Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biomedical Engineering

生体試料のSEMイメージング

Overview

出典:ペイマン・シャーベイギ・ルードポシュティとシナ・シャーバズモハマディ、バイオメディカル工学部、コネチカット大学、ストールズ、コネチカット州

走査型電子顕微鏡(SEM)は、電子線を利用して非破壊画像を作成し、真空中の導電性材料を特徴付ける器具です。たとえ例として、電子ビームは光学顕微鏡に光が当たるようにSEMに対する。違いは、電子顕微鏡がはるかに高い解像度と倍率の画像を生成することです。最良の光学顕微鏡は通常200nmまでの分解能を有し、SEは通常0.5 nmの分解能を主張する。これは、光学顕微鏡が波の回折によって制限されるという事実によるもので、波長の関数であり、可視光に対しては約500nmである。逆に、SEMは1nmの波長として通電電子ビームを使用する。この特性は、ナノおよび微細構造の研究のための非常に信頼できるツールになります。電子顕微鏡はまた光学顕微鏡のために小さすぎる特徴のサイズの生物学的サンプルの研究を可能にする。

このデモでは、走査型電子顕微鏡を用いた生体試料のサンプル調製および初期画像取得について説明します。この場合、コラーゲン-ヒドロキシアパタイト(HA)細胞足場が研究される。SEMの真空環境と非導電性試料(有機物など)上の電子線による誘導充電は、調製において対処される課題を生み出します。解像度、焦点深度、サンプルタイプに関連するさまざまなイメージング方法の長所と短所についても説明します。このデモンストレーションの目的は、この顕微鏡モジュールが生物学的サンプルの一種に最適かどうかを判断するために、参加者にSEMに関する詳細情報を提供することです。

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

高エネルギー電子ビーム(通常は5~30keV)がサンプルに当たると、サンプルから一連の信号が放出されます。これらの相互作用は、地形、結晶学、電位および局所磁場を研究するために使用することができます。電子は、弾性と非弾性の2種類の散乱を受ける。非弾性散乱は二次電子の放出を引き起こす。これらの低エネルギー電子(〜50eV)は、原子の表面を離れるのに十分なエネルギーを獲得する試料原子の外殻電子です。二次電子の散乱は、試料原子から出る電子のエネルギーレベルがサンプルを通過するのに十分な高さではないため、地形情報を提供します。したがって、検出器によって収集されるのは表面レベル情報のみです。

一方、弾性散乱は、試料原子からの電子の外れによって引き起こされるものではない。これは、図1に示すように、核との相互作用後の電子の主なビームです。これらの電子はエネルギーや速度を変えるのではなく、核との相互作用に基づいて方向を変えます。これらの電子の検出は、組成情報を提供し、異なる原子量の原子との相互作用時にその異なるコントラストは、ユーザーがサンプル組成の違いを区別することを可能にする。生物学的サンプルでは、金や鉄などの原子重量の重いナノ粒子やナノ構造を埋め込んだり取り付けたりする研究に使用できます。

Figure 1
図1:主電子(PE)との原子相互作用と、それらが異なる信号を作り出す方法

サンプル調製は、特に生体試料にとって重要な手順です。高解像度のSEM画像を得るためには、電子がサンプルに到達する必要があります。そして、電子と試料との相互作用の結果である信号は、検出器に到達する必要があります。これは、ビームがサンプルに到達し、信号が検出器に到達する前に電子散乱を防ぐために、高真空下で動作する必要があることを意味します。この真空は非常に敏感であり、サンプルから粒子状物質を引き出すことができるので、サンプルが乾燥し、粒子が含まれないようにすることが重要です。

試料調製におけるもう一つの考慮事項は、電子線の性質である。ビームは高荷電粒子で構成されているため、非導電性試料が電子線から高荷電粒子を照射すると、電子線のたわみに影響を与え、大きな電荷が発生するビーム散乱の増加。撮像前に導電層で試料をコーティングすることにより、画像中のこれらの充電アーティファクトを回避することができる。

ここで説明する方法は、ほとんどの非導電性材料に適用可能です。コーティングは、充電アーティファクトを軽減するために必要です。コラーゲンHA細胞足場は、以下の合成ステップによって作られた:複合ゲルへのHAとのコラーゲンの共沈殿、スラリーの作成および凍結鋳造、足場および最終乾燥を架橋する。この最終乾燥は真空乾燥機で5日間にわたって完了し、足場の構造特性に影響を与えることなく、SEM分析用のサンプルを十分に乾燥させます。しかしながら、細胞をイメージングする際には、試料を調製する際の主な関心事は、細胞構造を保持することだ。化学的および樹脂ベースの固定方法は、グルタルアルデヒド固定やエポキシ樹脂、アクリル樹脂などの細胞の構造を維持しながら細胞を観察するために一般的に使用されます。典型的には、グルタルアルデヒドは、細胞の細胞質に架橋を作成するが、pHの低下を引き起こす固定剤として使用される。したがって、グルタルアルデヒドを使用してサンプルを調製する際には緩衝が必要です。これらの技術の追加により、細胞の構造は、それが生きていたときに、その構造に最も似ています[3]。

