Tillverkning av amperometriska elektroder

Summary

Detta protokoll beskriver hur du skapar elektroder kolfiber. Elektroderna är sedan används för att upptäcka katekolamin släppa från vesikler med kolfiber amperometry.

Abstract

Kolfiber elektroder är avgörande för detektion av katekolaminer befrielse från blåsor i enstaka celler för amperometry mätningar. Här beskriver vi de tekniker som behövs för att generera låg ljudnivå (<0,5 Pa) elektroder. De tekniker har ändrats från publicerade beskrivningar av tidigare forskare (1,2). Elektroder görs genom att förbereda kolfiber och trä dem individuellt till varje kapillärrör med en dammsugare med ett filter för att aspirera fibern. Därefter är det kapillärröret med fiber som dras av en elektrod avdragare, skapa två halvor, vardera med en fin spets. Elektroderna doppas i hett, flytande epoxi blandat med härdare för att skapa en epoxy-glasförseglingen. Slutligen är de elektroder placeras i en ugn för att bota epoxi. Noggrann hantering av elektroderna är avgörande för att säkerställa att de är konsekvent och utan skador. Detta protokoll visar hur man fabricera och klippa amperometriska elektroder för inspelning från enstaka celler.

Protocol

Del 1: kolfiber Förberedelser

1. Klipp en bunt av kolfibrer (vi använder 7μm diameter) med en längd som är ~ 1,25 x längden på kapillär pipetten.
2. Ta bort storleken bestäms av kokande ~ 100 ml aceton i en behållare och lägga fibrerna för att den varma, kokande aceton i 30 minuter eller längre.
3. Ta bort fibrerna från den varma aceton, och överför till en ren bägare med 50-100 ml rent aceton.
4. Torra fibrer genom att placera bunten på en öppen 150 mm petriskål och airdry natten.

Del 2: Fire-polering Glas Kapillärrör

1. Fire-polish varje kapillärrör (vi använder micro-hematokrit kapillärrör, 1,5 mm ytterdiameter, 1.3mm innerdiameter, 7,5 cm lång) genom att hålla röret i mitten med pincett och utsätta slut på flame.Rotate röret om 3 gånger medan lågan.
2. Vänd röret och placera den andra änden till lågan, återigen roterande 3 gånger.
3. Placera elden-polerade rör i en glasskål och transfer till ugnen tills de är redo att fyllas med kolfiber.

Del 3: Threading en kolfiber i ett kapillärrör

1. Liknande beskrivningar av Machado et al. (2008) och Mundroff och Wightman (2002), suga fiber in i glasröret med plastslang ansluts till ett vakuum med ett filter.
2. Skär av fibrer med hjälp av en scalpel.Leave ¼ tum av fibrer ur röret.

Del 4: Dra pipett-fiber i en elektrod Puller

1. Placera kapillärrör i elektroden avdragare (vi använder Narishige Japan Modell PP-830) och dra åt rattarna för att hålla kapillärröret på plats.
2. Manipulera växlar för att köra två drar, inställd på den optimala avdragare inställningar.
3. När pipetten dras i hälften, separera de två halvorna genom att skära den bara fibern i mitten med sax.
4. Ta bort varje elektrod halv och dra på den utskjutande fibrer att bryta glaset seal.Trim fibern med en sax så att endast 1 / 8 tum av fiber som är kvar utanför röret.
5. Upprepa steg 1-4 tills för ungefär 16 fiber-elektroder dras.

Del 5: Göra Epoxy-glasförseglingen

1. Hetta upp en färdiga alikvot av epoxi på en värmeplatta satt till 55 ° C i 6 minuter i ett dragskåp.
2. Medan epoxi är uppvärmning, linda ~ 16 av de dras elektroder i en bunt med tejp.
3. Efter Epon Resin värms i 6 minuter, tillsätt 0,7 gram XOF MPDA till heta Epon Resin (14% w / v). Genom att snurra injektionsflaskan Mix.
4. Doppa bunt av elektroder i den varma epoxi plus härdare solution.After ca 20 sek, en tillräcklig mängd av epoxi kommer in glaset tips via kapillärkraften.
5. Ångra bunten, placera elektroder på kartong med slitsar och placera detta fack i en ugn inställd på 100 ° C.
6. Efter minst 48 timmar, undersöka varje elektrod under en dissekera microscope.Discard elektroder som inte fyller med epoxi har ett krossat spetsen, har mer än en fiber, etc.After inspekterar varje elektrod, lägg tillbaka dem på kartong hållaren och tillbaka i oven.Electrodes är oftast bra för ca 1 månad efter tillverkning.

Del 6: Kapning av kolfiber

1. Placera kolfiber elektroden försiktigt på en glasskiva med Teflon tejp.
2. Visualisera spetsen under en dissekera mikroskop.
3. Använd en ren skalpell blad för att skära vinkelrätt över kolfiber för att lämna en ren och plan yta för placering av kolfiber mot en cell.

Discussion

Detta protokoll beskriver hur du skapar och skär amperometriska elektroder. Under amperometriska inspelningar, är ett kolfiber elektrod placeras mot ytan av en sekretorisk cell. Exocytotic aktivitet observerats som amperometriska spikar, som anger elektrokemiska nuvarande orsakas av överföringen av elektroner efter oxidering av katekolaminer. Med övning gör och skärning amperometriska elektroder, kan bullernivån vara mycket bättre än många av de kommersiellt tillgängliga elektroderna.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes	Reagent	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers	Material	Goodfellow	C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Material	Fisher Scientific	NC9836768
Epoxy Resin	Reagent	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Dissecting Microscope	Instrument
Electrode Puller	Instrument	Narishige International	PP-830	1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven	Instrument			set to 100 degrees F.
Hot plate	Instrument			set to 55 degrees C