Overview
资料来源：佩曼·沙贝吉-鲁德波什蒂和西娜·沙赫巴兹莫哈马迪，康涅狄格大学生物医学工程系，康涅狄格州斯托尔斯
扫描电子显微镜（SEM）是一种使用电子束进行无损成像和在真空中描述导电材料的仪器。打个比方，电子束是到SEM的，光是光学显微镜的。区别在于电子显微镜产生更高的分辨率和放大倍率的图像。最好的光学显微镜的分辨率通常低于 200 nm，而 SEM 通常要求分辨率为 0.5 nm。这是因为光学显微镜受到波衍射的限制，波的波长函数为可见光约500nm。相反，SEM 使用带电的电子束，其波长为 1 nm。这一特性使它们成为研究纳米和微观结构的可靠工具。电子显微镜还能够研究特征尺寸太小的生物样品，不适合光学显微镜。
本演示介绍了使用扫描电子显微镜制备生物样品和初始图像采集的介绍。在这种情况下，将研究胶原蛋白-羟基磷灰石（HA）细胞支架。SEM 的真空环境和电子束对非导电样品（如有机物）的诱导充电，给制备带来了挑战。还将讨论不同成像方法在分辨率、焦点深度和样本类型方面的优缺点。本演示的目的是向学员提供有关 SEM 的更多信息，以确定此显微镜模块是否适合某种类型的生物样品。
Principles
当高能电子束（通常从 5-30 keV 之间）击中样品时，从样品中发出一系列信号。这些相互作用可用于研究地形、晶体学、电势和局部磁场。电子经历两种类型的散射：弹性和非弹性。无弹性散射导致次电子的发射。这些低能电子（+50 eV）是样品原子的外壳电子，它们获得的能量刚好足以离开原子表面。二次电子的散射提供了地形信息，因为离开样品原子的电子的能量水平不够高，无法穿过样品。因此，探测器只收集表面水平信息。
另一方面，弹性散射不是由从样品原子中脱落的电子引起的。它是与原子核相互作用后的主要电子束，如图1所示。这些电子不会改变它们的能量或速度，但它们确实会根据它们与原子核的相互作用而改变它们的方向。这些电子的检测提供了组合信息，它们与不同原子的原子相互作用时的不同对比度允许用户分辨出样本组成的差异。在生物样品中，这可用于研究嵌入或附着的纳米粒子和具有较重原子重量的纳米结构，如金或铁。
图1：原子与主电子（PE）的相互作用，以及它们如何产生不同的信号。
样品制备是一个重要的过程，特别是对于生物样品。为了获得高分辨率SEM图像，电子需要到达样品。然后，电子和样品相互作用的结果信号需要到达探测器。这意味着仪器必须在高真空下工作，以防止在光束到达样品和信号到达探测器之前电子散射。此真空高度敏感，可以从样品中拉出颗粒物，这意味着确保样品干燥且无颗粒非常重要。
样品制备的另一个考虑因素是电子束的性质。由于光束由高电荷粒子组成，当非导电样品受到来自电子束的高电荷粒子的轰击时，表面的电荷会积聚，影响电子束的偏转，并导致光束散射的增加。通过在成像前将样品涂上导电层，可以避免图像中的这些充电伪影。
此处描述的方法适用于大多数非导电材料。涂层是减少充电伪影所必需的。胶原蛋白-HA细胞支架由以下合成步骤制成：将胶原蛋白与HA共同沉淀到复合凝胶中，产生泥浆和冷冻铸造，将支架交联，最终干燥。最终干燥在真空干燥机中完成5天，并充分干燥样品进行SEM分析，而不影响脚手架的结构特性。然而，当成像细胞时，制备样品时主要关心的是保存细胞结构。化学和树脂基的固定方法通常用于观察细胞，同时保留细胞的结构，如谷醛固定和环氧树脂和丙烯酸树脂。通常，谷醛被用作固定剂，在细胞细胞质中产生交叉联系，但也会导致pH率下降。因此，在制备含有谷醛的样品时需要缓冲。这些技术的加入使得细胞的结构在存在时最类似于它的结构[3]。
图 2：显示样品室（顶部的银容器）和真空（左）和电流（右）仪表的金铂溅射涂层。在此模型中，电流为 2 mA，用于室真空 0.1 torr，该真空使用 argon 泄漏阀保持不变。
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Procedure
1. 样品制备
- 处理样品时，请戴上手套并采取预防措施，避免污染。
- 确保幻灯片上的样品干燥且样品没有污染。这是因为 SEM 测量表面表征，并且这些缺陷会严重阻碍信号。
- 如果样品装载在标准玻璃玻片上，则通过用钻石尖玻璃切割器以直线对滑轨进行评分，并轻轻地将评分线从身体推开，直到玻璃断裂，从而减小样品的大小。
- 根据样品的不同，选择一种没有相同元素成分的涂层（这将阻碍EDS接收的信号）。在本演示中，使用金铂涂层。
- 按照指示使用溅射涂布器。让机器将样品溅射约 40 s，以进行具有足够覆盖的薄涂层。
- 使用导电双面碳胶带将样品安装到 SEM 存根上。如果此胶带安装在非导电滑轨上，则该胶带还应从舞台放置到滑动的顶部，该磁带被溅射，以接地样品。一层薄薄的导电银漆也可以用来提高样品的导电性到阶段。
