Summary
O teste de transição claro / escuro é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento em camundongos. Aqui, apresentamos um filme que mostra os procedimentos detalhados de como realizar o teste.
Abstract
Apesar de todas as seqüências do genoma do rato foram determinadas, nós não sabemos ainda as funções da maioria desses genes. Gene-targeting técnicas, no entanto, pode ser usado para apagar ou manipular um gene específico em camundongos. A influência de um determinado gene em um comportamento específico pode ser determinada através da realização de análises comportamentais dos ratos mutantes. Como um teste para fenotipagem comportamental de ratos mutantes, o teste de transição claro / escuro é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento em camundongos. O teste se baseia na aversão natural dos ratos para áreas iluminadas brilhantemente e em seu comportamento espontâneo exploratório em ambientes novos. O teste é sensível ao tratamento com drogas ansiolíticas. O aparelho consiste de uma câmara escura e uma câmara iluminada. Os ratos são autorizados a circular livremente entre as duas câmaras. O número de entradas na câmara clara e da duração do tempo gasto há índices de brilhante espaço ansiedade em camundongos. Para obter fenotipagem resultados de uma linhagem de camundongos mutantes que podem ser facilmente reproduzidos e comparados com os de outros mutantes, os métodos de teste comportamental deve ser o mais idêntico possível entre laboratórios. As diferenças processuais que existem entre laboratórios, no entanto, torná-lo difícil de replicar ou comparar os resultados entre laboratórios. Aqui, apresentamos nosso protocolo para o teste de transição claro / escuro como um filme para que os detalhes do protocolo pode ser demonstrada. Em nosso laboratório, temos avaliados mais de 60 linhagens de camundongos mutantes usando o protocolo mostrado no filme. Esses dados serão divulgados como parte de um banco de dados público que estamos construindo agora.
Visualização do protocolo vai facilitar a compreensão dos detalhes de todo o procedimento experimental, permitindo a padronização dos protocolos utilizados em laboratórios e comparações dos fenótipos comportamentais de várias linhagens de ratos mutantes avaliados através deste teste.
Protocol
- O aparelho utilizado para o teste de transição claro / escuro consistiu em uma gaiola (21x42x25 cm) dividida em duas secções de igual tamanho de uma partição com porta (Ohara & Co., Tokyo).
- Os ratos são alojados 03:57 por gaiola em uma sala com um 12 horas de ciclo claro / escuro (luzes acesas às 07:00) com acesso ad libitum à água e comida. Idealmente, dois controles e dois mutantes estão alojados juntos, re-organizar os ratos logo que são genotipados no momento do desmame. Testes comportamentais é realizada 09h00 - 18:00 Todas as gaiolas de camundongos são transferidos para a sala de testes de comportamento 30 min antes do primeiro julgamento começa.
- Uma câmara é profusamente iluminado por diodos branco (390 lux), enquanto a outra câmara escura (2 lux). Os ratos são colocados no lado escuro ea porta é aberta automaticamente 3 segundos após o mouse é detectado pela câmera infravermelha. A porta é usado para que os ratos não entram na câmara de luz imediatamente após a liberação com a sua motivação para escapar do pesquisador, uma vez que a latência para entrar na câmara de luz pode servir como um índice de ansiedade-como o comportamento.
- Os ratos são autorizados a circular livremente entre as duas câmaras com a porta aberta por 10 min. O aplicativo utilizado para a aquisição e análise de dados comportamentais (Image LD4) é baseado no programa público de domínio J Imagem (desenvolvido byWayne Rasband no Instituto Nacional de Saúde Mental e disponível em http://rsb.info.nih.gov/ij /), que foi modificado por Tsuyoshi Miyakawa (disponível através de O'Hara & Co., Tóquio, Japão).
- A distância percorrida em cada câmara, o número total de transições, o tempo gasto na câmara de cada um, ea latência para entrar no chamberare luz gravada pelo programa Imagem LD4.
- Depois de cada julgamento, todas as câmaras são limpos com água super-hipocloroso para evitar uma polarização com base em pistas olfactivas.
