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Biomedical Engineering

ナノドラッグキャリアのバイオディストリビューション:SEMの応用

Overview

出典: ペイマン・シャーベイギ・ルードポシュティとシナ・シャーバズモハマディ、バイオメディカル工学部、コネチカット大学、ストールズ、コネチカット州

ナノ粒子は、標的薬物送達と制御薬物放出に向けた研究にますます用いられている。これらの粒子のほとんどは、生体適合性のために高分子粒子またはリポソーム粒子として開発されていますが、金属および磁性ナノ粒子の使用に向けた現在の研究の傾向があります。これらの金属ナノ粒子はもともとイメージングの造影剤として使用されていましたが、最近の進歩は、それらが薬物や遺伝子の送達や治療においていかに重要であるかを示しています。金、銀、常磁性ナノ粒子は、研究で最も大きなシェアを占めています。それらは良好な生体適合性を有することが示されており、特定の品種の磁性ナノ粒子はすでに開発され、治療対象薬物として配布されている。

これらの重元素は、通常、蛍光を用いて送達と分布を評価する研究用に画像化されますが、その原子重量は、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いた後方散乱電子分析におけるコントラストを高める良い資格です。).試料と電子線相互作用時に放出される特徴的なX線を用いて化学組成を同定するエネルギー分散型X線分光法も、SEMと共に使用できます。これらの方法は、EDSが画像の被写体が正しい組成であることを保証できる一方、現在の蛍光法はナノ粒子から剥離し、迅速にフェードすることができるので、解像度の向上と検出の信頼性の向上の利点を有するイメージング中。

このデモンストレーションでは、時間の経過につながった身体の器官におけるサイズ依存性金属ナノ粒子分布を調べる。物品化された臓器は、体内への粒子送達後の時間範囲で様々なサイズの粒子についてSEMで調べられます。

Principles

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医療用途におけるナノ粒子(NP)の重要性を過大評価することは困難です。薬物、薬物担体、造影剤などとして使用されています。しかし、ある種のナノ粒子を使用するためには、塗布後に各臓器に分布する方法と場所、臓器を離れるまでにかかる時間、そしてその後、身体を知る必要があります。これをバイオディストリビューションと呼びます。

ナノ粒子薬物送達のプロセスは、組織を標的とせず、代わりに体内に放出される受動薬物から、より積極的に操作された薬物の標的化から非常に正確な器官または場所まで、その複雑さは大きく異なる。ほとんどの薬や治療法は、大量の血流と大量の血管漏出を有する腫瘍における透過性と保持性(EPR効果)の向上により大きな成功を示すパッシブターゲティングを使用します。パッシブターゲティングに加えて、活性ターゲティングは、腫瘍部位特異的リガンドの付着を介してナノ粒子の処理を行うことができ、または磁性ナノ粒子に磁力を加えることによって注入後に行うことができる。この磁場は、血流から血流から血流からナノ粒子を引き出し、血流に費やす薬の時間を短縮し、患部への用量を増加させます。これらの異なる送達方法は、治療後のナノ粒子の分布に大きく影響するはずであり、この実験は、初期分布と経時間の経過に関する分布の両方を調べる目的である。

ナノ粒子分布測定の現在の方法は、通常、ナノ粒子への蛍光粒子の付着を伴う。ナノ粒子の濃度、標的領域の大きさ、蛍光の強度に応じて、半透明マウスは、生きている間に光学イメージングを使用して、粒子が正しい領域にあるかどうかを判断するために分析することができます。死後の蛍光は、マウスの異なる器官におけるナノ粒子レベルを決定するためにも使用することができる。しかし、これらの方法は、ナノ粒子の分解能を欠き、蛍光がナノ粒子から剥離していないことを肯定する。

