Overview
资料来源： 佩曼·沙贝吉-鲁德波什蒂和西娜·沙赫巴兹莫哈马迪，康涅狄格大学生物医学工程系，康涅狄格州斯托尔斯
纳米粒子已越来越多地用于靶向药物输送和控制药物释放的研究。虽然这些粒子大多因其生物相容性而发展为聚合物或脂质体颗粒，但目前研究使用金属和磁性纳米粒子的趋势。这些金属纳米粒子最初被用作成像中的造影剂，但最近的进步表明它们在药物和基因传递以及治疗中的重要性。金、银和顺磁纳米粒子在正在研究中所占份额最大。它们已被证明具有良好的生物相容性，某些品种的磁性纳米粒子已经开发并作为治疗靶向药物进行分发。
这些重元素通常用于使用荧光来评估传递和分布的研究，但它们的原子重是使用扫描电子显微镜 （SEM） 增加反散射电子分析对比度的良好条件).能量分散X射线光谱，它使用电子束与样品相互作用时发射的特征X射线来识别化学成分，也可以与SEM一起使用。这些方法具有提高分辨率和增强检测信心的好处，因为 EDS 可以确保图像的主题具有正确的组合，而当前的荧光方法可以从纳米粒子中分离出来，并可以快速褪色而成像。
该演示将检查随着时间的推移，人体器官中大小相关的金属纳米颗粒分布。在粒子输送到身体后，在一定时间点上，用SEM检查被切除的器官有各种尺寸的颗粒。
Principles
很难高估纳米粒子 （NPs） 在医疗应用中的重要性。它们被用作毒品、药物携带者、反差剂等。然而，为了使用某种类型的纳米粒子，有必要知道应用后如何和在哪里分配它，以及离开器官和随后的身体需要多长时间。这称为生物分布。
纳米粒子药物输送过程的复杂性可能有很大差异，从不针对组织但而是释放到全身的被动药物，到更主动地操纵药物靶向非常精确的器官或位置。大多数药物和疗法将使用被动靶向，由于大量血流和大量血管泄漏的肿瘤的渗透性和保留性（EPR 效应）增强，它仍然显示出巨大的成功。除被动定向外，通过附着肿瘤位点特异性配体，可以在纳米粒子的处理中进行主动靶向，也可以在注射后通过向磁性纳米粒子添加磁力的方式进行。这种磁场将纳米粒子从血流中拉出，流向受感染区域，从而降低了药物在血液中的花费时间，并增加对受影响区域的剂量。这些不同的传递方法将极大地影响纳米粒子在治疗后的分布，本实验旨在研究其初始分布及其随时间的分布。
目前的纳米粒子分布测量方法通常涉及将荧光粒子附着在纳米粒子上。根据纳米粒子的浓度、目标区域的大小和荧光强度，半透明小鼠可以使用光学成像技术进行分析，同时仍然活着，以确定粒子是否位于正确的区域。死后荧光也可用于测定小鼠不同器官的纳米颗粒水平。然而，这些方法缺乏纳米粒子的分辨率和确认荧光没有脱离纳米粒子。
目前的演示利用支持零散电子显微镜 （BEM） 和能量分散光谱 （EDS） 分析，以了解磁电纳米粒子 （MEN） 的生物分布，具体取决于其大小和在身体。样品中的MEN是钛和钛磁电纳米粒子，通过注射引入小鼠器官，然后被动地瞄准器官。小鼠在注射后1周、4周和8周被失去知觉，其器官被切除并保存。器官：肝脏、脾脏、肺、肾和大脑，然后使用微管机进行切片，并使用教育视频"生物样本的SEM成像"中描述的样品制备方法制备。 作为扫描电子显微镜 （SEM） 的一种模式，BEM 与 EDS 分析一起提供高分辨率成分分析，能够检测直径小至 10 nm 的单个纳米粒子。同时，该演示可以说明如何使用不同的探测器来检测、确认和绘制研究环境中的不同元素和粒子，以及不同的参数如何影响生成的图像。
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Procedure
1. 纳米粒子注射和器官采集
