Ljus / mörk Transition Test för möss

Summary

Den ljust / mörkt övergången test är en av de mest använda testerna för att mäta ångest-liknande beteende hos möss. Här presenterar vi en film som visar detaljerade förfaranden för hur vi genomför testet.

Abstract

Även om alla de sekvenser musens arvsmassa har fastställts, vi ännu inte vet de funktioner som de flesta av dessa gener. Gene inriktning tekniker, kan dock användas för att ta bort eller manipulera en specifik gen hos möss. Inverkan av en viss gen på ett visst beteende kan sedan bestämmas genom att genomföra beteendemässiga analyser av den muterade möss. Som ett test för beteende-fenotypning av muterade möss, är den ljus / mörker övergång testa en av de mest använda testerna för att mäta ångest-liknande beteende hos möss. Testet är baserat på naturliga motvilja hos möss till ljust upplysta områden och på deras spontana undersökande beteende i nya miljöer. Testet är känsligt för ångestdämpande läkemedelsbehandling. Apparaten består av en mörk kammare och ett starkt upplyst kammare. Möss får röra sig fritt mellan de två kamrarna. Antalet inträden i ljusa kammaren och hur länge tid finns indikationer på ljusa rymd ångest hos möss. För att få fenotypning resultaten av en stam av muterade möss som lätt kan reproduceras och jämföras med andra mutanter, bör beteendemässiga testmetoder vara så identiska som möjligt mellan laboratorier. De processuella skillnader som finns mellan laboratorier dock göra det svårt att replikera eller jämföra resultaten mellan laboratorier. Här presenterar vi våra protokoll för ljus / mörker övergången testet som en film så att uppgifter i protokollet kan påvisas. I vårt laboratorium har vi bedömt mer än 60 stammar av muterade möss använder protokollet som visas i filmen. Dessa uppgifter kommer att rapporteras som en del av en offentlig databas som vi nu bygger.

Visualisering av protokollet kommer att underlätta förståelsen av detaljerna i hela experimentella förfarande, vilket möjliggör standardisering av de protokoll som används över laboratorier och jämförelser av de beteendemässiga fenotyper av olika stammar av muterade möss utvärderas med hjälp detta test.

Protocol

1. Den apparat som används för ljus / mörker övergång testet bestod av en bur (21x42x25 cm) uppdelad i två sektioner av samma storlek med en mellanvägg med dörr (Ohara & Co, Tokyo).
2. Möss är inrymt 3:57 per bur i ett rum med en 12 tim ljus / mörker-cykel (lampor på kl 7:00) med ad lib tillgång till mat och vatten. Helst två kontroller och två mutanter inhyst tillsammans, genom att omorganisera de möss så snart de är genotypas vid tiden för avvänjning. Behavioral tester utförs från 9:00 till 6:00 Alla burarna innehåller möss överförs till beteendet testning rummet 30 minuter innan den första rättegången inleds.
3. Ett kammaren är klart upplyst av vita dioder (390 lux), medan den andra kammaren är mörkt (2 lux). Möss placeras i den mörka sidan och dörren öppnas automatiskt 3 sekunder efter att musen identifieras av värmekamera. Dörren används så att mössen inte kommer in i ljuset kammaren omedelbart efter släppet med deras motivation att fly från försöksledaren, eftersom latens att gå in i ljuset kammaren kan tjäna som ett index av ångest-liknande beteende.
4. Möss får röra sig fritt mellan de två kamrarna med dörren öppen i 10 min. Det program som används för att förvärva och analysera beteendemässiga data (Bild LD4) bygger på det offentliga området Image J-programmet (utvecklad byWayne Rasband vid National Institute of Mental Health och finns på http://rsb.info.nih.gov/ij /), som ändrades genom Tsuyoshi Miyakawa (tillgänglig via O'Hara & Co, Tokyo, Japan).
5. Sträckan i varje kammare, det totala antalet övergångar, tillbringade tiden i varje kammare, och latens in ljuset chamberare registreras av Image LD4 programmet.
6. Efter varje försök, alla kammare rengörs med super hypochlorous vatten för att förhindra en bias baserat på lukt ledtrådar.