現在のデモンストレーションでは、後方散乱電子顕微鏡(BEM)とエネルギー分散分光(EDS)ベースの分析を利用して、磁気電気ナノ粒子(MEN)の生体分布を、その大きさと時間に応じて理解します。体。試料中のMENは、注射を通じてマウス臓器に導入され、臓器を受動的に標的にしたバリウムおよびチタン磁気ナノ粒子です。マウスは意識不明にレンダリングされ、注射後1週間、4週間、8週間で臓器を取り出して保存した。臓器:肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳をマイクロトームマシンを使用して切り離し、教育ビデオ「生体試料のSEMイメージング」に記載のサンプル調製方法を用いて調製した。 走査型電子顕微鏡(SEM)のモードとして、BEMはEDS分析と共に、直径10nmの小さなナノ粒子を検出できる高分解能組成分析を提供します。一方、このデモでは、さまざまな検出器を使用して、研究設定のさまざまな要素やパーティクルを検出、確認、マッピングする方法や、異なるパラメータが結果の画像に与える影響を示すことができます。

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Procedure

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1. ナノ粒子注入と臓器収穫

  1. 麻酔化されたマウスにナノ粒子を静脈内に注入し、パッシブターゲティングを可能にします。
  2. 所望の時点で、すなわち、1、4および8週間、注射後、米国獣医学会(AVMA)ガイドラインに従ってマウスを人道的に安楽死させる。
  3. 体腔を開き、外科的に目的の器官を取り除きます。試料調製までポリプロピレン容器に10%リン酸緩衝ホルマリンに臓器を入れます。

2. 組織サンプル調製

  1. 鉗子を使用して、固定剤からリン酸緩衝生理食塩分(PBS)にマウス組織を移します。サンプルを30分間ロックし、PBSを10分ごとに交換します。
  2. ティッシュを取り出し、キムワイプで乾かします。次に、最適な切断温度化合物(OCT)を含むプラスチック金型に入れます。一晩-80°Cで保管してください。
  3. 翌日、試料をクライオスタットに移し、温度を-23°Cに設定する。
  4. 臓器タイプとナノ粒子サイズでスライドにラベルを付け、クライオスタットの棚に置きます。
  5. クリオスタットチャックをOCTで覆い、サンプルを上に置きます。サンプルの上に抽出器プランジャーを下げ、3〜5分間平衡化できるようにします。
  6. チャックを試料ホルダーに取り付け、ブレードが凍ったサンプルをまっすぐ横切ることができるように向きを決める。サンプルをブレードの近くに持って来て、粗い向きにします。厚さを30μmに設定し、均等にカットされたスライスが生成されるまでいくつかのセクションをスライスします。
  7. 断面厚さを7~8μmに減らし、微細な面に切り替えます。スライス上のラベル付きガラススライドを押して、スライスされたセクションを収集します。各スライドに 2 つのスライドを配置し、スライド ラックに保管します。室温で乾燥させます。
  8. 乾いたら、スライドラックを50%エタノールに浸して3分間脱水し、OCTを取り除きます。その後、ラックを3分間80%エタノールに移し、-20°Cで10分間、冷たいメタノールをアセトンに1:1の比率で置きます。
  9. スライドラックを取り外し、ペーパータオルで余分な溶剤を排出します。20~30分後、スライドをスライドボックスに入れ、イメージングするまで-20°Cの冷凍庫に保管します。

