Luce / buio test di transizione per i Topi

Summary

La luce / buio prova di transizione è uno dei test più usato per misurare l'ansia comportamento simile nei topi. Qui, vi presentiamo un film che mostra le procedure dettagliate su come condurre il test.

Abstract

Anche se tutte le sequenze del genoma del topo sono stati determinati, noi non sappiamo ancora le funzioni della maggior parte di questi geni. Gene-targeting tecniche, tuttavia, può essere utilizzato per cancellare o manipolare uno specifico gene nei topi. L'influenza di un dato gene in un comportamento specifico può essere determinato da condurre analisi del comportamento dei topi mutanti. Come test di fenotipizzazione comportamentale di topi mutanti, la luce / buio test di transizione è uno dei test più comunemente utilizzato per misurare l'ansia comportamento simile nei topi. Il test si basa sulla naturale avversione dei topi in modo vivace le zone illuminate e sul loro comportamento spontaneo di esplorazione in ambienti romanzo. Il test è sensibile al trattamento farmacologico ansiolitici. L'apparecchio è costituito da una camera oscura e una camera illuminato. I topi possono circolare liberamente tra le due camere. Il numero di voci nella camera luminosa e la durata del tempo trascorso ci sono indici di brillanti spazio ansia nei topi. Per ottenere risultati fenotipizzazione di un ceppo di topi mutanti che possono essere facilmente riprodotti e confrontati con quelli di altri mutanti, i metodi di prova comportamentale dovrebbe essere quanto più possibile identico tra laboratori. Le differenze procedurali che esistono tra i laboratori, tuttavia, rende difficile replicare o confrontare i risultati tra laboratori. Qui vi presentiamo il nostro protocollo per il chiaro / scuro prova transizione come un filmato in modo che i dettagli del protocollo può essere dimostrata. Nel nostro laboratorio, abbiamo valutato più di 60 ceppi di topi mutanti utilizzando il protocollo mostrato nel film. Tali dati saranno comunicati come parte di un database pubblico che stiamo costruendo.

Visualizzazione del protocollo faciliterà la comprensione dei dettagli di tutta la procedura sperimentale, che consente per la standardizzazione dei protocolli utilizzati in laboratori e confronti dei fenotipi comportamentali dei vari ceppi di topi mutanti valutata usando questo test.

Protocol

1. L'apparecchio utilizzato per la luce / buio transizione prova consisteva in una gabbia (21x42x25 cm) diviso in due sezioni di uguale misura da un tramezzo con porta (Ohara & Co., Tokyo).
2. I topi sono alloggiati 3-4 per gabbia in una stanza con una 12 ore ciclo luce / buio (le luci alle 7:00) con accesso ad libitum a cibo e acqua. Idealmente, due controlli e due mutanti sono alloggiati insieme, riorganizzando i topi non appena sono genotipizzati al momento dello svezzamento. Test del comportamento è effettuata 9:00-6:00 Tutte le gabbie contenenti i topi vengono trasferiti nella sala prove comportamento 30 minuti prima che il primo processo ha inizio.
3. Una camera è illuminata da diodi bianchi (390 lux), mentre l'altra camera è scuro (2 lux). I topi sono posti nel lato oscuro e la porta si apre automaticamente 3 secondi dopo che il mouse viene rilevato dalla telecamera a raggi infrarossi. La porta è utilizzato in modo che i topi non entrano nel camera luce subito dopo il rilascio con la loro motivazione a fuggire da sperimentatore, poiché la latenza per accedere alla camera luce può servire come indice di ansia comportamento simile.
4. I topi possono circolare liberamente tra le due camere con porta aperta per 10 minuti. L'applicazione utilizzata per l'acquisizione e l'analisi dei dati comportamentali (immagine LD4) si basa sul pubblico del programma J Immagine di dominio (sviluppato byWayne Rasband presso l'Istituto Nazionale di Salute Mentale e disponibile http://rsb.info.nih.gov/ij /), che è stato modificato da Tsuyoshi Miyakawa (disponibile tramite O'Hara & Co., Tokyo, Giappone).
5. La distanza percorsa in ciascuna camera, il numero totale di transizioni, il tempo trascorso in ciascuna camera, e la latenza per entrare nella luce chamberare registrati da Image LD4 programma.
6. Dopo ogni prova, tutte le camere sono pulite con acqua eccellente ipocloroso per evitare un pregiudizio basato su stimoli olfattivi.