- 将存根安装到舞台上，并拧紧侧面的螺钉。
2. 成像程序
- 将舞台加载到造型室中。关上门并封住门。然后点击"转移"按钮，打开从装载室到真空的通道。
- 一旦转移按钮停止闪烁且内部门打开，可以通过拧入金属棒并将样品推入造型室将样品移入真空室。
- 拧下杆，缩回，将杆完全固定到负载室中，然后按"存储"关闭真空室的负载室。现在加载了示例，其余过程从计算机工作站进行。
- 使用控制器移动舞台，并打开舞台导航面板，直到它位于您的视野中。
- 垂直移动样品，直到工作距离为 5-10 mm。在 z 方向移动舞台时，打开造型室摄像机，以确保样品不会靠近电子枪。
- 打开超高张力 （EHT） 光束。请注意，如果列已关闭一段时间，则可能需要打开该列。
- 从探测器选项中选择 SE2 信号。
- 使用大约 5 kV 的 kV 设置进行初始成像，然后使用反向散射模式增加到 20-30 kV 以提供更多信号。如果样品没有涂覆，请保持 keV 低，以防止图像中的充电伪影过多，并防止样品损坏。
- 如果没有清晰的图像，请转动对焦、亮度和对比度旋钮，直到结构可见。这将是一个改进的参考。
- 在粗模式下转动对焦旋钮，直到图像可见。然后切换到精细，以找到最佳焦点。
- 使用舞台导航（不在 z 方向）和放大倍率来查找要从中保存图像的区域。
- 降低扫描速度并打开线平均，以获得更好的图像以保存。
- 通过右键单击并保存到文件位置来保存图像。
- 插入 BSD 并将舞台移回样品聚焦的 z 位置。
- 重复步骤 8-11，同时查找指示较高原子数的对比度区域。
- 完成后，请删除 BSD。
- 准备好删除样品时，按下按钮"交换"。
- 将样品移回负载室，然后点击"存储"，然后"通风"。
扫描电子显微镜（SEM）通常用于在纳米尺度上成像生物材料。光学显微镜使用光来成像样品，大量用于非破坏性图像生物样品，然而，其分辨率和景深是有限的，因此使用SEM来达到更高的分辨率到一纳米。
在SEM中，一束电子通过一系列冷凝器透镜聚焦，然后击中样品。当光束击中样品时，表面的电子被探测器散射并测量。
在本视频中，我们将讨论 SEM 的工作原理，演示如何在实验室中成像生物样本，最后介绍一些用于图像敏感样品的技术。
扫描电子显微镜使用高能电子束，由装有灯丝阴极的电子枪产生。生成的电子被推进到阳极，然后在进入物镜之前使用冷凝器透镜聚焦。对物镜进行校准，将光束聚焦在样品上，在样品表面扫描光栅。电子与样品中原子的相互作用用于研究样品的地形、元素组成和结晶度。当事件电子束撞击表面时，它发出二次和背散射电子。二次电子是从靠近表面的样品中发射的低能电子，提供地形信息。
另一方面，背散射电子被反射到事件光束的相反方向上。交互强度随原子量的增加而增加，使用户能够区分组成差异。需要特别考虑使用 SEM 对生物样品进行成像，因为 SEM 利用高真空，因此通常含水量高的生物样品必须首先干燥。这可能导致敏感样品的结构崩溃，尤其是细胞。因此，细胞用固定剂处理，冲洗，然后缓慢脱水，通过洗涤与增加的乙醇量。
对于刚性生物材料，如本演示中使用的胶原蛋白-羟基磷灰石组织支架，样品在高真空下干燥数天。
最后，由于典型的 SEM 成像需要导电表面，因此生物样品在成像前通常会溅射涂上一层薄薄的金属。现在，我们已经讨论了 SEM 的工作原理以及如何准备用于成像的生物样本，让我们来看看如何准备和成像胶原蛋白-羟基磷灰石组织支架。
首先，使用导电碳胶带将生物材料样品安装到 SEM 存根上，并确保样品干燥且表面无污染。
然后，将安装的样品放入溅射涂层的腔室中，泵下腔室，并溅射覆盖样品约40秒，以达到一个薄，四至六纳米厚的金属涂层，在这种情况下，黄金，具有足够的覆盖。涂覆后，取出样品并使用导电胶带将存根连接到样品顶部，该根根现在涂有导电金属。
最后，将存根安装在 SEM 台上，并拧紧侧面的螺钉。现在，该示例已准备好使用 SEM 进行映像。首先，将舞台装载到 SEM 造型室并密封门，然后按下转移按钮打开从装载室到真空通道的通道。打开内门后，将金属棒拧入舞台，将样品推入真空室，然后拧下金属杆并将其完全缩回装载室，然后按压存储以关闭真空室。
现在，让我们使用 SEM 对示例进行映像。
首先，使用控制器移动舞台，将样品导航到视野中，然后垂直移动样品，直到工作距离为 5 到 10 毫米。打开电子束并选择二次电子的探测器，将光束最初设置为 5 千电子伏特，然后根据需要增加到 20 到 30 千电子伏特。如果图像不清楚，请转动对焦、亮度和对比度旋钮，直到显示清晰的图像。