3. SEMおよびEDSを使用した高解像度イメージング

  1. 「生体試料のSEMイメージング」の説明に従ってサンプルを準備します。次に、サンプルを SEM に読み込みます。
  2. SEMをオンにし、作動距離を約5mmに調整し、加速電圧とビーム電流を25 keVに調整します。しかし、サンプルは導電性および保護のためにコーティングされる。
  3. イメージングを開始し、約 1,000 ~2,000 倍の倍率にズームして、ナノ粒子を含む構造を確認します。バックスキャッタ検出(BSD)がないと、一定の深さの下でそれらを区別できないことに注意してください。
  4. 同じパラメータの下に BSD を挿入し、Z 方向のステージを以前と同じ作業距離に移動します。
  5. 同じ倍率でイメージングを開始し、ナノ粒子の存在下で高コントラストが見えることを確認します。画像を保存します。
  6. 異なるBSD構成(検出器の電荷が揃う)を使用して、ナノ粒子のコントラストが最も高いものを選択します。
  7. ナノ粒子またはナノ粒子の塊を示す高コントラスト領域にズームインする。
  8. チャンバーの2番目のカメラを開き、SEMアタッチメントのダウンボタンを押してEDSをシステムに挿入する時を見ます。EDSが閉じたが、BSDまたは銃に触れなくなったら、ボタンを放します。
  9. EDSコンピュータ(まだワークステーション)でAztecプログラムを開き、SEMから画像を取得します。
  10. EDSは、その点からの特徴的なX線のスペクトルを示します。グラフ上で識別されるバリウムとチタンのピークの両方を探します。これは、あなたが見ているものは、実際にナノ粒子であり、汚染の種類ではないことを確認します。
  11. サンプルに戻り、Atlas ソフトウェアを使用してスライド上のオルガンの境界線をマッピングします。エリアのモザイク画像を作成するための「オルガン」プロトコルを選択し、それを実行させます(これはせいぜい数時間かかることがあります)。
  12. 合成イメージが作成され、ソフトウェアによってステッチされたら、Tif ファイルとして書き出します。
  13. オープンソースソフトウェアのImageJでTifファイルを開き、コントラストしきい値を調整して、非常に高いコントラスト(ナノ粒子)の領域を強調します。組み込み関数を使用して、Organ プロトコルで定義されたピクセル サイズを使用してナノ粒子の体積を定量化します (約 100 nm である必要があります)。
  14. この手順はマウス肺の1週間のサンプルのみを指しますが、この手順は他の週および他の器官からのサンプルと繰り返され、分布を示すグラフをコンパイルします。
  15. 各週の各臓器の生体分布を計算した後、生体分布グラフは、8週間の間にナノ粒子の生体分布と濃度の変化を示します。これらはピーク濃度を示し、また、ナノ粒子が器官からクリアするのにかかる時間に関する情報を提供します。

金属・磁性ナノ粒子は、薬物送達のナノキャリアとして広く使用されています。そして、組織におけるそれらの生体分布は、その治療効果と安全性を評価するために不可欠です.ナノキャリアは、サブミクロン粒子であり、通常は200ナノメートル未満に制限され、治療薬を装填することができる。そのサイズのために、彼らは体内の多くのサイトや臓器にアクセスすることができます。粒子が体内で終わる場所は、その生体分布と呼ばれ、安全性を評価し、薬物の標的化を最適化し、改善するために使用される重要なパラメータです。

本ビデオでは、標的薬物送達の基本原理について説明し、高解像度イメージング技術を用いて生体分布を評価する方法を実証する。ナノ粒子ベースのキャリアの他の用途についても議論する。

まず、ナノ粒子の基礎について話し合い、なぜ薬剤キャリアとして開発されているのかを理解しましょう。

第一に、ポリマー、リポソーム、または金属のいずれかであり得るナノスケールの粒子は、通常生体適合性であり、生体組織に有害または反応性がなく、免疫応答を引き起こさないことを意味する。しかし、ナノ毒性学の研究は、材料と粒度が体内の生物分布にどのように影響するかを理解するために行われなければなりません。

第二に、その小さなサイズは、腫瘍のような炎症部位の内皮を通して彼らの贅沢を可能にし、効率的な細胞取り込みをもたらす。がん細胞が分裂するにつれて、栄養素と酸素を供給し、腫瘍の増殖を支えるために血管供給が必要です。これらの血管は急速に形成され、したがって通常異常かつ効果的であり、内皮内層に大きな隙間を含み、漏れやすい血管系と透過性の増加をもたらす。ナノ粒子は、血流から脱出し、腫瘍の微小環境内に蓄積することができます。これは、ナノキャリアがEPR効果または強化された透過性と保持の影響として知られている現象を介してターゲット臓器に到達するパッシブターゲティングと呼ばれます。

最後に、これらのナノ粒子は、抗体やタンパク質などの特定のリガンドで機能化することができる大きな表面積を有する。活性ターゲティングにおいて、これらのリガンドは、腫瘍部位の細胞によって過剰発現される受容体を認識し、結合することができる。ナノキャリア表面上のリガンドと細胞受容体との間の特異的相互作用は、受容体媒介性エンドサイトーシスを引き起こし、細胞の取り込みを促進する。