Discussion

Anche se tutte le sequenze del genoma del topo sono stati determinati, le funzioni della maggior parte di questi geni non sono noti. Gene-targeting tecniche, tuttavia, può essere utilizzato per cancellare o manipolare uno specifico gene nei topi (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004).. L'influenza di un dato gene in un comportamento specifico può essere determinato da condurre analisi del comportamento dei topi mutanti (Takao e Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Come test di fenotipizzazione comportamentale di topi mutanti, la luce / buio test di transizione è uno dei test più comunemente utilizzato per misurare l'ansia comportamento simile nei topi (Crawley, 2000). Il test si basa sulla naturale avversione dei topi in modo vivace le zone illuminate e sul loro comportamento spontaneo di esplorazione in ambienti romanzo (Crawley, 1985). Il test è sensibile al trattamento con farmaci ansiolitici (Crawley, 1985). L'apparecchio è costituito da una camera oscura e una camera illuminato. Un'apertura limitata, 3 cm per 5 cm di larghezza, collega le due camere. I topi possono circolare liberamente tra le due camere. Il numero di voci nella camera luminosa e la durata del tempo trascorso lì vengono utilizzati come indici di luminoso spazio-ansia nei topi.

La luce / buio prova di transizione è stato originariamente sviluppato da Crawley e colleghi (Crawley e Goodwin, 1980). Ci sono due differenze tra la loro versione originale ed il nostro test. In primo luogo, la camera di luce è più grande della camera oscura nella versione originale, mentre le dimensioni delle due camere è lo stesso nella nostra versione del test. In secondo luogo, nella versione originale, la camera di luce non ha soffitto e le pareti della camera di luce erano trasparenti (Crawley e Goodwin, 1980), mentre l'uso di plastica opaca bianca per il soffitto e le pareti della camera di luce. Queste differenze, in particolare le dimensioni e l'apertura della camera di luce, consentono la rilevazione simultanea di brillanti spazio ansia così come open-space ansia nella versione originale del test. Nel nostro laboratorio, invece, open-space ansia comportamento simile nei topi è stato testato in un labirinto, più elevata. Le pareti opache e il soffitto, le dimensioni della camera di luce, e la nostra specifica alla luce / buio protocollo di prova transizione è più specializzato per la rilevazione luminoso spazio-ansia rispetto alla versione originale.

Anche se la luce / buio di transizione e di prova più elevata labirinto sono entrambi utilizzati per valutare l'ansia, come il comportamento, i risultati non sono sempre coerenti. Per esempio, proencefalo specifiche topi knockout calcineurina trascorrere una diminuzione della quantità di tempo nella camera di luce nella luce / buio prova di transizione, ma una maggiore quantità di tempo tra le braccia aperte nel labirinto più elevata (Miyakawa et al., 2003) . Abbiamo ipotizzato che la nostra luce / buio e test di transizione test più elevata labirinto valutare diversi aspetti di ansia comportamento simile, come ad esempio luminoso spazio-ansia e open-space ansia comportamento simile. Per verificare questa ipotesi, abbiamo utilizzato un set di dati di grandi dimensioni raccolti con i topi stessi in entrambe le prove. Nel nostro laboratorio, abbiamo condotta batterie di test comportamentali che copre molti campi per lo screening per il significato del comportamento dei geni. La batteria di test richiede diverse settimane per essere completato. Durante il periodo di prova, le gabbie del mouse sono conservati in un rack nella nostra struttura. Se i topi sono trasportati al nostro laboratorio da altre istituzioni, che sono abituati all'ambiente della nostra struttura per almeno 1 settimana. Dopo il periodo di assuefazione, i topi sono sottoposti a un controllo sanitario generale e di screening neurologico (Miyakawa et al., 2003), e dopo questi esami semplici, i topi sono soggetti alla luce / buio prova di transizione. Il test viene condotto in una stanza insonorizzata sperimentale dopo 30 minuti di assuefazione alla sala sperimentale, come mostrato nel film.