Discussion
Apesar de todas as seqüências do genoma do rato foram determinadas, as funções da maioria destes genes não são conhecidas. Gene-targeting técnicas, no entanto, pode ser usado para apagar ou manipular um gene específico em camundongos (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004).. A influência de um determinado gene em um comportamento específico pode ser determinada através da realização de análises comportamentais dos camundongos mutantes (Takao e Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Como um teste para fenotipagem comportamental de ratos mutantes, o teste de transição claro / escuro é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento em camundongos (Crawley, 2000). O teste se baseia na aversão natural dos ratos para áreas iluminadas brilhantemente e em seu comportamento espontâneo exploratório em ambientes novos (Crawley, 1985). O teste é sensível ao tratamento com medicamentos ansiolíticos (Crawley, 1985). O aparelho consiste de uma câmara escura e uma câmara iluminada. A abertura restrita, 3 cm de altura por 5 cm de largura, liga as duas câmaras. Os ratos são autorizados a circular livremente entre as duas câmaras. O número de entradas na câmara clara e da duração do tempo que passei lá são usados como índices de brilhante espaço ansiedade em camundongos.
O teste de transição claro / escuro foi originalmente desenvolvido pela Crawley e colegas (Crawley e Goodwin, 1980). Há duas diferenças entre a sua versão original e nosso teste. Primeiro, a câmara de luz é maior do que a câmara escura na versão original, enquanto que o tamanho das duas câmaras é o mesmo em nossa versão do teste. Segundo, na versão original, a câmara de luz não tinha teto e as paredes da câmara de luz eram transparentes (Crawley e Goodwin, 1980), enquanto nós usamos plástico branco opaco para o teto e as paredes da câmara de luz. Essas diferenças, ou seja, o tamanho ea abertura da câmara de luz, permite a detecção simultânea de brilhante espaço ansiedade, bem como abrir espaço ansiedade na versão original do teste. Em nosso laboratório, no entanto, abrir espaço ansiedade-como o comportamento em camundongos é testado em um labirinto em cruz elevado. As paredes eo teto opaco, tamanho da câmara de luz, e nossa específicas de luz / escuro protocolo de teste de transição é mais especializado para detectar brilhante espaço ansiedade em relação à versão original.
Embora o teste de transição claro / escuro e labirinto em cruz elevado são utilizados para avaliar a ansiedade-como o comportamento, os resultados nem sempre são consistentes. Por exemplo, prosencéfalo específicos camundongos knockout calcineurina passar uma diminuição da quantidade de tempo na câmara de luz no teste de transição claro / escuro, mas um aumento da quantidade de tempo nos braços abertos no labirinto em cruz elevado (Miyakawa et al., 2003) . Nossa hipótese é que a nossa luz / escuro de transição do teste e testes de labirinto em cruz elevado avaliar diferentes aspectos da ansiedade-como o comportamento, como o brilhante espaço ansiedade e de espaço aberto a ansiedade-como o comportamento. Para testar essa hipótese, usamos um grande conjunto de dados coletados com os ratos mesmo em ambos os testes. Em nosso laboratório, realizamos baterias de testes comportamentais que abrangem vários domínios para a tela para o significado do comportamento dos genes. A bateria de testes requer várias semanas para ser concluído. Durante o período de testes, gaiolas de rato são mantidos em um rack nas nossas instalações. Se os ratos são transportados para o nosso laboratório de outras instituições, que estão habituados ao ambiente das nossas instalações por pelo menos uma semana. Após o período de habituação, os ratos são submetidos a um exame de saúde geral e exames neurológicos (Miyakawa et al., 2003), e após esses exames simples, os ratos são submetidos ao teste de transição claro / escuro. O teste é realizado em uma sala à prova de som experimental, após 30 min de habituação à sala experimental, como mostrado no filme.
Avaliou-se a mais de 60 linhagens de ratos mutantes geneticamente modificados usando o protocolo mostrado no filme e tem um grande conjunto de dados brutos para mais de 3000 ratos (incluindo do tipo selvagem e camundongos mutantes). Realizamos análises fatoriais para tirar proveito do grande conjunto de dados brutos. Na verdade, nós detectamos diversos fatores de cada teste (dados não publicados), embora houvesse algumas correlações significativas entre os índices (dados não publicados) .. Esses dados serão divulgados como parte de um banco de dados público que estamos construindo agora.