ナノ粒子薬物送達の基本を理解した今、マウスモデルにおける金属ナノ粒子の生体分布を決定するために高解像度イメージングを用いたデモンストレーションを見てみましょう。

まず、マウスに注入されるナノ粒子を調製する。ここでは30ナノメートルのバリウムとチタン粒子を用いた。マウスが麻酔された後、尾静脈を介して静脈内にナノ粒子を注入する。1週間、4週間、8週間にわたって臓器を受動的に標的にしている間、マウスを回復させます。

適切な注入時時点で、AVMAガイドラインに従ってマウスを人道的に安楽死させる。その後、体腔を開き、脾臓、腎臓、肝臓、肺などの目的の器官を外科的に取り除きます。そして、分析するまで10%リン酸緩衝ホルマリンに臓器を保存します。

今、鉗子を使用して、固定剤からリン酸緩衝生理食塩分にマウス組織を移します。サンプルを10分ごとにPBSに交換して30分間ロックし、余分な固定剤を除去します。その後、シェーカーから組織を取り除きます。水溶性グリコールと樹脂を含む最適な切断温度化合物を標識プラスチック金型に追加します。

キムワイプでティッシュを乾かし、プラスチック型に入れます。組織を覆うOCT化合物で金型を充填し、ビニール袋に入れます。ドライアイス入ったバケツに袋をセットし、一晩マイナス80度の冷凍庫に移動します。

翌日、冷凍庫からサンプルを取り出し、クライオスタットに運ぶ間ドライアイスの上に置きます。チャンバー温度をマイナス23度に設定し、サンプルをクライオスタットに移します。セクションするサンプルの臓器タイプとナノ粒子サイズでスライドにラベルを付けます。その後、クライオスタットを活性化します。次に、OCTでクライオスタットチャックをカバーします。次に、金型からサンプルを取り出し、チャックの上に置きます。チャックを試料ホルダーに取り付け、回転を調整して、ブレードが凍ったサンプルをまっすぐ横切るように調整します。次に、サンプルをブレードに近づけ、厚さを粗い向きの 30 マイクロメートルに設定します。ハンドホイールを回転させて30マイクロメートルの厚さのセクションをスライスし、偶数のティッシュスライスがカットされるまで断面を続けます。細かい面の場合は、断面の厚さを7~8マイクロメートルに設定し、サンプルをスライスします。

スライス上のラベル付きガラススライドを押してセクションを収集します。次に、スライドをラックに追加し、室温で空気乾燥させます。乾かしたら、スライドラックを50%エタノールで3分間繰り返し浸してOCTを取り外し、ラックを80%エタノールに移し、3分間浸します。次に、ラックをアセトンに対する冷たいメタノールの1対1の比率に移動し、マイナス20°Cの冷凍庫に置きます。10分後、スライドラックを冷凍庫から取り出し、ペーパータオルで水切りします。乾いたらスライドをスライドボックスに入れ、使用するまでマイナス20°Cで保存します。

それでは、30ナノメートルのバリウムとチタン粒子を用いて1週間のポストインジェクションを採取したマウス肺組織を画像化し、その生体分布を決定してみましょう。まず、準備したスライドをSEMステージにマウントします。スパッタコートとサンプルを準備する方法については、このコレクションの前のビデオをご覧ください。その後、SEMチャンバーにステージをロードします。サンプルが視野に入ったら、サンプルを約 5 ミリメートルの作業距離に垂直に移動します。電子ビームをオンにし、二次電子の検出器を選択します。次に、ビーム加速電圧を25キロ電子ボルトに設定します。イメージングを開始するには、サンプルを約 1,000 ~ 2,000X の倍率に拡大します。この倍率では、ナノ粒子がそうでない場合でも、ナノ粒子を含む構造が見えるはずです。これをセカンダリ・イメージと呼ばれます。