Figure 2
図2:試料チャンバー(上の銀容器)と真空(左)および電流(右)ゲージを示す金パラジウムスパッタコーター。このモデルでは、アルゴンリークバルブを使用して一定に保たれる0.1トルのチャンバ真空で2 mAの電流を使用します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. サンプル調製

  1. 手袋を着用し、サンプルを取り扱う際の汚染を避けるため、予防措置を講じてください。
  2. スライド上のサンプルが乾燥しており、サンプルに汚染がないことを確認します。これは、SEMが表面特性評価を測定し、これらの欠陥が信号を著しく妨げる可能性があるためです。
  3. サンプルが標準的なガラススライドにロードされている場合は、ダイヤモンドチップガラスカッターでスライドを直線でスコアリングし、スコア付けされたラインをガラスが折れるまでゆっくりと押し出して、サンプルのサイズを小さくします。
  4. サンプルに応じて、同じ元素組成を持たないコーティングを選択します(EDSが受信する信号を妨げる)。このデモンストレーションでは、金パラジウムコーティングを使用します。
  5. 指示に通じてスパッタコーターを使用します。機械は十分なカバレッジの薄いコーティングのために約40sのためのサンプルをスパッタにしてみましょう。
  6. 導電性両面カーボンテープを使用して、サンプルをSEMスタブに取り付けます。このテープは、非導電性スライドに取り付けられている場合は、サンプルを接地するためにスパッタリングされたスライドのステージから上部に配置する必要があります。導電性銀塗料の薄層は、サンプルのステージへの導電性を高めるためにも使用できます。
  7. スタブをステージに取り付け、側面のネジを締めます。

2. イメージング手順

  1. ステージをチャンバーにロードします。ドアを閉めて封印しなさい。その後、「転送」ボタンを押して、ローディングチャンバから真空への通路を開きます。
  2. 転写ボタンが点滅を停止し、内部ドアが開いたら、サンプルを金属棒でねじ込み、サンプルをチャンバーに押し込むことで真空チャンバーに移動できます。
  3. ロッドを外し、ロッドを引き込んでロードチャンバーに完全に固定し、「保管」を押して真空チャンバーから負荷チャンバーを閉じます。サンプルが読み込まれ、残りのプロセスはコンピュータ ワークステーションから実行されます。
  4. コントローラーを使用してステージを移動し、ステージ・ナビゲーション・パネルを視野に入れるまで開きます。
  5. 作動距離が5-10ミリメートルになるまで、サンプルを垂直に動かします。ステージをZ方向に動かす場合は、チャンバーカメラをオンにして、サンプルが電子銃に近づくことを確認します。
  6. 余分な高張力(EHT)ビームをオンにします。しばらくオフになっている場合は、列を開く必要がある場合もあります。
  7. 検出器オプションからSE2信号を選択します。
  8. 初期イメージングには約5kVのkV設定を使用し、バックスキャッタモードを使用してより多くの信号を求めて20~30kVまで増やします。サンプルがコーティングされていない場合は、画像内の充電アーティファクトが多くなりすぎないようにし、サンプルの損傷を防ぐために keV を低く保ちます。
  9. 鮮明な画像がない場合は、構造が見えるまでフォーカス、明るさ、コントラストノブを回します。これは、絞り込みの参照になります。
  10. 画像が表示されるまで、粗いモードでフォーカスノブを回します。その後、最高の焦点を見つけるために罰金に切り替えます。
  11. ステージナビゲーション(Z 方向ではない)と倍率を使用して、画像を保存する領域を検索します。
  12. スキャン速度を下げ、ライン平均をオンにして、保存のためのより良い画像を取得します。
  13. 右クリックしてファイルの場所に保存して、イメージを保存します。
  14. BSD を挿入し、サンプルがフォーカスされている Z 位置にステージを戻します。
  15. より高い原子番号を示すコントラストの領域を探しながら、手順 8 ~ 11 を繰り返します。
  16. 完了したら、BSD を取り外します。
  17. サンプルを削除する準備ができたら、ボタン「交換」を押します。
  18. サンプルをロードチャンバーに戻し、「ストア」を押してから「ベント」を押します。

