Herstellung von amperometrische Elektroden

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie Kohlefaser Elektroden zu erzeugen. Die Elektroden werden anschließend verwendet, um Katecholaminausschüttung von Vesikeln mit Kohlefaser Amperometrie erkennen.

Abstract

Carbon-Elektroden sind entscheidend für den Nachweis von Katecholamin Entlassung aus dem Vesikel in einzelnen Zellen für Amperometrie Messungen. Hier beschreiben wir die Techniken erforderlich, um geräuscharm (<0,5 pA) Elektroden zu erzeugen. Die Techniken wurden aus veröffentlichten Beschreibungen wurden von früheren Forschern (1,2) modifiziert. Die Elektroden sind durch Herstellung von Kohlenstoff-Fasern und Einfädeln sie einzeln in jede Kapillare mit Hilfe eines Vakuums mit einem Filter, um die Faser absaugen gemacht. Anschließend wird die Kapillare mit Faser durch eine Elektrode Abziehers, wodurch zwei Hälften, die jeweils mit einer feinen Spitze. Die Elektroden werden in heißem, flüssigem Epoxidharz mit Härter gemischt, um ein Epoxid-Glas-Siegel erstellen getaucht. Schließlich sind die Elektroden in einen Ofen gelegt, um das Epoxidharz zu heilen. Sorgfältige Behandlung der Elektroden ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sie gemacht werden konsequent und ohne Beschädigung. Dieses Protokoll zeigt, wie in der Herstellung und schneiden amperometrischen Elektroden für die Aufzeichnung von einzelnen Zellen.

Protocol

Teil 1: Carbon Fiber Preparation

1. Cut ein Bündel von Kohlenstoff-Fasern (wir verwenden 7μm Durchmesser) auf eine Länge ~ 1,25 X die Länge der Kapillare Pipette wird.
2. Entfernen Sie die Dimensionierung durch Kochen ~ 100 ml Aceton in einen Behälter und Zugabe der Fasern zu den heißen, siedendem Aceton für 30 Minuten oder länger.
3. Entfernen Fasern aus dem warmen Aceton, und in ein sauberes Becherglas mit 50-100 ml frischem Aceton.
4. Trockene Fasern, indem das Bündel auf einer offenen 150 mm Petrischale und lufttrocken Nacht.

Teil 2: Feuerpolieren Glaskapillaren

1. Fire-polnisch jeder Kapillare (wir benutzen Mikro-Hämatokrit-Kapillarröhrchen, 1,5 mm Außendurchmesser, 1,3 mm Innendurchmesser, 7,5 cm lang), indem das Rohr in der Mitte mit einer Pinzette und Freilegen der Ende der flame.Rotate das Rohr über 3-mal, während in der Flamme.
2. Kehren Sie die Röhrchen und setzen Sie das andere Ende in die Flamme wieder rotierenden 3-mal.
3. Legen Sie die feuerpolierte Rohre in eine Glasschale und Transfer zum Ofen, bis sie bereit sind, mit Carbon-Fasern gefüllt werden sollen.

Teil 3: Threading einem Kohlefaser in einer Kapillare

1. Ähnlich wie bei den Beschreibungen von Machado et al. (2008) und Mundroff und Wightman (2002), saugen die Faser in das Glasrohr mit Kunststoffschlauch verbunden, um ein Vakuum mit einem Filter.
2. Schneiden Sie die Faser mit Hilfe eines scalpel.Leave ¼ inch der Faser aus dem Rohr.

Teil 4: Pulling Pipette-Fiber in einer Elektrode Puller

1. Legen Sie Kapillare in die Elektrode Abzieher (wir verwenden Narishige Japan Modell PP-830) und ziehen Sie die Regler in die Kapillare in Position zu halten.
2. Bearbeiten Sie die Schalter auszuführen zwei Züge, setzen Sie auf die optimale puller Einstellungen.
3. Nachdem die Pipette in der Hälfte gezogen wird, trennen Sie die zwei Hälften, indem die nackten Faser in der Mitte mit einer Schere.
4. Entfernen Sie jede Elektrode Hälfte und Zug auf die hervorstehenden Fasern zu brechen das Glas seal.Trim die Faser mit einer Schere, so dass nur 1 / 8 Zoll von Faser außerhalb der Röhre bleibt.
5. Wiederholen Sie die Schritte 1-4, bis etwa 16-Faser-Elektroden gezogen werden.

Teil 5: Making Epoxy-Glass Seal

1. Erhitzen Sie eine vorgefertigte Aliquot Epoxy auf einer heißen Platte gesetzt bis 55 ° C für 6 Minuten in einem Abzug.
2. Während Epoxidharz Heizung, wrap ~ 16 des gezogenen Elektroden in ein Bündel mit Klebeband.
3. Nach dem Epon Resin für 6 Minuten erwärmt ist, fügen Sie 0,7 Gramm XOF MPDA zu den heißen Epon Resin (14%, w / v). Mix durch Schwenken der Flasche.
4. Tauchen Sie die Bündel von Elektroden in die heiße Epoxy plus Härter solution.After ca. 20 Sekunden, eine ausreichende Menge an Epoxid wird das Glas Tipps über Kapillarwirkung geben.
5. Lösen Sie die Bündel, Ort Elektroden auf Karton mit Schlitzen und Ort dieses Fach in einem Ofen auf 100 ° F.
6. Nach mindestens 48 Stunden, überprüfen Sie jede Elektrode unter einem Präpariermikroskop microscope.Discard Elektroden, die nicht mit Epoxy hat zu füllen, haben eine zertrümmerte Spitze, haben mehr als eine Faser, etc.After Inspektion jede Elektrode, legen Sie sie wieder auf dem Karton Inhaber und zurück in den oven.Electrodes sind in der Regel gut für etwa 1 Monat nach der Herstellung.

Teil 6: Schneiden Sie die Carbon Fiber

1. Legen Sie Kohlefaser Elektrode vorsichtig auf einen Objektträger mit Teflonband.
2. Visualisieren Sie die Spitze unter einem Binokular.
3. Verwenden Sie ein sauberes Skalpell senkrecht quer durch die Kohlefaser eine ebene, saubere Oberfläche für die Platzierung der Kohlefaser gegen eine Zelle zu verlassen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie zu generieren und zu schneiden amperometrischen Elektroden. Während amperometrische Aufnahmen, ist eine Kohlefaser-Elektrode gegen die Oberfläche eines sekretorischen Zelle platziert. Exozytotische Aktivität wird als amperometrische Spikes, die die elektrochemische Strom, der durch den Transfer von Elektronen nach der Oxidation der Katecholamine verursacht zeigt beobachtet. Mit etwas Übung machen und Schneiden amperometrischen Elektroden kann Geräuschpegel erheblich über viele der im Handel erhältlichen Elektroden verbessert werden.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes	Reagent	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers	Material	Goodfellow	C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Material	Fisher Scientific	NC9836768
Epoxy Resin	Reagent	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Dissecting Microscope	Instrument
Electrode Puller	Instrument	Narishige International	PP-830	1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven	Instrument			set to 100 degrees F.
Hot plate	Instrument			set to 55 degrees C