次に、SEMモジュールで後方散乱電子検出モードを使用して、ナノ粒子を可視化します。ステージを Z 方向に移動して、上記と同じ 5 ミリメートルの作業距離を実現します。バックスキャッタ検出器の構成を調整し、画像が鮮明になるまで検出パネルに異なる電圧バイアスを使用します。高コントラストの領域、ナノ粒子が、今すぐ見えるはずです。これは後方散乱画像です。イメージをキャプチャして保存します。

次に、試料のエネルギー分散型X線分光法またはEDSデータを達成する。ナノ粒子の塊の高コントラスト領域を拡大します。次に、チャンバー内の 2 番目のカメラを開き、EDS をシステムに下げます。カメラの画面を見て、EDS が近づくことを確認しますが、BSD や電子銃には触れません。次に、マイクロ分析ソフトウェアを開き、画像を取得します。マウスを使用して、詳細な分析のために関心のある領域を選択します。その領域の X 線スペクトルが表示されます。ここでピークは、試料中の金属ナノ粒子の存在を確認するバリウム及びチタンを表す。今、定性的なデータ分析ソフトウェアを開き、スライド上の臓器の境界線をマップします。次に、メニューから適切なプロトコルを選択して実行し、オルガンのモザイク画像を作成します。この場合、数時間かかる場合があります。

完了したら、TIF ファイルとしてエクスポートし、ImageJ でファイルを開きます。コントラストしきい値を調整して、非常に高いコントラストの領域であるナノパーティクルをハイライトします。次に、[パーティクルの分析] を選択して、臓器内のナノ粒子の平均数とナノ粒子を含む臓器の面積パーセンテージを取得します。

他の時点および器官からの残りの組織サンプルについて、この手順のすべてのステップを繰り返します。すべてのデータが収集されたら、それを生体分布グラフにコンパイルします。

次に、画像を分析して生物分布を決定し、体がナノ粒子をどのように処理したかを学びましょう。まず、分析されたすべてのサンプルの時間関数として測定された粒子分布をプロットします。これは、時間の経過に従って様々なマウス器官における30ナノメートルサイズのナノ粒子の分布です。8週間後のナノ粒子の全体的な減少は、体内からのナノ粒子のクリアランスを示す。

しかし、4週間後に肝臓にナノ粒子濃度が上昇する。これは、体が毒素としてこの研究で使用される30ナノメートルのバリウムとチタンナノ粒子を処理している可能性があることを示唆しています。この分析は、ナノ粒子の大きさが体内の生体分布にどのような影響を与えるかを評価するためにも行うことができる。ナノ粒子のサイズを変更すると、全体的な細胞の取り込み速度とクリアランス率に影響を与えました。

ナノ粒子やナノキャリアは、生物医学研究で広く使用されており、イメージング、診断、治療薬としての応用があります。ナノ粒子は、ワクチン成分を劣化から守り、免疫刺激を最大化するため、多種多様な感染症に対するワクチン送達に用いるために開発されています。二層間架橋多層小胞、またはICmVは、抗原特異的CD8陽性T細胞応答の誘導のために開発されている。

これらのICMVは、効率的なワクチン送達のためにマウスのリンパ節に特異的に局在し、マラリア抗原および腫瘍細胞に対する堅牢な免疫応答を引き起こしている。金属ナノ粒子は、磁気共鳴画像の造影剤として多く用いられ、組織の構造を可視化し、早期疾患検出に機能します。酸化鉄ナノ粒子は有用な診断プローブである。ビスホスホネート部分で合成すると、これらのナノ粒子はアテローム硬化性プラークに迅速かつ選択的に蓄積し、迅速な診断のために1時間以内にその可視化を可能にする。

近年、積載ナノキャリアは、早期癌を同時に検出し、化学療法剤を送出する戦略として開発されている。これらのナノキャリアは、診断能力と治療能力を統合するため、トラノスティックスと呼ばれています。

あなたはちょうどナノドラッグキャリアの生体分布を決定するJoVEのビデオを見ました。ナノドラッグキャリアの基本原理、高解像度SEMを用いて組織サンプル中のナノキャリアを検出する方法、その生体分布を決定する方法、および生物医学工学におけるナノ粒子のいくつかの応用を知る必要があります。