Em nossa bateria de testes, do tipo selvagem littermates são normalmente utilizados como controle. Como uma tensão de fundo, os camundongos C57BL/6J são comumente usados. Foram coletados os dados de camundongos C57BL/6J usado como um controle de ratos mutantes na bateria de testes. Os índices obtidos de camundongos C57BL/6J em nosso teste de transição claro / escuro foram os seguintes (n = 795; SEM média), a distância percorrida: 846,5 8,88 centímetros na câmara de luz, 1478,5 9,53 centímetros na câmara escura; duração do tempo gasto : 215,8 s 1,85 na luz, 395,8 1,86 s no escuro; número de transições entre compartimentos: 30,52 0,43; latência entre na câmara de luz: 64,94 2,40 s. Movimento de ratos em torno das entradas para as câmaras é detectado pela câmera e é contado como tempo gasto em ambos os cHambers. Devido a isso, a soma da duração média de tempo gasto na luz e que em compartimentos escuros foi maior do que a de toda a duração do teste (600 s).
Em nosso protocolo, um rato é o primeiro colocado na câmara escura. Três segundos depois de colocar o mouse na câmara escura, a porta entre as câmaras e abre automaticamente o rato pode se mover livremente entre as duas câmaras. Camundongos C57BL/6J gastar menos tempo na câmara de luz do que na câmara escura (p <0,0001, duração, se o tempo gasto em luz: 215,8 1,85 s, duração do tempo gasto no escuro: 316,3 2,11 s [o tempo gasto no escuro faz não inclui o tempo inicial gasto no escuro antes de entrar na câmara de luz pela primeira vez], n = 795, teste T pareado). Isto indica que os camundongos C57BL/6J tendem a evitar a câmara de luz, e que o tempo gasto na luz é um bom índice de ansiedade-como o comportamento.
Os resultados obtidos a partir de várias linhagens de ratos mutantes são facilmente comparados, porque todos os dados são obtidos utilizando o mesmo protocolo. Para obter fenotipagem resultados de uma linhagem de camundongos mutantes que podem ser facilmente reproduzidos e comparados com dados de outros mutantes, os métodos de teste comportamental deve ser o mais idêntico possível entre laboratórios. Crabbe e seus colegas testaram a interação entre o comportamento do mouse e ambiente de laboratório usando exatamente as mesmas cepas puras e uma cepa mutante nulo. Em seu estudo, o aparelho, os protocolos de teste, e muitas variáveis ambientais foram rigorosamente padronizado. Apesar da padronização, eles encontraram diferenças sistemáticas no comportamento em laboratório, embora também detectou diferenças tensão em todos os comportamentos (Crabbe et al., 1999). Eles relataram que as variáveis incontroláveis e experiências que caracterizam os mutantes podem produzir resultados que são idiossincráticos a um laboratório particular. As diferenças que existem entre processuais laboratórios tornam difícil replicar ou comparar os resultados entre laboratórios. Aqui, apresentamos nosso protocolo para o teste de transição claro / escuro como um filme para que os detalhes do protocolo pode ser demonstrada.
Elaboração de documentação visual do protocolo vai facilitar uma melhor compreensão dos detalhes de procedimentos experimentais, permitindo a padronização dos protocolos utilizados em laboratórios e para as comparações dos fenótipos comportamentais de várias linhagens de ratos mutantes avaliados através deste teste. Filmes de outros protocolos, como para o labirinto em cruz elevado, teste de campo aberto, teste de natação forçada porsolt, o condicionamento do medo, que nós usamos em nossa bateria de testes comportamentais estão sendo feitos para publicação como artigos de periódicos futuro vídeo.
Disclosures
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso Animal e Cuidados da Universidade de Kyoto. Tsuyoshi Miyakawa está associada com BIRD, Ciência Japão e Agência de Tecnologia, Saitama, Japão.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela Grants-in-Aid para Jovens Cientistas (A) (# 16680015), Grant-in-Aid para a Investigação exploratória (# 16653065), Grant-in-Aid para a Investigação Científica em Áreas Prioritárias (# 18023022, # 18016012 e # 18053015) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão, Grant-in-Aid de Promoção de Estudos Fundamentais em Ciências da Saúde do Instituto Nacional de Inovação Biomédica (NIBIO), Grant-in- ajuda de Neuroinformática Japão Center (NIJC), RIKEN
References
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- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann N Y Acad Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci Res. 58, 124-1232 (2007).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley & Sons. (2000).
- Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci Biobehav Rev. 9, 37-44 (1985).
- Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacol Biochem Behav. 13, 167-1670 (1980).
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- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284, 1670-162 (1999).