Discussion

Även om alla de sekvenser musens arvsmassa har fastställts, är de funktioner de flesta av dessa gener inte känd. Gene inriktning tekniker, kan dock användas för att ta bort eller manipulera en specifik gen hos möss (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004.). Inverkan av en viss gen på ett visst beteende kan sedan bestämmas genom att genomföra beteendemässiga analyser av den muterade möss (Takao och Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Som ett test för beteende-fenotypning av muterade möss, är den ljus / mörker övergång testa en av de mest använda testerna för att mäta ångest-liknande beteende hos möss (Crawley, 2000). Testet är baserat på naturliga motvilja hos möss till ljust upplysta områden och på deras spontana undersökande beteende i nya miljöer (Crawley, 1985). Testet är känsligt för ångestdämpande missbruksbehandling (Crawley, 1985). Apparaten består av en mörk kammare och ett starkt upplyst kammare. En begränsad öppning, 3 cm hög med 5 cm bred, förbinder de två kamrarna. Möss får röra sig fritt mellan de två kamrarna. Antalet inträden i ljusa kammaren och hur länge tid det används som index för ljus och rymd ångest hos möss.

Det ljus / mörker övergången testet utvecklades ursprungligen av Crawley och kollegor (Crawley och Goodwin, 1980). Det finns två skillnader mellan den ursprungliga versionen och vårt test. För det första är ljus kammaren större än den mörka kammare i den ursprungliga versionen, medan storleken på de två kamrarna är densamma i vår version av testet. För det andra, i den ursprungliga versionen hade ljuset kammare inget tak och väggarna i ljuset kammaren var transparent (Crawley och Goodwin, 1980), medan vi använder ogenomskinlig vit plast för tak och väggar av ljuset kammaren. Dessa skillnader, nämligen stora och öppna ljuset kammare möjliggöra samtidig detektion av ljus och rymd ångest samt öppen yta ångest i den ursprungliga versionen av testet. I vårt laboratorium är dock öppen rymd ångest-liknande beteende hos möss testas i en förhöjd plus labyrint. Den ogenomskinliga väggar och tak, storlek ljuset kammaren och våra specifika ljus / mörker övergången testprotokoll är mer specialiserade för att upptäcka ljus och rymd ångest jämfört med den ursprungliga versionen.

Även om ljus / mörker övergången test och förhöjda plus labyrint är både används för att bedöma ångest-liknande beteende, resultaten är inte alltid konsekvent. Till exempel framhjärnan-specifika kalcineurin knockoutmöss spendera en minskad mängd tid i ljuset kammare i ljus / mörker övergången test, men en ökad mängd tid i öppna armar i högt plus labyrint (Miyakawa et al., 2003) . Vi antar att vårt ljus / mörker övergången test och förhöjda plus labyrint tester utvärdera olika aspekter av ångest-liknande beteende, såsom ljus och rymd ångest och öppen rymd ångest-liknande beteende. För att testa denna hypotes använde vi en stor uppsättning data som samlas in med samma möss i båda testerna. I vårt laboratorium utför vi beteendemässiga testbatterier täcker många områden för att screena för beteendemässiga betydelsen av gener. Testet Batteriet behöver flera veckor att slutföra. Under testperioden, är mus burar hålls på galler i vår anläggning. Om möss transporteras till vårt laboratorium från andra institutioner, de är vana vid miljön i vår anläggning i minst en vecka. Efter tillvänjning perioden, möss utsätts för en allmän hälsokontroll och neurologiska screening (Miyakawa et al., 2003), och efter dessa enkla undersökningar, är möss utsätts för ljus / mörker övergången test. Testet utförs i ett ljudisolerat testrummet efter 30 min för tillvänjning till testrummet, som visas i filmen.