見てくれてありがとう。

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Results

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次の画像は、画像から生物分布データを抽出する方法を示しています。ナノ粒子のコントラストは、図1に示すようにBSE検出器を使用して検出されます。図2に示すEDSデータは、チタンとバリウムのクラスターがBSE検出器を使用して収集された画像の高コントラストの領域に対応する場所を示しています。

Figure 1
図 1:肺の二次電子像(左)と同一領域の後方散乱電子像(右)。

Figure 2
図 2:EDSデータは、画像の下中央と上部にチタンとバリウムのクラスターを示し、BSE検出器を用いて見られる高コントラストの領域に対応する。

合成画像では、図 3 に示すように、赤い円はコントラストの高い領域を示し、ナノ粒子を含む位置を示唆しています。白いナノ粒子領域の体積は、臓器自体のサイズにわたって計算され、平均化することができます。これは、ナノ粒子が占める面積の計算を提供する。次いで、数週間にわたる複数の器官からのデータを凝集して、画像の正方形ミクロンで平均粒子分布を示すことができる。これらのデータは図4に示され、8週間の間に30nmサイズのナノ粒子の全体的な減少を示し、クリアランスを示す。もう一つ注意すべきことは、4週間後の肝臓におけるナノ粒子濃度の上昇である。これは、体がナノ粒子を処理する方法に関する情報を提供し、肝臓への粒子の大きな移動は、体が毒素としてナノ粒子を処理している可能性があることを示しています。これは、生体内でナノ粒子を開発し、テストする際に知っておくべき重要な情報です。

同様に、様々なサイズの粒子の臓器分布に関するデータを図5に示す。このグラフは、ナノ粒子のサイズの変化によって、ナノ粒子の細胞への全体的な取り込みを増やしたり、クリアランスの速度を上げたりする方法を示しています。

Figure 3
図 3:アトラスソフトウェアを使用して作成された合成イメージのセクション。

Figure 4
図 4:マウス注射後の肺、肝臓、脾臓、腎臓における30nmナノ粒子の生体分布。

Figure 5
図 5:時間の経過と共に様々なサイズのナノ粒子の生体分布。

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Applications and Summary

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ナノ粒子は生物医学工学研究に広く用いられ、イメージング、診断、治療薬としての応用が多い。例えば、ナノ粒子はワクチン送達に用いられ、開発されている。ワクチンをナノ粒子に封入することにより、ワクチン成分は分解から保護され、最大の免疫応答を刺激します。

磁気共鳴イメージングアプリケーションでは、金属ナノ粒子が組織の構造や機能を可視化する造影剤として用いられることが多い。それらは、アロセローム硬化性プラークの検出に有用な診断プローブである。

診断能力と治療能力を統合するナノ粒子は、セラノスティックスと呼ばれます。ナノ粒子は同時に初期段階の腫瘍を検出し、化学療法剤を提供する。

この実験では、SEMを使用して体内に注入されたナノ粒子の生体分布を時間の経過とともに計算する方法を実証した。この実験は、ナノ粒子を有する他のナノ粒子サンプルまたは細胞培養物上で、ナノ粒子の濃度、細胞浸透、またはクリアランスを分析する方法として複製することができる。

このデモンストレーションでは、SEMを用いたナノ粒子の生体分布の研究と測定に焦点を当てた。このような測定の結果は、多くの分野で重要な場合があります。製薬会社や研究施設は、医薬品開発や造影剤の研究にこれらの研究を利用することができます。

材料一覧

名前 会社 カタログ番号 コメント
機器
セクションスライス(前に準備)
ImageJオープンソースソフトウェア
クロスビームSEM ツァイス
ATLAS 3-D SEMソフトウェア ツァイス

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References

  1. Hadjikhani, Ali. "Nanofabrication and Spectroscopy of Magnetic Nanostructures Using a Focused Ion Beam." (2016).
ナノドラッグキャリアのバイオディストリビューション:SEMの応用
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