- 静脉注射纳米粒子到麻醉小鼠中，允许被动定向。
- 在所需的时间点，即1、4和8周，注射后，根据美国兽医医学协会（AVMA）指南，人道地对小鼠实施安乐死。
- 打开体腔，手术切除感兴趣的器官。将器官放入10%磷酸盐缓冲形式，放入聚丙烯容器中，直到样品制备。
2. 组织样品制备
- 使用钳子将小鼠组织从固定转移到磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。摇动样品 30 分钟，每 10 分钟更换一次 PBS。
- 取出组织，用抹布擦干。然后将其放入含有最佳切削温度化合物 （OCT） 的塑料模具中。储存在-80°C过夜。
- 第二天，将样品转移到低温中，并将温度设置为-23°C。
- 使用器官类型和纳米颗粒大小标记幻灯片，并将其放置在低温架上的架子上。
- 用 OCT 盖住冷冻夹头，并将样品放在顶部。将萃取器柱塞降至样品上，使其平衡 3-5 分钟。
- 将夹头安装到试样支架上，并将其定向，以便刀片可以直接穿过冷冻样品。将样品靠近刀片，使其面对粗糙。将厚度设置为 30 μm 并切片多个部分，直到生成均匀切割的切片。
- 通过将截面厚度减小到 7-8 μm，切换到精细面。通过按切片上标记的玻璃幻灯片收集切片部分。将两张幻灯片放在每张幻灯片上，然后存放在幻灯片架上。允许在室温下干燥。
- 干燥后，将滑轨架浸入 50% 乙醇中 3 分钟，以去除 OCT，使样品脱水。然后将机架转移到 80% 乙醇 3 分钟，然后将机架置于冷甲醇与丙酮的 1：1 比例下，在 -20°C 下放置 10 分钟。
- 拆下滑轨架，将多余的溶剂排空纸巾上。20-30 分钟后，将幻灯片放入滑动盒中，并储存在 -20°C 的冰柜中，直到成像。
3. 使用 SEM 和 EDS 进行高分辨率成像
- 按照"生物样品的SEM成像"中所述准备样品。然后，将样品加载到 SEM 中。
- 打开 SEM，并将工作距离调整到 5 mm 左右，将加速电压和光束电流调整到 25 keV，对于生物样品来说，这通常过高。但是，样品被涂覆，用于导电和保护。
- 开始成像并缩放至约 1，000-2，000 倍放大倍数，以查看包含纳米粒子的结构。请注意，如果没有反向散射检测 （BSD），则无法将其区分到特定深度以下。
- 在相同的参数下插入 BSD，并将 z 方向的舞台移动到与之前相同的工作距离。
- 以相同的放大倍率开始成像，并检查在纳米粒子存在的情况下，您能否看到高对比度。保存图像。
- 使用不同的 BSD 配置（探测器上的电荷对齐）选择显示纳米粒子对比度最高的配置。
- 放大显示纳米粒子或纳米粒子团的高对比度区域。
- 打开造型室的第2 个摄像头，通过按下 SEM 附件上的向下按钮，观察将 EDS 插入系统。一旦 EDS 靠近但未接触 BSD 或喷枪，松开按钮。
- 打开EDS电脑（仍在工作站）上的Aztec程序，从SEM获取图像。 使用"点和拍摄"方法点击对比度和纳米粒子非常密集的区域。
- EDS 将显示该点的特征 X 射线光谱。在图上查找要识别的钛峰。这证实了你所看到的确实是纳米粒子，而不是任何污染。
- 返回样本并使用 Atlas 软件映射幻灯片上器官的边界。选择用于创建区域的镶嵌图像的"组织"协议，然后让它运行（这最多可能需要几个小时）。
- 一旦软件创建并拼接复合图像，将其导出为 Tif 文件。
- 在开源软件 ImageJ 中打开 Tif 文件，并调整对比度阈值以突出显示极高对比度的区域（即纳米粒子）。使用内置函数使用"器官"协议中定义的像素大小（应为 100 nm 左右）量化纳米粒子的体积。
