Overview
Source: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unité de lymphpoiesis, Département d'immunologie, Institut Pasteur, Paris, France
2 INSERM U1223, Paris, France
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, France
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Institut Pasteur, Paris, France
Le cycle cellulaire est un processus universel de vie. Pendant le cycle cellulaire, une cellule subit plusieurs modifications pour se diviser en deux cellules filles. Ce mécanisme se produit tout au long de la vie d'un organisme en réponse à ses besoins. Les divisions cellulaires et le développement embryonnaire produisent un organisme complet à partir d'un zygote unicellulaire. À l'âge adulte, le cycle cellulaire est au cœur de nombreux processus biologiques critiques, tels que la réparation des tissus.
Les mécanismes de division cellulaire sont des événements étroitement contrôlés où la cellule subit des modifications progressives avant la division finale. Les cellules qui ne sont pas encore dans le cycle sont décrites comme étant dans la phase gap 0 (G0). Pendant cette étape, la cellule est considérée comme quiescente. Lorsque la cellule commence à cycle, quatre phases distinctes sont reconnues: Gap 1 (G1), Synthèse (S), Gap 2 (G2) et Mitose (M). La phase G1 est un point de contrôle des ressources nécessaires à la synthèse de l'ADN par la cellule. Ensuite, la phase S se produit, et la réplication de l'ADN commence, suivie par l'interphase G2, un autre point de contrôle qui contrôle tous les éléments nécessaires pour que la cellule se divise. Enfin, la cellule entre dans la mitose et se divise en deux cellules filles.
La division cellulaire est un paramètre très instructif dans de nombreux systèmes biologiques différents. Dans le domaine de l'immunologie, l'analyse de la prolifération des leucocytes peut indiquer le mécanisme de la réponse immunitaire. D'autres domaines d'investigation reposent également sur l'analyse du cycle cellulaire. Par exemple, l'analyse du cycle cellulaire pendant le développement de tumeur a amélioré notre compréhension du cancer.
De nombreux colorants fluorescents sont maintenant disponibles pour suivre la prolifération cellulaire. Ces colorants diffèrent dans leurs propriétés chimiques et spectrales. Deux classes différentes de colorants existent : les colorants protéiques se combinent en permanence avec les protéines en formant un lien covalent, et les colorants membranaires s'intercalent de façon stable dans les membranes cellulaires par l'intermédiaire de fortes associations hydrophobes. Les études in vitro et in vivo de la prolifération des cellules immunitaires par cytométrie du flux sont parmi les applications les plus courantes des deux classes de colorants de suivi cellulaire (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) est un colorant fluorescent qui marque les cellules qui divisent. Au départ, toutes les cellules reçoivent la même quantité de colorant; les cellules de division divisent uniformément le colorant qu'elles ont reçu entre leurs deux cellules de fille. Par conséquent, le cycle cellulaire peut être suivi par la diminution progressive de l'intensité des colorants dans les cellules. La coloration CFSE est suivie d'une cytométrie multiparamétrique conventionnelle, une technologie à haut débit à base de fluorescence qui permet une caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules en fonction de leur degré de coloration CFSE (3).
Dans l'expérience suivante, nous évaluons la prolifération des cellules CD4et CD8et T in vitro,après stimulation CD3, en utilisant la cytométrie de coloration et de flux de cfSE.
Procedure
1. Préparation
- Avant de commencer, enfilez des gants de laboratoire et les vêtements de protection appropriés.
- Stériliser tous les outils de dissection, d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis les essuyer soigneusement.
- Préparer 50 ml de la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 % de sérum fœtal de veau (FCS).
2. Dissection
- À l'aide d'un système de distribution de dioxyde de carbone, euthanasiez la souris par hypoxie. Fixez la souris euthanasiée sur une plaque de dissection en position de supine et effectuez une laparotomie longitudinale à l'aide de ciseaux et de forceps.
- À l'aide de forceps, déplacez les intestins et l'estomac sur le côté droit de l'abdomen pour exposer l'estomac et la rate. La rate est attachée à l'estomac.
- À l'aide de forceps, détachez soigneusement la rate de l'estomac et placez-la dans le plat Petri contenant 5 ml de HBSS 2% FCS.
3. Isolement des cellules immunitaires
- Déposer la rate sur une passoire cellulaire de 40 m sur le même plat Petri. Écraser la rate avec un piston pour la dissocier.
- Transférer la rate dissociée et le liquide dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
- Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
- Resuspendre la pastille dans 2 ml d'acétate de potassium pour lyser les érythrocytes. Attendez 2 min, puis faites le volume jusqu'à 15 ml à l'aide de HBSS 2% FCS.
- Centrifuger le tube à nouveau à 370 x g pendant 7 min à 10oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de HBSS 2% FCS.
- Comptez les cellules à l'aide d'un test de coloration bleu trypan et ajuster la concentration cellulaire finale à 107 cellules/mL en utilisant un volume approprié de HBSS 2% FCS.
4. Staining CFSE et stimulation des lymphocytes T
- Distribuer 107 cellules de rate isolées/tube dans 4 tubes (tubes de 15 ml, étiquetés 1 à 4)
- Ajouter 3 mL HBSS 2%FCS à chaque tube.
- Ajouter 1 oL de CSFE dans chaque tube (concentration finale - 5 M).
- Incuber les tubes à 37oC dans un incubateur de CO2 de 5% pendant 10 min.
- Dans les tubes 3 et 4, ajouter 12 ml d'anticorps HBSS 2% FCS et anti-CD3 à une concentration finale de 2,5 g/mL. Les tubes 3 et 4 sont stimulés à l'aide d'anticorps anti-CD3, afin d'observer l'effet sur le cycle cellulaire.
- Dans les tubes 1 et 2 ajouter 12 ml de HBSS 2% FCS. Les cellules des tubes 1 et 2 ne seront pas stimulées.
- Centrifugetous les tubes à 370 x g pendant 7 min à 10oC. Jetez les supernatants.
- Resuspendre les granulés dans 2 ml de HBSS 2%FCS.
- Transférer les solutions résultantes dans des puits séparés sur une plaque de 6 puits.
- Incuber les cellules à 37oC, 5% de CO2 pendant 3 jours.
5. Staining cellulaire
- Le jour 3, ajouter 2 mL HBSS 2%FCS en puits 1 et 3.
- Pipet vigoureusement et transférer les échantillons dans 5 mL de tubes FACS.
- Continuer à couver les cellules restantes des puits 2-4 à 37oC, 5% CO2. Ils seront analysés le jour 5 pour étudier les effets à long terme de la stimulation sur le cycle cellulaire.
- Centrifuger les tubes à 370 x g pendant 7 min à 10oC. Jetez les supernatants.
- Ajouter 100 l de mélange d'anticorps (voir tableau 1) à chaque tube.
| anticorps | Fluorochrome | dilution |
| CD3 (en) | Bleu du Pacifique | 1/100 |
| CD4 (en) | BV786 (en anglais seulement) | 1/1600 |
| CD8 (en) | Pe | 1/400 |
| Thy1.2 (en) | BV605 (en anglais seulement) | 1/400 |
Tableau 1 : Composition du mélange d'anticorps. Quatre préparations de cocktail d'anticorps utilisant les conjugates concentrés d'anticorps-fluorescents et HBSS.
- Incuber les tubes pendant 20 min sur glace dans l'obscurité.
- Ajouter 1 ml de HBSS 2%FCS et centrifuger les tubes à 370 x g pendant 7 min à 10oC.
- Jetez le supernatant et suspendez les granulés dans 200 L de HBSS 2% FCS.
- Transférer les granulés resuspendus dans de nouveaux tubes FACS étiquetés.
- Évaluer la prolifération des lymphocytes T à l'aide de FACS.
- Le jour 5, répétez le processus de coloration cellulaire avec les cellules des deux puits restants de la plaque de 6 puits.
6. Analyse des données
- Ouvrez le logiciel "FlowJo" et faites glisser les fichiers dans la fenêtre "All sample".
- Double clic sur le fichier pour les cellules non stimulées recueillies le jour 3 pour afficher une parcelle de point avec la diffusion vers l'avant sur l'axe Y et la diffusion latérale sur l'axe X.
- Cliquez sur "Polygone" et créez une stratégie de gating pour sélectionner les cellules lymphoïdes, Thy1.2et CD3et distinguer lescellules CD4 et CD8 (voir Figure 1).
Figure 1 : Stratégie de gating. Les cellules sont d'abord fermées en fonction de leur morphologie (à gauche : FSC-A, SSC-A). Les lymphocytes T sont ensuite fermés (au milieu : CD3, Thy1.2) et ensuite divisés sur les lymphocytes CD4et T (orange) et CD8et T (bleu) (à droite : CD4, CD8). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Répétez les étapes avec d'autres fichiers.
- Pour déterminer les fréquences de division et de non-division des cellules, visualisez d'abord les populations cellulaires en cliquant sur «Rédacteur en chef».
- Faites glisser les lymphocytes T CD4 et les lymphocytes T CD8 de chacun des quatre tubes à la «fenêtre de l'échantillon»
- Des graphiques représentant chaque population apparaîtront.
- Utilisez l'histogramme pour visualiser les résultats et sélectionnez «CFSE» comme paramètre pour la comparaison des différents tubes et des différentes populations.
- Les cellules non-divisantes maintiennent des niveaux plus élevés de CFSE, tandis que les cellules proliférantes divisent le contenu de CFSE en cellules de division
- Créez une porte sur les cellules non-divisantes et appliquez-la dans tous les tubes.
- Créez une porte sur les cellules de division et appliquez-la dans tous les tubes.
- Pour examiner la fréquence de la division des cellules CD3, cliquez sur «Editeurde table ».
- Faites glisser les populations d'intérêt - en divisant les lymphocytes T CD8 et en divisant les lymphocytes T CD4 - en «Tableau».
- Sur le menu "Statistique", sélectionnez "fréquence des lymphocytes T", puis cliquez sur " Createtable" pour révéler la fréquence dans une nouvelle table.
- Cliquez sur "Créer la table". Pour révéler les valeurs de fréquence, affichez-vous sur une nouvelle table.
Pour la plupart des études d'immunologie, la mesure de la prolifération des cellules immunitaires est une étape clé et la méthode à base de colorant fluorescent CFSE est couramment utilisée. La division cellulaire appropriée est importante pour les cellules immunitaires car elle régule à la fois les niveaux et la spécificité d'une réponse immunitaire. Par exemple, les lymphocytes T prolifèrent pour identifier et tuer les cellules cancéreuses et les cellules B subissent une division cellulaire pour produire des anticorps spécifiques. La prémisse générale de l'analyse CSFE consiste à tacher les cellules avec le colorant fluorescent vert CFSE, qui pénètre dans les cellules vivantes et se lie de façon stable aux protéines à l'intérieur, ce qui entraîne un étiquetage permanent. Par conséquent, lorsque la cellule parente contenant de la teinture se divise, chaque cellule de fille obtient la moitié de la fluorescence de la cellule parente.
Ce processus se poursuit dans les divisions suivantes avec l'intensité de colorant diminuant progressivement avec chaque division. Au point d'extrémité souhaité, l'intensité de fluorescence de chaque cellule est mesurée par cytométrie de flux. Ces données sont ensuite utilisées pour quantifier le nombre et le modèle des divisions que les cellules ont vécues. Comme le montre ici, la population cellulaire avec la fluorescence la plus élevée est de la génération parente. La deuxième plus haute appartient à la deuxième génération et ainsi de suite. Le nombre de pics détermine le nombre de divisions cellulaires.
En outre, si des cellules immunitaires primaires sont utilisées, des populations cellulaires spécifiques, comme les lymphocytes T par exemple, peuvent être étiquetées avec un colorant de fluorescence de couleur différente avec CFSE, et simultanément identifiées à l'aide de la cytométrie multicolore. Les nouvelles données peuvent être tracées sur le même graphique, montrant maintenant la sous-population de lymphocytes T avec différentes intensités de coloration CFSE, par laquelle le taux de prolifération des lymphocytes T peut être spécifiquement analysé. Cette vidéo démontre le protocole pour la coloration CFSE des splenocytes de souris, qui sont stimulés avec un anticorps anti-CD3. Ceci est suivi par la coloration pour étiqueter les lymphocytes T et la cytométrie de flux pour suivre leur prolifération cellulaire.
Pour commencer, enfilez des vêtements de protection et des gants de laboratoire appropriés. Ensuite, lavez une paire de forceps et disséquez les ciseaux d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis essuyez-les avec un essuie-tout propre. Préparer 50 millilitres de Hank's Balanced Salt Solution, ou HBSS, avec une concentration de 2% de sérum fœtal de veau, ou FCS, en combinant un millilitre de FCS avec 49 millilitres de HBSS dans un tube de 50 millilitres. Mélanger en pipeting doucement la solution vers le haut et vers le bas environ 10 fois. Ensuite, isolez les cellules de la rate de souris comme démontré dans le protocole vidéo pour l'isolement FACS des lymphocytes B spléniques.
Étiquetez quatre tubes de 15 millilitres un à quatre et ajoutez une fois 10 aux septièmes cellules de rate isolées. Ensuite, ajoutez trois millilitres de HBSS 2% FCS à chaque tube. Ensuite, pipette un microlitre de cinq micromolar carboxyfluorescein succinimidyl ester, ou CFSE, dans chaque tube. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % pendant 10 minutes. Les cellules dans les tubes un et deux ne seront pas stimulées. Ils seront utilisés pour révéler le niveau basal de prolifération des lymphocytes T CD4 et CD8.
Pipette 10 millilitres de HBSS 2% FCS dans ces tubes. Les tubes trois et quatre seront stimulés par des anticorps anti-CD3 afin d'observer les effets sur le cycle cellulaire. Ajouter 10 millilitres de HBSS 2% FCS et anti-CD3 anticorps à une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre aux tubes trois et quatre. Ensuite, centrifuger tous les tubes à 370 x g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius. Jetez les supernatants. Resuspendre les granulés en deux millilitres de HBSS 2% FCS et pipette les solutions résultantes en puits séparés sur une plaque de six puits. Étiquetez soigneusement la plaque de un à quatre pour garder une trace des identités de l'échantillon. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de CO2 pendant trois jours.
Le troisième jour, ajouter deux millilitres de HBSS 2% FCS aux puits un et trois, qui devraient contenir les cellules des tubes un et trois. Pipette de haut en bas vigoureusement, puis transférer les échantillons dans les tubes étiquetés de cinq millilitres FACS. Remettre la plaque de six puits dans l'incubateur. Ces cellules restantes des puits deux et quatre seront analysées le cinquième jour pour étudier les effets à long terme de la stimulation sur le cycle cellulaire. Centrifuger les tubes à 370 x g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis jeter les supernatants. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de mélange d'anticorps à chaque tube. Incuber les tubes pendant 20 minutes sur la glace dans l'obscurité. Ensuite, ajoutez un millilitre de HBSS 2% FCS à chaque tube et centrifugez les tubes à 370 x g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius. Jetez les supernatants. Resuspendre les granulés dans 200 millilitres de HBSS 2% FCS et bien mélanger. Transférer les granulés resuspendus sur de nouveaux tubes FACS étiquetés.
Ensuite, évaluez la prolifération des lymphocytes T à l'aide de la cytométrie du débit, comme le montre le protocole FACS. Portez les cellules pour sélectionner les cellules lymphoïdes CD3-positives et pour distinguer les cellules CD4-positives et CD8-positives, et enregistrez les données pour des tubes un et trois. Le cinquième jour, répétez le processus de coloration cellulaire avec les cellules des deux puits restants de la plaque de six puits.
Nous analyserons les effets de la stimulation CD3 sur le cycle cellulaire des cellules CD4 et CD8-positives à trois jours et cinq jours après la stimulation. Pour commencer, cliquez sur l'icône FlowJo et faites glisser vos fichiers dans la fenêtre All Sample. Double-cliquez sur le fichier pour les cellules non stimulées recueillies le troisième jour pour afficher une parcelle de point avec la diffusion vers l'avant sur l'axe y et la diffusion latérale sur l'axe x. Cliquez sur le polygone pour faire le tour des populations de lymphocytes en fonction de leur morphologie. Dans la fenêtre d'identification des sous-populations, nommez les lymphocytes de la population et cliquez sur OK. Ensuite, double-cliquez sur la population encerclée et dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Thy1.2 sur l'axe y et CD3 sur l'axe x. Ensuite, cliquez sur le polygone pour encercler les cellules CD3 et Thy1.2 double positif. Dans la nouvelle fenêtre d'identification des sous-populations, nommez la population T-Cells et cliquez sur OK. Ensuite, double-cliquez sur la population encerclée. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez CD4 sur l'axe y et CD8 sur l'axe x. Ensuite, cliquez sur le polygone pour encercler la population positive au CD4. Dans la nouvelle fenêtre d'identification des sous-populations, nommez la population CD4 T-Cells et cliquez sur OK. Maintenant, cliquez sur le polygone pour encercler la population positive au CD8. Dans la nouvelle fenêtre d'identification des sous-populations, nommez la population CD8 T-Cells et cliquez sur OK. Répétez ces étapes avec les autres fichiers.
Pour déterminer les fréquences de division et de non-division des cellules, d'abord, visualisez les populations cellulaires en cliquant sur Layout Editor. Ensuite, faites glisser les lymphocytes T CD4 et Les lymphocytes T CD8 de chacun des quatre tubes à la fenêtre All Sample. Des graphiques représentant vos populations apparaîtront. Pour chaque tube, cliquez en double sur la parcelle de points pour les lymphocytes T CD8 et sélectionnez Histogramme sous définition graphique pour visualiser les résultats. Sélectionnez LE CFSE comme paramètre pour comparer les populations de cellules stimulées par rapport aux populations cellulaires non stimulées à chaque moment. Les cellules non-divisantes maintiennent des niveaux plus élevés de CFSE tandis que les cellules proliférantes divisent le contenu de CFSE en cellules de division.
Maintenant, tout en appuyant sur la touche Shift, double-cliquez sur l'histogramme. Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur la plage et sélectionnez la plage de CFSE correspondant au pic le plus élevé. Dans la fenêtre d'identification des sous-populations, nommez la population Non-Diviser les lymphocytes T CD8 et étiquetez la population Diviser les cellules CD8. Maintenant, répétez pour sélectionner les lymphocytes T CD4 de division et de non-division dans chaque tube. Pour examiner la fréquence de la division des cellules CD3-positives, cliquez sur L'éditeur de table. Ensuite, faites glisser les populations d'intérêt, en divisant les lymphocytes T CD8 et en divisant les lymphocytes T CD4, dans la table. Sur le menu Statistique, sélectionnez Fréquence des lymphocytes T. Ensuite, cliquez sur Créer la table pour révéler la fréquence dans une nouvelle table.
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Results
Dans cette expérience, nous avons suivi la prolifération des cellules Splénic CD4et CD8t dans la culture in vitro. Après 3 jours, nous n'avons pas vu la prolifération forte dans les deux CD4et CD8- cellules T avec ou sans stimulation. C'est ce que l'on peut voir sur le panneau supérieur de la figure 2 où les pics de CSFE ne diminuent pas. Cependant, après 5 jours, nous avons commencé à voir une prolifération dans les deux populations, ce qui est évident à la suite de la diminution des pics Du CSFE (panneaux de fond, figure 2). La coloration de CFSE, démontre clairement que les deux cD4et CD8- lymphocytes T se divisait plus après stimulation. En outre, les lymphocytesT CD8 semblaient être légèrement plus proliférants que les lymphocytesT CD4 après 5 jours de stimulation.
Figure 2 : prolifération des lymphocytes T CD4 par rapport à la prolifération des lymphocytes T CD8. Prolifération des lymphocytes T au jour 3 (panneau supérieur) et au jour 5 (panneau inférieur). Le cycle cellulaire est comparé entre les lymphocytes T CD4 et CD8 avec ou sans stimulation à deux jours différents. Les lymphocytes T CD4 et CD8 prolifèrent davantage lorsqu'ils sont stimulés. Les lymphocytes T stimulés Par le CD8 prolifèrent plus que les lymphocytes T stimulés par le CD4 au jour 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Applications and Summary
Les tests de prolifération sont souvent utilisés dans différents domaines tels que l'immunologie pour déterminer le degré d'activation des cellules. Il est également effectué dans le diagnostic d'oncologie pour déterminer l'agressivité de tumeur dans les patients. La coloration CFSE est une technique utile pour suivre la prolifération des populations de cellules immunitaires au fil du temps. D'autres méthodes permettent la caractérisation du cycle cellulaire. BrdU, un équivalent de CFSE est incorporé seulement dans les cellules de division. Le modèle récent de souris Fucci permet même la détection des phases de cycle cellulaire, sans coloration supplémentaire.
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References
- Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
- Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
- Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).
