epoxy-glazen afdichting te creëren. Ten slotte worden de elektroden in een oven geplaatst om de epoxy te genezen. Zorgvuldige behandeling van de elektroden is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat ze gemaakt zijn consequent en zonder schade. Dit protocol laat zien hoe om te fabriceren en amperometrische elektroden geknipt voor de opname van enkelvoudige cellen.

Protocol

Deel 1: Carbon Fiber Voorbereiding

1. Snijd een bundel van koolstofvezels (we gebruiken 7μm diameter) met een lengte die is ~ 1,25 x de lengte van de capillaire pipet.
2. Verwijder de dimensionering door het koken van ~ 100 ml aceton in een container en het toevoegen van de vezels aan de hete, kokende aceton gedurende 30 minuten of langer.
3. Verwijder vezels van de warme aceton, en over te dragen aan een schone beker met 50-100 ml verse aceton.
4. Droge vezels door het plaatsen van de bundel op een open 150 mm petrischaal en airdry 's nachts.

Deel 2: Fire-polijsten capillairtjes

1. Fire-polish elk capillair (we gebruiken micro-hematocriet capillaire buizen, 1,5 mm buitendiameter, binnendiameter 1,3 mm, 7,5 cm lang) door houden de buis in het midden met een tang en het blootstellen van de einde van de flame.Rotate de buis over 3 keer, terwijl in de vlam.
2. Omkeren van de buis en plaats het andere uiteinde in de vlam, opnieuw draaien 3 keer.
3. Plaats de brand-gepolijste buizen in een glazen schaal en transfer naar de oven tot ze klaar zijn om gevuld te worden met carbon vezels.

Deel 3: Threading een Carbon Fiber in een capillair

1. Net als bij de beschrijvingen van Machado et al.. (2008) en Mundroff en Wightman (2002), zuigen de vezel in de glazen buis met behulp van plastic buis verbonden met een stofzuiger met een filter.
2. Snijd de vezel met behulp van een scalpel.Leave ¼ inch van vezels uit de buis.

Deel 4: Trekken pipet-Fiber in een elektrode Puller

1. Plaats capillaire buis in de elektrode trekker (we gebruiken Narishige Japan Model PP-830) en draai de knoppen om de capillair zijn plaats te houden.
2. Manipuleren van de schakelaars uit te voeren twee trekt, ingesteld op de optimale trekker-instellingen.
3. Zodra de pipet wordt getrokken in de helft, scheid de twee helften door het snijden van de kale glasvezel in het centrum met een schaar.
4. Verwijder elke elektrode half en trek aan de uitstekende fiber to the glas seal.Trim breekt de vezel met een schaar, zodat slechts 1 / 8 inch van de vezel is links buiten van de buis.
5. Herhaal de stappen 1-4 tot ongeveer 16 vezel-elektroden worden getrokken.

Deel 5: Het maken van Epoxy-Glass Seal

1. Verhit een pre-made hoeveelheid van epoxy op een hete plaat is ingesteld op 55 ° C gedurende 6 minuten in een zuurkast.
2. Terwijl de epoxy is verwarming, wrap ~ 16 van de getrokken elektroden in een bundel met behulp van tape.
3. Nadat de EPON hars wordt verwarmd gedurende 6 minuten, voeg 0,7 gram XOF MPDA om de hete Epon Resin (14%, w / v). Meng door zwenken van de flacon.
4. Dip de bundel van de elektroden in de hete epoxy plus verharder solution.After ongeveer 20 sec, een voldoende hoeveelheid van epoxy zal het glas tips via capillaire werking in te voeren.
5. Ongedaan maken van de bundel, plaatsen elektroden op karton met sleuven en plaats deze lade in een oven op 100 ° C.
6. Na ten minste 48 uren, te onderzoeken elke elektrode onder een dissectie microscope.Discard elektroden die niet vullen met epoxy, een gebroken tip, hebben meer dan een vezel, etc.After de inspectie van elke elektrode, plaats ze terug op de kartonnen houder en weer terug in de oven.Electrodes zijn meestal goed voor ongeveer 1 maand na de fabricage.

Deel 6: Het snijden van de Carbon Fiber

1. Plaats carbon fiber elektrode voorzichtig op een glasplaatje met Teflon tape.
2. Visualiseer de tip onder een dissectie microscoop.
3. Gebruik een schone scalpel loodrecht dwars door de koolstofvezel om een ​​vlak en schoon oppervlak te verlaten voor de plaatsing van de koolstofvezel tegen een cel.

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe te genereren en te snijden amperometrische elektroden. Tijdens de amperometrische opnames, is een carbon fiber elektrode geplaatst tegen het oppervlak van een secretorische cel. Exocytotic activiteit wordt waargenomen als amperometrische spikes, die de elektrochemische stroom veroorzaakt door de overdracht van elektronen na oxidatie van de catecholamines aangeeft. Met de praktijk maken en snijden amperometrische elektroden, kan het geluidsniveau sterk worden verbeterd ten opzichte van veel van de commercieel verkrijgbare elektroden.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes	Reagent	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers	Material	Goodfellow	C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Material	Fisher Scientific	NC9836768
Epoxy Resin	Reagent	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Dissecting Microscope	Instrument
Electrode Puller	Instrument	Narishige International	PP-830	1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven	Instrument			set to 100 degrees F.
Hot plate	Instrument			set to 55 degrees C