- 虽然此过程仅指小鼠肺的 1 周样本，但此过程与其他周和其他器官的样本一起重复，以编制显示分布的图表。
- 在计算每个器官每周的生物分布情况后，生物分布图将显示8周内纳米粒子的生物分布和浓度的变化。这些显示了峰值浓度，也提供了纳米粒子从器官中清除需要多长时间的信息。
金属和磁性纳米粒子被广泛用作药物输送的纳米载体。其在组织中的生物分布对于评估其疗效和安全性至关重要。纳米载体是亚微米粒子，通常限制在200纳米以下，可以装载治疗剂。由于其大小，他们能够访问身体的许多部位和器官。当颗粒最终出现在体内时，称为生物分布，是评估安全性、优化给药和改善药物靶向的重要参数。
在本视频中，将介绍定向药物交付的基本原则，并演示使用高分辨率成像技术评估生物分布的方法。还将讨论纳米粒子载体的其他应用。
让我们首先讨论纳米粒子的基本原理，并理解为什么它们被开发为药物载体。
首先，纳米级颗粒（可以是聚合物、脂质体或金属）通常具有生物相容性，这意味着它们对活组织无害或反应，不会引起免疫反应。然而，为了了解材料和颗粒大小如何影响体内的生物分布，必须进行纳米毒理学研究。
其次，它们的体积小，允许它们通过炎症部位的内皮，如肿瘤的内皮外溢，并产生有效的细胞接受。随着癌细胞的分裂，需要血管供应来提供营养和氧气，并支持肿瘤生长。这些血管形成迅速，因此通常是异常和有效的，包含其内皮衬里的巨大间隙，导致血管泄漏和渗透率增加。然后，纳米粒子能够从血液中逸出，并在肿瘤微环境中积累。当纳米载体通过EPR效应或增强的渗透性和保留效应的现象到达目标器官时，这称为被动瞄准。
最后，这些纳米粒子具有较大的表面积，可以通过特定的配体（如抗体或蛋白质）发挥作用。在主动靶向中，这些配体可以识别并结合肿瘤部位细胞过度表达的受体。纳米载体表面的配体与细胞受体之间的特定相互作用触发受体介导的内分泌，并促进细胞的接受。
现在，我们已经了解了纳米粒子药物输送的基本知识，让我们来看看使用高分辨率成像来确定小鼠模型中金属纳米粒子的生物分布的演示。
首先，准备将注入小鼠的纳米粒子。这里使用了30纳米的钛和钛颗粒。小鼠被麻醉后，通过尾静脉静脉注射纳米颗粒。让鼠标在一周、四周和八周内被动地瞄准器官时恢复。
在适当的注射后时间点，根据AVMA指南对小鼠进行人道安乐死。然后打开体腔，通过手术切除感兴趣的器官，如脾脏、肾脏、肝脏和肺。并将器官储存在10%磷酸盐缓冲的形式，直到分析。
现在使用钳子将小鼠组织从固定转移到磷酸盐缓冲盐水中。每 10 分钟更换 PBS 30 分钟，以去除过量的固定剂。然后从摇床中取出组织。将含有水溶性乙二醇和树脂的最佳切削温度化合物添加到标记的塑料模具中。
用 Kimwipe 干燥组织，然后将其放入塑料模具中。用覆盖组织的OCT化合物填充模具，并放入塑料袋中。将袋子放入装有干冰的桶中，并连夜移动到零下 80 摄氏度的冰柜中。
第二天，从冷冻箱中取出样品，放在干冰上，同时运送到冷冻室。将腔室温度设置为零下 23 度，然后将样品转移到低温室。使用要分割的样品的器官类型和纳米颗粒大小标记幻灯片。然后激活冷冻器。接下来用 OCT 盖住低温夹头。然后从模具中取出样品，并将其放在夹头顶部。将夹头安装到试样支架上，并定向和调整，以便刀片将直接切割到冷冻样品上。现在，将样品靠近刀片，并将厚度设置为 30 微米，以便粗糙面对。旋转手轮以切割 30 微米厚的部分，并继续切片，直到切割均匀的组织切片。对于精细面，将截面厚度设置为 7 到 8 微米，然后切片样品。
