Summary
Светлый / темный переход тест является одним из наиболее широко используемых тестов для измерения тревоги-подобное поведение у мышей. Здесь мы представляем фильм, который показывает, детальные процедуры о том, как мы проводим тест.
Abstract
Хотя все последовательности генома мыши были определены, мы еще не знаем функции большинства этих генов. Ген-таргетинга методы, однако, может быть использована для удаления или манипулировать определенный ген у мышей. Влияние данного гена на определенное поведение может быть определена путем проведения поведенческого анализа мутантных мышей. В качестве теста для поведенческого фенотипирование мутантных мышей, светлый / темный переход тест является одним из наиболее широко используемых тестов для измерения тревоги-подобное поведение у мышей. Тест основан на естественное отвращение мышей в ярко освещенных областях и на их спонтанное исследовательское поведение в романе средах. Тест чувствителен к анксиолитическим лечения наркозависимости. Аппарат состоит из темной камере и ярко освещенную камеру. Мыши могут свободно перемещаться между двумя палатами. Количество записей в яркие камеры и продолжительность времени, проведенного Есть показатели ярко-пространство тревоги у мышей. Для получения фенотипирование результаты штамм мутантных мышей, которые могут быть легко воспроизведены и по сравнению с другими мутантами, поведенческие методы испытания, должно быть идентично, насколько это возможно лабораторий. Процедурные различия, существующие между лабораториями, однако, сделать его трудно воспроизвести или сравнить результаты среди лабораторий. Здесь мы представляем наш протокол светлый / темный переход теста в виде фильма, так что детали протокола может быть доказана. В нашей лаборатории мы оценили более 60 штаммов мутантных мышей, используя протокол показано в фильме. Эти данные будут переданы как часть базы данных, которую мы сейчас строительство.
Визуализация протокол будет способствовать пониманию деталей всей экспериментальной процедуры, позволяющие по стандартизации протоколов, используемых по всей лаборатории и сравнение поведенческих фенотипов различных штаммов мутантных мышей оценивали с помощью этого теста.
Protocol
- Аппарат, используемый для светлый / темный переход Тест состоял в клетку (21x42x25 см) разделена на две части равного размера путем раздела с дверью (Охара & Ко, Токио).
- Мыши размещены 3:57 в клетке, в комнате с 12 ч свет / темно-цикл (свет в 7:00 утра) с вволю доступ к пище и воде. В идеале, два элемента управления и двух мутантов размещены вместе, реорганизации мышей, как только они генотипировали во время отлучения от груди. Поведенческие тестирование проводится с 9:00 до 6:00 вечера все клетки содержащие мышей передаются в комнату поведение проверки за 30 минут до первого судебного процесса начинается.
- Одна камера ярко освещенных белых диодов (390 лк), в то время как другой камере темно (2 люкс). Мышей помещали в темную сторону, и дверь открывается автоматически через 3 секунды после мыши обнаруживается инфракрасной камеры. Дверь используется так, что мышь не входят свет камеры сразу после выхода с их мотивацию бежать от экспериментатора, так как задержка, чтобы войти в свет камера может служить показателем тревоги-подобное поведение.
- Мыши могут свободно перемещаться между двумя камерами с открытой дверь в течение 10 мин. Приложение, используемое для получения и анализа данных о поведении (Image LD4) основана на общественное достояние изображения J программы (развитые byWayne Rasband из Национального института психического здоровья и доступны на http://rsb.info.nih.gov/ij /), который был изменен Tsuyoshi Миякава (доступна за счет О'Хара и Ко, Токио, Япония).
- Расстояние, пройденное в каждой камере, общее число переходов, время, проведенное в каждой камере, и задержки, чтобы войти в свет chamberare записанные изображения LD4 программы.
- После каждого испытания, все камеры очищаются с супер хлорноватистой водой, чтобы предотвратить смещение основано на обонятельные сигналы.
Discussion
Хотя все последовательности генома мыши были определены, функции большинства из этих генов не известны. Ген-таргетинга методы, однако, может быть использована для удаления или манипулировать определенный ген у мышей (AIBA и др., 2007;. Остин и др., 2004.). Влияние данного гена на определенное поведение может быть определена путем проведения поведенческого анализа мутантных мышей (Такао и Миякава, 2006;. Такао и др., 2007). В качестве теста для поведенческого фенотипирование мутантных мышей, светлый / темный переход тест является одним из наиболее широко используемых тестов для измерения тревоги-подобное поведение у мышей (Кроули, 2000). Тест основан на естественное отвращение мышей в ярко освещенных областях и на их спонтанное исследовательское поведение в романе сред (Кроули, 1985). Тест чувствителен к анксиолитическим медикаментозное лечение (Кроули, 1985). Аппарат состоит из темной камере и ярко освещенную камеру. Ограничено открытия, 3 см в высоту на 5 см шириной, соединяющий две камеры. Мыши могут свободно перемещаться между двумя палатами. Количество записей в яркие камеры и продолжительность времени, проведенного Есть использованы в качестве показателей ярко-пространство тревоги у мышей.
Светлый / темный переход тест был первоначально разработан Кроули и его коллеги (Кроули и Гудвин, 1980). Есть два различия между их первоначальной версии и нашего теста. Во-первых, свет камеры больше, чем темные камеры в оригинальной версии, в то время как размер двух палат такая же, в нашей версии теста. Во-вторых, в оригинальной версии, свет камере не было потолка и стен свет камеры были прозрачными (Кроули и Гудвин, 1980), в то время как мы используем непрозрачные белого пластика для потолка и стен свет камеры. Эти различия, а именно размер и открытость свет камеры, дают для одновременного обнаружения ярко-пространство тревоги, а также открытого пространства, беспокойство в оригинальной версии теста. В нашей лаборатории, однако, открытым пространством тревога-подобное поведение у мышей тестируется в приподнятого крестообразного лабиринта. Непрозрачные стены и потолок, размер свет камеры, и наши конкретные светлый / темный протокол испытаний переход более специализированные для обнаружения ярко-пространство тревоги по сравнению с оригинальной версией.
Хотя свет / темно-тест перехода и приподнятого крестообразного лабиринта оба, используемых для оценки тревоги, как поведение, результаты не всегда последовательны. Например, передний мозг конкретных мышей кальциневрина нокаутом тратить уменьшилось количество времени в свет камеры в светлый / темный переход тест, но увеличилось количество времени в объятиями в приподнятого крестообразного лабиринта (Миякава и др., 2003). . Мы предположили, что наш свет / темно-тест перехода и приподнятого крестообразного лабиринта тесты оценки различных аспектов тревоги, как поведение, например, ярко-пространство тревоги и открытого пространства, тревога-подобное поведение. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали большой набор данных, собранных с использованием тех же мышей в обоих тестах. В нашей лаборатории мы проводим поведенческих батареи тестов, охватывающих многие области для выявления поведенческих значение генов. Тест аккумулятора требуется несколько недель. Во время периода тестирования, мышь клетки хранятся на стойке в нашем учреждении. Если мышь перевозят в нашу лабораторию от других учреждений, они привыкли к среде нашего объекта не менее 1 недели. После периода привыкания, мышей подвергаются общая проверка здоровья и неврологические обследования (Миякава и соавт., 2003), и после этих простых экзаменов, мышей подвергаются светлый / темный переход тест. Тест проводится в звуконепроницаемыми экспериментальную комнату через 30 минут привыкания к экспериментальной комнате, как показано в фильме.
Мы оценили более 60 штаммов генно-инженерного мутантных мышей, используя протокол показано в фильме, и есть большой набор исходных данных для более чем 3000 мышей (в том числе дикого типа и мутантных мышей). Мы провели анализ факторов, чтобы воспользоваться большим набором исходных данных. Действительно, мы обнаружили различные факторы, от каждого испытания (неопубликованные данные), хотя были некоторые значимые корреляции между индексами (неопубликованные данные) .. Эти данные будут переданы как часть базы данных, которую мы сейчас строительство.