走査型電子顕微鏡、またはSEMは、ナノスケールで生体材料を画像化するためにしばしば使用される。光を用いて試料を画像化する光学顕微鏡は、非破壊的な画像生物学的試料に多く用いられているが、その分解能や被写界深度は限られており、1ナノメートルまで高解像度を実現するためにSEMが用いられる。

SEMでは、電子のビームが一連のコンデンサーレンズを通して集束され、サンプルに当たります。ビームがサンプルに当たると、表面の電子が散乱し、検出器によって測定されます。

このビデオでは、SEMの仕組みについて説明し、実験室で生体試料を画像化する方法を示し、最後に、敏感なサンプルを画像化するために使用されるいくつかの技術を紹介します。

走査型電子顕微鏡は、フィラメントカソードを装着した電子銃によって生成される高エネルギー電子ビームを使用しています。生成された電子は陽極に向かって推進され、次いで、対物レンズに入る前に凝縮器レンズを使用して焦点を合わせられます。対物レンズは、サンプルにビームを焦点を合わせるようにキャリブレーションされ、そこでサーフェス全体でラスタースキャンされます。試料中の原子と電子の相互作用は、サンプルの地形、元素組成、および結晶性を研究するために使用されます。入射電子線が表面に当たると、二次電子と後方散乱電子が放出されます。二次電子は、表面に近いサンプルから放出される低エネルギー電子であり、地形情報を提供します。

一方、後方散乱電子は、入射ビームの反対方向に反射します。相互作用強度は原子量の増加に伴って増加し、ユーザーは組成の違いを区別できます。SEMは高真空を利用するので、SEMを用いた生体試料を画像化するには特別な配慮が必要であり、したがって、通常は含水率の高い生体試料を最初に乾燥させる必要がある。これは、敏感なサンプル、特に細胞の構造の崩壊を引き起こす可能性があります。したがって、細胞は固定剤で処理され、すす、次いで、エタノールの量を増やして洗浄することによってゆっくりと脱水される。

このデモンストレーションで用いたコラーゲン-ヒドロキシアパタイト組織足場のような硬質な生物学的材料の場合、試料は高真空下で数日間にわたって乾燥される。

最後に、典型的なSEMイメージングは導電性表面を必要とするため、生物学的試料は、イメージングの前に金属の薄層で被覆されることが多い。SEMの仕組みとイメージング用の生体試料の調製方法について説明した所で、コラーゲン-ヒドロキシアパタイト組織足場を調製して画像化する方法を見てみましょう。

まず、導電性カーボンテープを使用して生体材料サンプルをSEMスタブに取り付け、試料が乾燥し、表面に汚染がないことを確認します。

次いで、スパッタコーターのチャンバーに取り付けられたサンプルを置き、チャンバーをポンプで下ろし、スパッタコートを約40秒間コーティングして、金属の薄い4〜6ナノメートルの厚さのコーティングを達成し、この場合は金で十分なカバレッジを有する。コーティングしたら、サンプルを取り出し、導電性テープを使用してサンプルの上部にスタブを接続し、現在は導電性金属でコーティングされています。

最後に、SEMステージにスタブを取り付け、側面のネジを締めます。これで、サンプルを SEM でイメージする準備ができました。まず、ステージをSEMチャンバーにロードし、ドアを密封してから、搬送ボタンを押してローディングチャンバーから真空への通路を開きます。内部ドアが開いたら、金属棒をステージにねじ込み、サンプルを真空チャンバーに押し込み、金属棒を外してロードチャンバーに完全に引き込み、店舗を押して真空チャンバを閉じます。

次に、SEM を使用してサンプルをイメージしてみましょう。

まず、コントローラーを使用してステージを移動し、サンプルを視野内に移動してから、作業距離が 5 ~ 10 ミリメートルになるまでサンプルを垂直方向に移動します。電子ビームをオンにして二次電子の検出器を選択し、ビームを最初に5キロ電子ボルトに設定し、必要に応じて最大20~30キロ電子ボルトまで増加させます。画像が鮮明でない場合は、鮮明な画像が表示されるまで、フォーカス、明るさ、コントラストノブを回します。

ステージナビゲーションと X 方向と Y 方向を使用してサンプル上の新しいスポットを見つけ、目的のフィーチャが表示されるまで倍率を上げます。必要に応じてフォーカス、コントラスト、明るさを調整して、画質を向上させます。より良い画像を取得するには、スキャン速度を下げ、ライン平均をオンにしてから画像を保存する必要がある場合があります。