通过按切片上标记的玻璃滑块收集部分。然后将滑轨添加到机架中，并在室温下晾干。干燥后，将滑轨架中 50% 乙醇再浸下三分钟，取出 OCT.将机架转移到 80% 乙醇，然后浸入 3 分钟。然后，将机架移至冷甲醇与丙酮的一比一，并在零下 20 摄氏度的冰箱中放置。10 分钟后，从冰箱中取出滑架，并将其排干纸巾上。干燥时，将幻灯片放在滑动盒中，并储存在零下 20 摄氏度，直到使用。
现在，让我们来想象一下在注射一周后收集的小鼠肺组织，这些颗粒含有30纳米的钚和钛颗粒，以确定其生物分布。首先，将准备好的幻灯片安装到 SEM 舞台上。要了解如何溅射涂层和准备样品，请观看此系列中的上一段视频。然后将舞台加载到 SEM 室中。样品进入视野后，垂直移动样品至约 5 毫米的工作距离。打开电子束，然后选择二次电子的探测器。然后将光束加速电压设置为 25 千电子伏。要开始成像，放大样本的放大倍数约为 1，000 到 2，000 倍。在这种放大倍率下，即使纳米粒子不是可见的，也应当可以看到包含纳米粒子的结构。这称为次映像。
现在，在 SEM 模块中接合反向散射电子检测模式，以可视化纳米粒子。沿 Z 方向移动舞台，以达到上述相同的五毫米工作距离。调整反向散射检测器的配置，对检测面板使用不同的电压偏置，直到图像清晰。高对比度区域，即纳米粒子，现在应该是可见的。这是背面散落的图像。捕获并保存图像。
接下来，获得能量分散X射线光谱或EDS数据的样品。放大纳米粒子团的高对比度区域。然后打开造型室中的第二个摄像头，然后将 EDS 降至系统中。观看相机屏幕以确保 EDS 接近，但不会触摸 BSD 或电子枪。然后打开微分析软件并获取图像。使用鼠标选择感兴趣的区域以进行进一步分析。然后显示该区域的 X 射线光谱。在这里，峰代表钛和钛，确认样品中存在金属纳米粒子。现在打开定性数据分析软件，并映射幻灯片上器官的边界。然后从菜单中选择并运行相应的协议，以创建器官的马赛克图像。这可能需要几个小时。
完成后，将其导出为 TIF 文件，并在 ImageJ 中打开该文件。调整对比度阈值以突出显示极高对比度区域，即纳米粒子。然后选择"分析粒子"，以获得器官中纳米粒子的平均数量和包含纳米粒子的器官的面积百分比。
对其他时间点和器官的剩余组织样本重复此步骤。收集所有数据后，将其编译为生物分布图。
现在，让我们分析图像以确定生物分布，并了解人体如何处理纳米粒子。首先绘制所测粒子分布作为所有分析样本的时间函数。这是30纳米大小的纳米粒子在不同小鼠器官中随时间的分布。八周后纳米粒子总体减少，表明纳米粒子从体内清除。
然而，四周后肝脏中的纳米粒子浓度增加。这表明，人体可能正在处理在这项研究中用作毒素的30纳米钛纳米粒子。也可以进行这种分析，以评估纳米粒子的大小如何影响其在体内的生物分布。改变纳米粒子的大小会影响整体细胞的接受率和间隙率。
纳米粒子和纳米载体广泛用于生物医学研究，并具有成像、诊断和治疗剂等应用。纳米粒子正在开发用于疫苗输送，以预防各种传染病，因为它们保护疫苗成分免受降解，并最大限度地增强免疫刺激。正在开发跨层交联多片囊泡（ICMV），用于诱导抗原特异性CD8阳性T细胞反应。
这些ICMV专门在小鼠淋巴结中进行局部化，以有效提供疫苗，并引起对疟疾抗原和肿瘤细胞的强效免疫反应。金属纳米粒子常用作磁共振成像中的造影剂，用于可视化组织结构和早期疾病检测功能。氧化铁纳米颗粒是有用的诊断探头。当用双磷酸盐莫伊蒂合成时，这些纳米粒子快速、有选择地积累在动脉粥样硬化斑块中，并在一小时内实现可视化，以便快速诊断。
最近，加载的纳米载体被开发为一种策略，以同时检测早期癌症和提供化疗剂。这些纳米载体被称为神经病，因为它们集成了诊断和治疗能力。