Abbiamo valutato più di 60 ceppi di topi mutanti geneticamente modificati utilizzando il protocollo mostrato nel film e hanno un grande insieme di dati grezzi per più di 3000 topi (compresi wild-type e topi mutanti). Abbiamo condotto analisi fattore da sfruttare la grande insieme di dati grezzi. In effetti, abbiamo rilevato diversi fattori da ogni prova (dati non pubblicati), anche se ci sono state alcune correlazioni significative tra gli indici (dati non pubblicati) .. Tali dati saranno comunicati nell'ambito di un database pubblico che stiamo costruendo.

Nella nostra batteria di test, wild-type fratellini sono di solito usati come controllo. Come un ceppo di fondo, i topi C57BL/6J sono comunemente usati. Abbiamo raccolto i dati di topi C57BL/6J utilizzato come controllo di topi mutanti nella batteria di test. Gli indici ottenuti da topi C57BL/6J nel nostro chiaro / scuro test di transizione sono stati i seguenti (n = 795; media ± SEM); distanza percorsa: 846,5 8,88 centimetri nella camera di luce, 1478,5 9,53 centimetri nella camera oscura, la durata del tempo trascorso : 215,8 1,85 s nella luce, 395,8 1,86 s al buio; numero di transizioni tra i compartimenti: 30,52 0,43; latenza per entrare nella camera luce: 64,94 2,40 s. Movimento dei topi intorno agli ingressi alle camere viene rilevato dalla telecamera e viene conteggiato come tempo trascorso in entrambi cHambers. A causa di questo, la somma della durata media del tempo trascorso in luce e che in compartimenti buio era più grande di quella di tutta la durata del test (600 s).

Nel nostro protocollo, un mouse è la prima volta immessi nella camera oscura. Tre secondi dopo aver posizionato il mouse nella camera oscura, la porta tra le camere si apre automaticamente e il mouse possono muoversi liberamente tra le due camere. Topi C57BL/6J passare meno tempo nella camera di luce che in camera oscura (p <0,0001, la durata se il tempo trascorso in luce: 215,8 1,85 s, la durata del tempo trascorso nel buio: 316,3 2,11 s [il tempo trascorso al buio fa non comprende il tempo trascorso prima al buio prima di entrare nella camera di luce per la prima volta], n = 795, accoppiato t-test). Questo indica che i topi C57BL/6J tendono ad evitare la camera di luce, e che il tempo trascorso in luce è un buon indice di ansia comportamento simile.

I risultati ottenuti da vari ceppi di topi mutanti sono facilmente rispetto, perché tutti i dati sono ottenuti utilizzando lo stesso protocollo. Per ottenere risultati fenotipizzazione di un ceppo di topi mutanti che possono essere facilmente riprodotti e confrontati con i dati di altri mutanti, i metodi di prova comportamentale dovrebbe essere quanto più possibile identico tra laboratori. Tiger e colleghi hanno testato l'interazione tra il comportamento del mouse e ambiente di laboratorio usando esattamente gli stessi ceppi inbred e un ceppo mutante nullo. Nel loro studio, l'apparato, i protocolli di prova, e molte variabili ambientali sono state rigorosamente standardizzati. Nonostante la standardizzazione, hanno trovato differenze sistematiche nel comportamento tra laboratori, anche se anche rilevato differenze ceppo in tutti i comportamenti (Crabbe et al., 1999). Essi hanno riferito che le variabili incontrollabili e sperimentazioni che caratterizzano i mutanti possono dare risultati che sono idiosincratiche di un laboratorio di particolare. Le differenze procedurali che esistono tra i laboratori rendono difficile da replicare o confrontare i risultati tra laboratori. Qui vi presentiamo il nostro protocollo per il chiaro / scuro prova transizione come un filmato in modo che i dettagli del protocollo può essere dimostrata.

Stabilire documentazione visiva del protocollo faciliterà una migliore comprensione dei dettagli di procedure sperimentali, permettendo per la standardizzazione dei protocolli utilizzati in laboratori e confronti tra i fenotipi comportamentali dei vari ceppi di topi mutanti valutata usando questo test. Film di altri protocolli, come per il labirinto più elevato, test a campo aperto, test di nuoto porsolt forzata, condizionamento alla paura, che utilizziamo nel nostro batteria di test comportamentali sono attualmente in corso per la pubblicazione di articoli futuri Video Journal.