Summary
Ce protocole décrit comment générer des électrodes en fibre de carbone. Les électrodes sont ensuite utilisés pour détecter la libération de catécholamines à partir des vésicules avec ampérométrie en fibre de carbone.
Abstract
Électrodes en fibre de carbone sont cruciaux pour la détection de la libération de catécholamines à partir de vésicules dans des cellules individuelles pour des mesures ampérométrie. Ici, nous décrivons les techniques nécessaires pour produire un bruit faible (<0,5 Pa) électrodes. Les techniques ont été modifiés à partir des descriptions publiées par les chercheurs précédents (1,2). Les électrodes sont faites par la préparation de fibres de carbone et de les enfiler individuellement dans chaque tube capillaire en utilisant un aspirateur avec un filtre pour aspirer la fibre. Ensuite, le tube capillaire avec la fibre est tirée par un extracteur d'électrode, la création de deux moitiés, chacune avec une pointe à pointe fine. Les électrodes sont plongées dans chaude, époxy liquide mélangée avec le durcisseur pour créer un joint verre-époxy. Enfin, les électrodes sont placées dans un four pour durcir l'époxy. Une manipulation soigneuse des électrodes est essentielle afin de s'assurer qu'elles sont faites de manière cohérente et sans dommage. Ce protocole montre comment fabriquer des électrodes ampérométriques et coupé pour l'enregistrement à partir des cellules individuelles.
Protocol
Partie 1: Préparation de la fibre de carbone
- Couper un faisceau de fibres de carbone (nous utilisons 7μm de diamètre) à une longueur qui est ~ 1,25 X la longueur de la pipette capillaire.
- Retirez le dimensionnement par l'ébullition ~ 100 ml d'acétone dans un récipient et ajouter des fibres à la chaleur, de l'acétone bouillante pendant 30 minutes ou plus.
- Enlever les fibres de l'acétone chaude, et le transfert d'un bécher propre avec 50-100 ml d'acétone fraîche.
- Fibres sec en plaçant le paquet sur un plat ouvert 150 mm de Petri et Airdry nuit.
Partie 2: tubes en verre au feu de polissage capillaire
- Incendie-polonaise chaque tube capillaire (nous utilisons des micro-hématocrite tubes capillaires, de 1.5mm de diamètre extérieur, diamètre intérieur 1,3 mm, 7,5 cm de long) en tenant le tube dans le centre avec une pince et en exposant la fin de la flame.Rotate du tube sur 3 fois alors que dans la flamme.
- Inverser le tube et placez l'extrémité opposée dans la flamme, encore une fois tourner 3 fois.
- Placer les tubes polie au feu dans un plat en verre et le transfert au four jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être remplis de fibres de carbone.
Partie 3: Threading une fibre de carbone dans un tube capillaire
- Semblable à la description de Machado et al. (2008) et Mundroff et Wightman (2002), sucer la fibre dans le tube de verre en utilisant des tubes en plastique relié à un aspirateur avec un filtre.
- Couper la fibre avec un ¼ de pouce d'scalpel.Leave sur la fibre du tube.
Partie 4: Tirer pipette-fibre dans un extracteur d'électrode
- Placer le tube capillaire dans l'extracteur d'électrode (nous utilisons le Japon Narishige Modèle PP-830) et serrez les boutons pour tenir le tube capillaire en place.
- Manipuler les commutateurs pour exécuter deux tractions, fixé à l'extracteur réglages optimaux.
- Une fois la pipette est tiré en deux, séparer les deux moitiés en coupant la fibre nue au centre avec des ciseaux.
- Retirez chaque moitié d'électrode et de tirer sur la fibre en saillie de briser le verre de la fibre seal.Trim avec des ciseaux afin que seul 1 / 8 pouce de fibre est laissé à l'extérieur du tube.
- Répétez les étapes 1-4 jusqu'à environ 16 fibres électrodes sont retirées.
Partie 5: Faire verre-époxy Seal
- Chauffer une aliquote de pré-faites de l'époxy sur une plaque chauffante réglée sur 55 ° C pendant 6 minutes dans une hotte.
- Alors que l'époxy est le chauffage, enveloppez ~ 16 des électrodes tiré dans un paquet en utilisant du ruban.
- Après la résine Epon est chauffé pendant 6 minutes, ajouter 0,7 grammes XOF MPDA de la résine chaude Epon (14%, p / v). Mélanger en remuant le flacon.
- Trempez le faisceau d'électrodes dans l'époxy à chaud, plus solution.After durcisseur environ 20 secondes, une quantité suffisante d'époxy entrera les astuces de verre par capillarité.
- Défaire les électrodes bundle place, sur un carton avec des fentes et le lieu de ce bac dans un four réglé à 100 ° F.
- Après au moins 48 heures, examiner chaque électrode sous un électrodes microscope.Discard dissection qui ne remplit pas à l'époxy, ont une pointe brisées, ont plus d'une fibre, etc.After inspectant chaque électrode, les replacer sur le support de carton et de retour dans le oven.Electrodes sont généralement bonnes pour environ un mois après la fabrication.
Partie 6: coupe la fibre de carbone
- Placer l'électrode de fibre de carbone avec soin sur une lame de verre avec du ruban téflon.
- Visualisez la pointe d'un microscope à dissection.
- Utilisez une lame scalpel propre pour couper perpendiculairement à la fibre de carbone pour laisser une surface plate et propre pour le placement de la fibre de carbone contre une cellule.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit comment générer et couper des électrodes ampérométriques. Pendant les enregistrements ampérométrique, une électrode en fibre de carbone est placée contre la surface d'une cellule sécrétrice. L'activité est observée comme exocytotique pics ampérométriques, qui indique le courant électrochimique provoquée par le transfert d'électrons après oxydation des catécholamines. Avec la pratique et la découpe des électrodes ampérométriques, les niveaux de bruit peut être grandement améliorée sur la plupart des électrodes disponibles commercialement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Aaron P. Fox à l'Université de Chicago, dans le laboratoire duquel ce protocole a été conçu à l'origine, et William Roden (Université de Saint Louis) pour le développement ultérieur du protocole.
Nous remercions la Fondation Whitehall et la National Science Foundation pour le soutien.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes | Reagent | Sigma-Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light. |
| Carbon Fibers | Material | Goodfellow | C005725 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Material | Fisher Scientific | NC9836768 | |
| Epoxy Resin | Reagent | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Dissecting Microscope | Instrument | |||
| Electrode Puller | Instrument | Narishige International | PP-830 | 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C |
| Oven | Instrument | set to 100 degrees F. | ||
| Hot plate | Instrument | set to 55 degrees C |
References
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