使用舞台导航和 X 和 Y 方向在样品上定位新点，然后增加放大倍率，直到所需要素可见。根据需要调整对焦、对比度和亮度，以提高图像质量。您可能需要降低扫描速度并打开平均线以获得更好的图像，然后保存图像。
SEM 图像显示了高度三维和多孔结构，纤维特征小于 25 微米。这些特征很难使用光学显微镜进行可视化，因为光学显微镜的景深要低得多。
与SEM的生物结构成像相关的许多挑战，包括结构坍塌或高能电子束的损坏。现在，让我们来看看一般 SEM 技术如何应用于这些类型的敏感样本。精细的生物结构，如这些年轻的植物组织，或那些高含水量，必须通过修复过程，在成像之前处理。
这些花纹立即用新鲜制备的正式林/醋酸固定溶液进行治疗。固定组织在乙醇中解剖，放入网状容器中，并通过乙醇系列70%、80%、90%和100%乙醇脱水。最后，使用关键点干燥机干燥植物组织，安装并涂上薄金属涂层的溅射。
在 SEM 成像后，很明显，未经处理的结构燥过程严重损坏，结构出现相当大的坍塌，而固定结构则保持其原生结构。或者，可以使用环境 SEM 或 ESEM 对细胞和其他高含水量的样本进行成像。ESEM 利用在样品上扫描的栅格的高能电子束，与传统的 SEM 一样，通过保持腔室内的气态环境，实现湿或无涂层样品的成像。
这是通过使用两个孔孔将包含电子枪的高真空室从试样室中分离出来来实现的。电子束确实由于气体分子的散射而蒙受重大损失，但通常是成像的高能量。在这里，细胞生长在硅芯片上，用量子点功能化，并使用谷醛固定协议固定。细胞在水中成像，并显示细胞的未折叠结构，在细胞表面可见单个量子点。
您刚刚观看了 JoVE 关于使用 SEM 可视化生物材料的介绍。您现在应该了解 SEM 的工作原理、生物样品的制备和成像方式，以及该技术在敏感结构上的一些应用。
感谢您的收看！
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Results
图 3 和图 4 中的 SEM 图像显示，图像结构具有高度三维和微尺度特征。图像质量受溅射涂层的对焦和厚度影响。
图 3：下图演示了示例焦点如何影响图像质量。 在右侧的图像中，整个视场处于焦点，而焦点在左侧。使用焦点等参数可以提供更好的图像。
图4：胶原蛋白-羟基磷灰石样品图像。
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Applications and Summary
在这里，我们演示了电子显微镜的聚焦深度、视野、最大分辨率和放大倍率，以及如何使用这些特性来查看生物样品。此演示旨在帮助查看者确定哪种显微镜模块最适合特定应用。如所示，SEM 具有非常高的对焦深度、更高的分辨率和更大的放大倍率。但是，它并不适合所有示例类型。
本演示介绍了电子显微镜的原理，并展示了其在研究实验室中的几个应用。电子显微镜用于检测、表征和质量控制。例如，它们用于可视化IC、电路板、裂纹传播和纳米机电系统。在生物学领域，这些仪器也发挥着关键作用。甚至还有专为容纳湿生物样品而设计的电子显微镜。这些生物样本从组织到骨骼、细胞和微生物。使用额外的探测器可以进行更多的分析，例如精确的表面分析。
材料列表
| 名字 | 公司 | 目录号 | 评论 |
| 设备 | |||
| 生物样品 | |||
| 碳或金涂层 | |||
| 横梁-SEM | 蔡司 | ||
| 胶原蛋白-羟基胃口细胞支架 | 由康涅狄格大学魏实验室开发 |
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References
- Oatley, C. W., W. C. Nixon, and R. F. W. Pease. "Scanning electron microscopy." Advances in Electronics and Electron Physics 21 (1966): 181-247.
- Goldstein, Joseph, et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis: a text for biologists, materials scientists, and geologists. Springer Science & Business Media, 2012.
- Carol Heckman, et al. Preparation of cultural cells for scanning electron microscope. Nature Protocols Network, 2007, doi:10.1038/nprot.2007.504