SEM画像は、25ミクロン未満の繊維状の特徴を有する非常に立体的で多孔性の構造を明らかにする。光学顕微鏡の被写界深度がはるかに低いため、光学顕微鏡を使用して視覚化することは困難です。

SEMによる生物構造のイメージングには、高エネルギー電子ビームによる構造崩壊や損傷など、多くの課題があります。次に、一般的な SEM 手法がこれらの種類の機密性の高いサンプルにどのように適用されるかを見てみましょう。これらの若い植物組織のような繊細な生物学的構造、または含水率の高い組織は、イメージングの前に固定プロセスを介して治療されなければならない。

これらの花のメリステムは、すぐに調製したホルマリン/酢酸固定溶液で処理した。固定組織をエタノールで解剖し、メッシュ容器に入れ、70%、80%、90%、100%エタノールのエタノールシリーズを通して脱水した。最後に、植物組織を臨界点乾燥機を用いて乾燥し、取り付け、薄い金属コーティングで覆われたスパッタを取り付けた。

SEMイメージングの後、未処理の構造物が乾燥プロセスによって大きく損傷し、構造が大幅に崩壊し、固定されたものが本来の構造を維持していたことは明らかです。あるいは、細胞および他の高水分含有量の検体は、環境SEM、またはESEMを用いて画像化することができる。ESEMは、従来のSEMと同様に、サンプル上でラスタースキャンされる高エネルギー電子ビームを利用しますが、チャンバ内の気体環境を維持することにより、湿潤または未コーティングサンプルのイメージングを可能にします。

これは、電子銃を含む高真空チャンバーを2つの開口部を用いて検体室から分離することによって行われる。電子ビームは、気体分子による散乱による大きな損失を引き起けますが、通常、イメージングに十分なエネルギーです。ここで、細胞をシリコンチップ上で増殖させ、量子ドットで機能化し、グルタルアルデヒド固定プロトコルを用いて固定した。細胞を水中で画像化し、細胞表面に個々の量子ドットが見える細胞の崩壊していない構造を示す。

SEM を使用した生体材料の視覚化に関する JoVE の紹介を見たばかりです。SEM の仕組み、生物学的サンプルの調製方法と画像化方法、および機密性の高い構造に関する手法の応用について理解する必要があります。

見ていただきありがとうございます!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

図 3 および図 4 の SEM 画像は、画像化された構造がマイクロスケール機能を備えた高度に 3 次元であることを示しています。画質はスパッタコーティングの焦点と厚さの影響を受けます。

Figure 4
図 3: 次の図は、サンプル フォーカスが画質に与える影響を示しています。 右側の画像では、視野全体がフォーカスされているのに対し、左側はフォーカスが外れです。フォーカスのようなパラメータを使用して再生すると、はるかに良いイメージを提供できます。
Figure 3
4:コラーゲン-ヒドロキシアパタイト試料の画像

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ここでは、電子顕微鏡の焦点深度、視野、最大解像度と倍率、およびこれらの特性を使用して生体試料を表示する方法を示しました。このデモンストレーションは、特定のアプリケーションに最適な顕微鏡モジュールを視聴者が判断できるように設計されています。実証したように、SEMは非常に高い焦点深度、はるかに高い解像度と大きな倍率を持っています。ただし、すべてのサンプルの種類に適しているわけではありません。

このデモンストレーションでは、電子顕微鏡の原理を紹介し、研究室での応用例をいくつか紹介しました。電子顕微鏡は、検査、特性評価、品質管理に使用されます。例えば、IC、回路基板、亀裂伝播、ナノ電気機械システムの可視化に使用されます。生物学の分野では、これらの楽器は、同様に重要な役割を果たしています。特に湿った生体試料を収容するように設計された電子顕微鏡もあります。これらの生体試料は、組織から骨、細胞および微生物に及びる。追加の検出器を使用すると、精密な表面解析など、さらに多くの分析が可能になります。

材料一覧

名前 会社 カタログ番号 コメント
機器
バイオサンプル
カーボンまたはゴールドコーター
クロスビームSEM ツァイス
コラーゲン-ヒドロキシ食欲細胞足場 コネチカット大学ウェイ研究所が開発

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Oatley, C. W., W. C. Nixon, and R. F. W. Pease. "Scanning electron microscopy." Advances in Electronics and Electron Physics 21 (1966): 181-247.
  2. Goldstein, Joseph, et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis: a text for biologists, materials scientists, and geologists. Springer Science & Business Media, 2012.
  3. Carol Heckman, et al. Preparation of cultural cells for scanning electron microscope. Nature Protocols Network, 2007, doi:10.1038/nprot.2007.504
生体試料のSEMイメージング
Play Video
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter