Luz / oscuridad de transición de prueba para ratones

Summary

La prueba de la transición de luz / oscuridad es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones. A continuación, presentamos una película que muestra los procedimientos detallados sobre cómo realizar la prueba.

Abstract

A pesar de todas las secuencias del genoma del ratón ha sido determinado, que aún no conocen las funciones de la mayoría de estos genes. Gen de metas técnicas, sin embargo, se puede utilizar para suprimir o manipular un gen específico en ratones. La influencia de un determinado gen en una determinada conducta puede ser determinada por la realización de análisis de comportamiento de los ratones mutantes. Como una prueba para el fenotipo de comportamiento de los ratones mutantes, la prueba de la transición de luz / oscuridad es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones. La prueba se basa en la aversión natural de los ratones a las zonas muy iluminadas y en su comportamiento espontáneo de exploración en ambientes nuevos. La prueba es sensible al tratamiento con medicamentos ansiolíticos. El aparato consiste en una cámara oscura y una cámara iluminada. Los ratones se les permite moverse libremente entre las dos cámaras. El número de entradas en la cámara de brillantes y la duración del tiempo que pasó allí están los indicadores de brillantes-el espacio de ansiedad en los ratones. Para obtener resultados fenotipo de una cepa de ratones mutantes que pueden reproducirse fácilmente y en comparación con los de otros mutantes, los métodos de ensayo de comportamiento debe ser lo más parecido posible entre los laboratorios. Las diferencias de procedimiento que existe entre los laboratorios, sin embargo, hacen que sea difícil de replicar o comparar los resultados entre laboratorios. Aquí, presentamos nuestro protocolo de la prueba de la transición de luz / oscuridad como una película para que los detalles del protocolo se puede demostrar. En nuestro laboratorio, hemos evaluado más de 60 cepas de ratones mutantes utilizando el protocolo se muestra en la película. Esos datos serán divulgados como parte de una base de datos pública que ahora estamos construyendo.

Visualización del protocolo facilitará la comprensión de los detalles del procedimiento experimental completa, que permite la estandarización de los protocolos utilizados en los laboratorios y las comparaciones de los fenotipos del comportamiento de las distintas cepas de ratones mutantes evaluó a través de esta prueba.

Protocol

1. El aparato utilizado para la prueba de la transición de luz / oscuridad consistió en una jaula (21x42x25 cm) dividida en dos secciones de igual tamaño de una partición con la puerta (Ohara & Co., de Tokio).
2. Los ratones se encuentran tres o cuatro por jaula en una habitación con un 12 hr luz / oscuridad ciclo (luces a las 7:00 AM) con acceso ad libitum al alimento y agua. Idealmente, dos controles y dos mutantes se encuentran juntos, por la reorganización de los ratones tan pronto como se genotipo en el momento del destete. Las pruebas de comportamiento se lleva a cabo 09 a.m.-06:00 PM Todos los jaulas de ratones se transfieren a la sala de pruebas de comportamiento de 30 minutos antes de la primera prueba comienza.
3. Una cámara es iluminado por diodos blancos (390 lux), mientras que la otra cámara es oscuro (2 lux). Los ratones se colocan en el lado oscuro y la puerta se abre automáticamente 3 segundos después de que el ratón es detectado por la cámara infrarroja. La puerta se utiliza para que los ratones no entran en la cámara de luz inmediatamente después de la liberación con su motivación para escapar de experimentador, ya que la latencia para entrar en la cámara de luz puede servir como un índice de ansiedad-como comportamiento.
4. Los ratones se les permite moverse libremente entre las dos cámaras con la puerta abierta durante 10 minutos. La aplicación que se utiliza para obtener y analizar los datos de comportamiento (imagen LD4) se basa en el programa J dominio público de la imagen (desarrollado byWayne Rasband en el Instituto Nacional de Salud Mental y está disponible en http://rsb.info.nih.gov/ij /), que fue modificada por Tsuyoshi Miyakawa (disponible a través de O'Hara & Co., Tokio, Japón).
5. La distancia recorrida en cada cámara, el número total de transiciones, el tiempo empleado en la cámara de cada uno, y la latencia para entrar en el chamberare de luz registrados por la imagen LD4 programa.
6. Después de cada ensayo, todas las cámaras se limpian con agua hipocloroso súper para evitar un sesgo sobre la base de señales olfativas.

Discussion

A pesar de todas las secuencias del genoma del ratón ha sido determinado, las funciones de la mayoría de estos genes no se conocen. Gen de metas técnicas, sin embargo, se puede utilizar para suprimir o manipular un gen específico en ratones (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004).. La influencia de un determinado gen en una determinada conducta puede ser determinada por la realización de análisis de comportamiento de los ratones mutantes (Takao y Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Como una prueba para el fenotipo de comportamiento de los ratones mutantes, la prueba de la transición de luz / oscuridad es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones (Crawley, 2000). La prueba se basa en la aversión natural de los ratones a las zonas muy iluminadas y en su comportamiento espontáneo de exploración en nuevos ambientes (Crawley, 1985). La prueba es sensible al tratamiento con fármacos ansiolíticos (Crawley, 1985). El aparato consiste en una cámara oscura y una cámara iluminada. Una apertura restringida, 3 cm de alto por 5 cm de ancho, une las dos cámaras. Los ratones se les permite moverse libremente entre las dos cámaras. El número de entradas en la cámara de brillantes y la duración del tiempo pasado allí se utilizan como índices de brillantes-el espacio de ansiedad en los ratones.

La prueba de la transición de luz / oscuridad fue desarrollado originalmente por Crawley et al (Crawley y Goodwin, 1980). Hay dos diferencias entre su versión original y nuestra prueba. En primer lugar, la cámara de luz es mayor que la cámara oscura en la versión original, mientras que el tamaño de las dos cámaras es el mismo que en nuestra versión de la prueba. En segundo lugar, en la versión original, la cámara de luz no tenía techo y las paredes de la cámara de luz eran transparentes (Crawley y Goodwin, 1980), mientras que el uso de plástico blanco opaco para el techo y las paredes de la cámara de luz. Estas diferencias, a saber, el tamaño y la apertura de la cámara de luz, permite la detección simultánea de brillantes espacio ansiedad, así como espacios abiertos de ansiedad en la versión original de la prueba. En nuestro laboratorio, sin embargo, de espacio abierto de ansiedad-como el comportamiento de los ratones se probó en un laberinto elevado. Las paredes y el techo opaco, tamaño de la cámara de luz, y nuestra luz específica / oscuridad protocolo de transición de la prueba es más específico para la detección de brillantes-el espacio de ansiedad en comparación con la versión original.

Aunque la prueba de transición claro / oscuro y elevado más laberinto son utilizados para la evaluación de la ansiedad-como el comportamiento, los resultados no siempre son coherentes. Por ejemplo, el prosencéfalo específicos ratones knockout calcineurina pasar una disminución en la cantidad de tiempo en la cámara de luz en la prueba de la transición de luz / oscuridad, pero una mayor cantidad de tiempo en los brazos abiertos en el laberinto elevado más (Miyakawa et al., 2003) . La hipótesis de que nuestra luz / oscuridad de prueba de transición y las pruebas más elevada laberinto evaluar los diferentes aspectos de la ansiedad-como el comportamiento, tales como brillante del espacio ansiedad y espacios abiertos de ansiedad-como comportamiento. Para probar esta hipótesis, se utilizó un gran conjunto de datos recolectados a través de los mismos ratones en ambas pruebas. En nuestro laboratorio, realizamos las baterías del comportamiento de prueba que abarcan muchos ámbitos para la detección de la importancia del comportamiento de los genes. La batería de pruebas requiere varias semanas para completar. Durante el período de prueba, las jaulas de ratones se mantienen en un estante en nuestras instalaciones. Si los ratones son transportados a nuestro laboratorio de otras instituciones, que están habituados al medio ambiente de nuestras instalaciones por lo menos durante una semana. Después del período de habituación, los ratones son sometidos a un chequeo médico general y neurológico de detección (Miyakawa et al., 2003), y después de estos exámenes sencillos, los ratones son sometidos a la prueba de la transición de luz / oscuridad. La prueba se realiza en una habitación a prueba de sonido experimental a los 30 minutos de habituación a la sala experimental, como se muestra en la película.

Hemos evaluado más de 60 cepas de ratones mutantes modificados genéticamente mediante el protocolo se muestra en la película y tiene un gran conjunto de datos en bruto para más de 3.000 ratones (incluidos de tipo salvaje y ratones mutantes). Se realizaron análisis de los factores para tomar ventaja de la gran cantidad de datos en bruto. De hecho, se han detectado diversos factores de cada prueba (datos no publicados), aunque hubo algunas correlaciones significativas entre los índices (datos no publicados) .. Esos datos serán divulgados como parte de una base de datos pública que ahora estamos construyendo.

En nuestra batería de pruebas, de tipo salvaje camada suelen ser utilizados como control. Como una cepa de fondo, los ratones C57BL/6J se utilizan comúnmente. Se recogieron los datos de los ratones C57BL/6J utilizó como control de ratones mutantes en la batería de pruebas. Los índices obtenidos de ratones C57BL/6J en nuestra prueba de la transición de luz / oscuridad fueron como sigue (n = 795; media ± SEM), la distancia recorrida: 846.5 8,88 cm en la cámara de luz, 1478,5 9,53 cm en la cámara oscura, la duración del tiempo pasado : 215,8 1,85 s en la luz, 395,8 1,86 s en la oscuridad, el número de transiciones entre los compartimientos: 30,52 0,43; latencia para entrar en la cámara de luz: 64,94 2,40 s. Movimiento de los ratones alrededor de las entradas a las cámaras es detectado por la cámara y se cuenta como tiempo de permanencia en los cHambers. Debido a esto, la suma de la duración media del tiempo dedicado a la luz y que en los compartimentos de oscuridad fue mayor que el de toda la duración de la prueba (600 s).

En nuestro protocolo, un ratón se coloca primero en la cámara oscura. Tres segundos después de colocar el ratón en la cámara oscura, la puerta entre las cámaras de forma automática se abre y el ratón se puede mover libremente entre las dos cámaras. Ratones C57BL/6J pasar menos tiempo en la cámara de luz que en la cámara oscura (p <0,0001, la duración si el tiempo dedicado a la luz: 215,8 1,85 s, la duración del tiempo pasado en la oscuridad: 316,3 2,11 s [el tiempo transcurrido en la oscuridad se no incluye el tiempo inicial dedicado a la oscuridad antes de entrar en la cámara de la luz por primera vez], n = 795, a la par-t test). Esto indica que los ratones C57BL/6J tienden a evitar la cámara de luz, y que el tiempo empleado en la luz es un buen índice de la ansiedad-como comportamiento.

Los resultados obtenidos de las distintas cepas de ratones mutantes son fácilmente comparables, porque todos los datos se han obtenido utilizando el mismo protocolo. Para obtener resultados fenotipo de una cepa de ratones mutantes que pueden reproducirse fácilmente y en comparación con los datos de otros mutantes, los métodos de ensayo de comportamiento debe ser lo más parecido posible entre los laboratorios. Crabbe y sus colegas evaluaron la interacción entre el comportamiento del ratón y el medio ambiente de laboratorio utilizando exactamente las mismas cepas puras y una cepa mutante nulo. En su estudio, los aparatos, protocolos de prueba, y muchas otras variables ambientales fueron rigurosamente estandarizado. A pesar de la estandarización, se encontraron diferencias sistemáticas en el comportamiento a través de los laboratorios, aunque también se detectaron diferencias de tensión en todos los comportamientos (Crabbe et al., 1999). Se informó de que las variables incontrolables y caracterización de los experimentos mutantes pueden producir resultados que son idiosincrásicos a un laboratorio particular. Las diferencias de procedimiento que existe entre los laboratorios hacen que sea difícil de replicar o comparar los resultados entre laboratorios. Aquí, presentamos nuestro protocolo de la prueba de la transición de luz / oscuridad como una película para que los detalles del protocolo se puede demostrar.

El establecimiento de la documentación visual del protocolo facilitará una mejor comprensión de los detalles de los procedimientos experimentales, lo que permite la estandarización de los protocolos utilizados en laboratorios y para la comparación de los fenotipos del comportamiento de las distintas cepas de ratones mutantes evaluó a través de esta prueba. Películas de otros protocolos, como por el laberinto elevado, además, prueba de campo abierto, Porsolt prueba de natación forzada, el condicionamiento del miedo, que utilizamos en nuestra batería de pruebas de comportamiento se están haciendo actualmente para su publicación en futuros artículos de revistas de vídeo.