В нашей тестовой батареи, дикого типа помета, как правило, используется в качестве контроля. Как фон напряжения, C57BL/6J мышей обычно используются. Мы собрали данные мышей C57BL/6J использованы в качестве контроля мутантных мышей в тесте батареи. Показателей, полученных от мышей C57BL/6J в нашей светлый / темный переход испытаний были следующими (п = 795, средний SEM); расстояние: 846,5 8,88 см в свет камеры, 1478,5 9,53 см в темной камере, продолжительность времени, проведенного : 215,8 1,85 с в свет, 395,8 1,86 с в темноте; число переходов между отсеками: 30,52 0,43; задержки, чтобы войти в свет камеры: 64,94 2,40 s. Движение мыши вокруг входов в камерах обнаружены камеры и засчитывается как время, проведенное в обоих сhambers. Из-за этого сумма средняя продолжительность времени, проведенного в свет, и что в темных отсеках было больше, чем весь период испытаний (600 с).
В нашем протокол, мышь поместили в темную камеру. Три секунды после размещения мыши в темной комнате, дверь между камерами автоматически открывается и мыши могут свободно перемещаться между двумя палатами. C57BL/6J мышей тратить меньше времени на свет камеры, чем в темной камере (р <0,0001, продолжительности, если время, проведенное в свет: 215,8 1,85 с, продолжительность времени, проведенного в темноте: 316,3 2,11 с [время, проведенное в темном делает Не включайте в начальный момент времени провел в темной перед входом свет камеры в первый раз], п = 795, в паре-т теста). Это означает, что C57BL/6J мышей правило, чтобы избежать свет камеры, и что время, проведенное в свет хороший показатель тревоги-подобное поведение.
Результаты, полученные из различных штаммов мутантных мышей легко сравнивать, потому что все данные получены, используя тот же протокол. Для получения фенотипирование результаты штамм мутантных мышей, которые могут быть легко воспроизведена и в сравнении с данными других мутантов, поведенческие методы испытания, должно быть идентично, насколько это возможно лабораторий. Крэбб и коллеги протестировали взаимодействие между поведением мыши и лабораторных условиях, используя в точности тот же инбредных линий и один нулевой мутантного штамма. В своем исследовании аппарата, протоколы испытаний, а многие переменные окружения были строго стандартизированы. Несмотря на стандартизацию, они обнаружили систематические различия в поведении между лабораториями, хотя они также обнаружен штамм различия во всех поведения (Крэбб и соавт., 1999). Они сообщили, что неконтролируемые переменные и экспериментов характеризующие мутанты могут дать результаты, которые являются своеобразными к конкретной лаборатории. Процедурные различия, существующие между лабораториями сделать его трудно воспроизвести или сравнить результаты среди лабораторий. Здесь мы представляем наш протокол светлый / темный переход теста в виде фильма, так что детали протокола может быть доказана.
Создание визуальных документации протокол будет способствовать лучшему пониманию деталей экспериментальные процедуры, позволяющие по стандартизации протоколов, используемых по всей лаборатории и для сравнения поведенческих фенотипов различных штаммов мутантных мышей оценивали с помощью этого теста. Фильмы других протоколов, например, для приподнятого крестообразного лабиринта, открытых полевых испытаний, porsolt вынуждены плавать тест, страх кондиционирования, которые мы используем в наших поведенческих тест батареи в настоящее время сделаны для публикации в качестве будущих журнальных статей видео.
Disclosures
Все процедуры были одобрены Использование животных и уход комитета университета Киото. Tsuyoshi Миякава связано с BIRD, Японии науке и технологиям агентства, Сайтама, Япония.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами-в-помощь для молодых ученых () (# 16680015), Грант-в-помощь для исследований разведочных (# 16653065), Грант-в-помощь для научных исследований в приоритетных областях (# 18023022, # 18016012 и № 18053015) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий в Японии, Грант-в-помощь от продвижения фундаментальных исследований в области здравоохранения наук Национального института биомедицинских инноваций (NIBIO), Грант-в- Помощь со Нейроинформатика Японского Центра (NIJC), RIKEN
References
- Austin, C. P. The knockout mouse project. Nat Genet. 36, 921-924 (2004).
- Aiba, A. Mouse liaison for integrative brain research. Neurosci Res. 58, 103-104 (2007).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann N Y Acad Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci Res. 58, 124-1232 (2007).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley & Sons. (2000).
- Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci Biobehav Rev. 9, 37-44 (1985).
- Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacol Biochem Behav. 13, 167-1670 (1980).
- Miyakawa, T. Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 8987-8992 (2003).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284, 1670-162 (1999).