Vi har utvärderat mer än 60 stammar av genetiskt modifierade muterade mössen använder protokollet som visas i filmen och har en stor uppsättning av rådata för mer än 3000 möss (inklusive vildtyp och muterade möss). Vi har genomfört faktoranalys för att dra nytta av den stora uppsättning av rådata. I själva verket upptäckte vi olika faktorer från varje test (opublicerade data), även om det fanns några signifikanta korrelationer mellan index (opublicerade data) .. Dessa uppgifter kommer att rapporteras som en del av en offentlig databas som vi nu bygger.

I vårt test batteri, är vildtyp kullsyskon vanligtvis används som en kontroll. Som en bakgrund stam, är C57BL/6J möss används ofta. Vi samlade in data för C57BL/6J möss används som en kontroll av muterade mössen i testet batteriet. Indexen från C57BL/6J möss i våra ljus / mörker övergången testet var följande (n = 795, medelvärde SEM), tillryggalagd sträcka: 846,5 8,88 cm i ljuset kammaren, 1478,5 9,53 cm i den mörka kammare, varaktighet tid : 215,8 1,85 s i ljuset, 395,8 1,86 s i mörkret, antal övergångar mellan fack: 30,52 0,43; latens att gå in i ljuset kammaren: 64,94 2,40 s. Förflyttning av möss runt ingångarna till kamrarna upptäcks av kameran och räknas som tiden i både Chambers. På grund av detta spenderade summan av de genomsnittliga tiden för tid i ljuset och att i mörka utrymmen som var större än hela den tid som testet (600 s).

I våra protokoll är en mus först släpptes ut i mörkret kammaren. Tre sekunder efter att placera musen i den mörka kammaren, öppnar dörren mellan kamrarna automatiskt och musen kan röra sig fritt mellan de två kamrarna. C57BL/6J möss spendera mindre tid i ljuset kammaren än i den mörka kammaren (p <0,0001, tid om tiden i ljus: 215,8 1,85 s, längd tiden i mörkret: 316,3 2,11 s [tiden i mörkret inte omfattar inte den första tiden i mörkret före inträde ljuset kammare för första gången], n = 795, parade t-test). Detta tyder på att C57BL/6J möss tenderar att undvika ljus kammare, och att den tid i ljuset är ett bra index för ångest-liknande beteende.

De resultat som erhålls från olika stammar av muterade möss är lätt att jämföra, eftersom alla data som erhålls genom att använda samma protokoll. För att få fenotypning resultaten av en stam av muterade möss som lätt kan reproduceras och jämföras med data från andra mutanter bör beteendemässiga testmetoder vara så identiska som möjligt mellan laboratorier. Crabbe och kollegor testade samspelet mellan mus beteende och laboratoriemiljö med hjälp av exakt samma inavlade stammar och en null mutant stam. I deras studie var apparater, testprotokoll, och många miljövariabler rigoröst standardiserade. Trots standardisering, fann de systematiska skillnader i beteende mellan laboratorier, även om de också upptäckt stam skillnader i alla beteenden (Crabbe et al., 1999). De rapporterade att okontrollerbara variabler och experiment karakteriserar mutanter kan ge resultat som är idiosynkratiska till ett visst laboratorium. De processuella skillnader som finns mellan laboratorier gör det svårt att replikera eller jämföra resultaten mellan laboratorier. Här presenterar vi våra protokoll för ljus / mörker övergången testet som en film så att uppgifter i protokollet kan påvisas.

Etablera visuell dokumentation av protokollet kommer att underlätta bättre förståelse för detaljerna i experimentella förfaranden som medger en standardisering av de protokoll som används över hela laboratorier och för jämförelser av beteendemässiga fenotyper av olika stammar av muterade möss utvärderas med hjälp detta test. Filmer av andra protokoll, exempelvis för förhöjt plus labyrinten, öppet fält test porsolt tvingas simma testa, rädsla konditionering, som vi använder i vårt beteende testbatteri för närvarande görs för publicering som framtida artiklar video dagbok.