您刚刚观看了 JoVE 关于确定纳米药物载体生物分布的视频。现在，您应该了解纳米药物载体的基本原理，如何使用高分辨率 SEM 检测组织样本中的纳米载体，确定其生物分布，以及纳米粒子在生物医学工程中的一些应用。
谢谢你的收看。
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Results
下图说明了如何从图像中提取生物分布数据。纳米粒子的对比度是使用BSE探测器检测的，如图1所示。图2所示的EDS数据显示了使用BSE探测器采集的图像中钛和钛簇与高对比度区域相对应的位置。
图 1：同一区域肺的次电子图像（左）和反向散射电子图像（右）。
图 2：EDS 数据显示图像底部中间和顶部的钛和钛簇，对应于使用 BSE 探测器看到的高对比度区域。
在合成图像中，如图 3 所示，红色圆圈表示高对比度区域，并指示包含纳米粒子的位置。然后，可以计算白纳米粒子区域的体积，并计算器官本身的大小并求平均值。这提供了纳米粒子所占用面积的计算。然后，可以聚合来自多个器官的数据，以显示图像平方微米的平均粒子分布。这些数据如图 4 所示，图 4 显示了在 8 周内 30 nm 大小的纳米粒子的总体减少，表明间隙。另一需要注意的是4周后肝脏中纳米粒子浓度的增加。这提供了有关人体如何处理纳米粒子的信息，并且粒子大量迁移到肝脏表明，身体可能正在将纳米粒子作为毒素处理。这是开发和测试体内纳米粒子时需要了解的重要信息。
同样，关于不同尺寸颗粒的器官分布的数据如图5所示。此图演示了纳米粒子大小的变化如何增加纳米粒子细胞的整体摄取量或提高间隙速率。
图 3：使用 Atlas 软件创建的复合图像的各个部分。
图 4：在小鼠注射后，在肺、肝、脾、肾中生物分布30纳米纳米颗粒。
图 5：随时间变化而具有不同大小的纳米粒子的生物分布。
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Applications and Summary
纳米粒子广泛应用于生物医学工程研究，并具有成像、诊断和治疗剂等应用。例如，正在开发用于疫苗输送的纳米粒子。通过将疫苗封装在纳米颗粒中，疫苗成分可以防止降解，并刺激最大的免疫反应。
在磁共振成像应用中，金属纳米粒子常被用作造影剂，以可视化组织结构和功能。它们是检测动脉粥样硬化斑块的有用诊断探针。
结合诊断和治疗能力的纳米粒子被称为神经学。有纳米粒子同时检测早期肿瘤和提供化疗剂。
该实验演示了如何使用SEM来计算随着时间的推移注入人体的纳米粒子的生物分布。该实验可以复制在其他纳米粒子样品或细胞培养体上，这些样品或细胞培养物具有纳米粒子，用于分析纳米粒子的浓度、细胞渗透或间隙。
该演示侧重于使用 SEM 研究和测量纳米粒子的生物分布。这种测量的结果在许多领域都很重要。制药公司和研究设施可以利用这些研究进行药物开发和造影剂研究。
材料列表
| 名字 | 公司 | 目录号 | 评论 |
| 设备 | |||
| 切片（之前准备） | |||
| ImageJ 开源软件 | |||
| 横梁 SEM | 蔡司 | ||
| ATLAS 三维 SEM 软件 | 蔡司 |
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References
- Hadjikhani, Ali. "Nanofabrication and Spectroscopy of Magnetic Nanostructures Using a Focused Ion Beam." (2016).
