Overview
ソース: パーチェットティボー1,2,3, ムニエ・シルヴァン1,2,3, ソフィー・ノヴォールト 4, レイチェル・ゴルブ1,2,3
リンパ症のための1ユニット、免疫学科、パスツール研究所、パリ、フランス
2 INSERM U1223, パリ, フランス
3ユニバーシテ パリ ディデロ, ソルボンヌ パリ シテ, セルレ パストゥール, パリ, フランス
4フローサイトメトリープラットから, サイトメトリーとバイオマーカー UtechS, 翻訳科学センター, パスツール研究所, パリ, フランス
細胞周期は生命の普遍的なプロセスである。細胞周期の間に、細胞は2つの娘細胞に分割するためにいくつかの変更を受ける。このメカニズムは、そのニーズに応じて生物の寿命を通じて発生します。細胞分裂と胚発生は、単細胞のザイゴットから完全な生物を産生する。成人期には、細胞周期は、組織修復などの多くの重要な生物学的プロセスの中心となる。
細胞分裂のメカニズムは、細胞が最終分割の前に段階的な改変を受けるイベントを厳密に制御される。サイクルにまだ存在しないセルは、ギャップ 0 (G0)位相にあるとして記述されます。この段階では、セルは静止と見なされます。細胞がサイクルを開始すると、ギャップ1(G1)、合成(S)、ギャップ2(G2)、および水戸症(M)の4つの異なる相が認識されます。G1相は、DNA合成のために細胞が必要とする資源のチェックポイントである。次いで、S相が発生し、DNA複製が開始され、続いてG2間相、細胞が分裂するために必要なすべての要素を制御する別のチェックポイントが続く。最後に、細胞は人芽細胞に入り、2つの娘細胞に分かれる。
細胞分裂は、多くの異なる生物学的システムにおいて非常に有益なパラメータである。免疫学の分野では、白球増殖の分析は、免疫応答のメカニズムを示すことができます。調査の他のドメインも細胞周期分析に依存しています。例えば、腫瘍発生時の細胞周期の解析により、がんに対する理解が深まりました。
多くの蛍光色素が細胞増殖を追跡するために利用可能になりました。これらの染料は、その化学的およびスペクトル特性が異なります。2つの異なるクラスの染料が存在する:タンパク質染料は、共生結合を形成することによってタンパク質と永久に結合し、膜染料は強い疎水性関連を介して細胞膜内で安定的にインターカレートする。インビトロおよびインビボ研究におけるフローサイトメトリーによる免疫細胞増殖は、細胞追跡染料(1、2)の両方のクラスの最も一般的な用途の一つである。
CFSE(カルボキシフルオレセインスクキシニミジルエステル)は、分裂細胞をマークする蛍光色素である。最初は、すべての細胞が同じ量の色素を受け取ります。細胞を分割すると、受け取った色素を2つの娘細胞の間で均等に分割します。その結果、細胞周期は、細胞内の色素強度の進行性の減少に続くことができる。CFSE染色は、従来のマルチパラメトリックフローサイトメトリー、CFSE染色の程度に基づいて細胞の発話的および機能的特性評価を可能にするハイスループット、蛍光ベースの技術が続きます(3)。
以下の実験では、CFSE染色およびフローサイトメトリーを用いて、CD3刺激後のCD4+およびCD8+T細胞のインビトロの増殖を評価した。
Procedure
1. 準備
- 始め始めの前に、実験室の手袋と適切な防護服を着用してください。
- すべての解剖ツールを殺菌し、まず洗剤で、次に70%のエタノールで乾燥させ、完全に拭き取ります。
- 2%の胎児子牛血清(FCS)を含むハンクのバランス塩溶液(HBSS)の50 mLを調調します。
2. 解剖
- 二酸化炭素送達システムを用いて、低酸素症でマウスを安楽死させる。サパンの位置の解剖プレート上で安楽死マウスを固定し、はさみと鉗子を使用して縦開腹術を行います。
- 鉗子を使用して、腹部の右側に腸と胃を動かして胃と脾臓を露出させる。脾臓は胃に付着している。
- 鉗子を使用して慎重に胃から脾臓を取り外し、HBSS 2%FCSの5 mLを含むペトリ皿に入れます。
3. 免疫細胞分離
- 脾臓を40μmのセルストレーナーの上に置き、同じペトリ皿の上に置きます。脾臓をプランジャーでつぶして解離します。
- 解離した脾臓と流体を15 mL遠心管に移します。
- チューブを10°Cで7分間370 x gで遠心し、ペレットを避けて上清を捨てます。
- 赤血球をlyseseにアセテートカリウムの2mLで再濁させる。2 分間待ってから、HBSS 2% FCS を使用して最大 15 mL の音量を構成します。
- 10°Cで7分間370 x gでチューブを再度遠心分離します。上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの5 mLでペレットを再懸濁します。
- トリパンブルー染色アッセイを使用して細胞をカウントし、HBSS 2%FCSの適切な体積を使用して、最終的な細胞濃度を107細胞/mLに調整します。
4. CFSE染色とT細胞刺激
- 107の単離された脾臓細胞/管を4つの管に分配する(15 mL管、標識1から4)
- 各チューブに 3 mL HBSS 2% FCS を追加します。
- 各チューブにCSFEの1 μLを加えます(最終濃度- 5 μM)。
- 5%CO2インキュベーターで37°Cのチューブを10分間インキュベートします。
- チューブ3および4では、2.5 μg/mLの最終濃度でHBSS 2%FCS+抗CD3抗体の12mLを添加する。チューブ3および4は、抗CD3抗体を用いて刺激され、細胞周期に及ぼす影響を観察する。
- チューブ1および2では、HBSS 2%FCSの12 mLを追加します。チューブ1および2内の細胞は刺激されない。
- 10°Cで7分間370 x gですべての管を遠心分離します。上清を捨てる。
- HBSS 2%FCSの2 mLでペレットを再中断します。
- 得られた溶液を6ウェルプレート上の別々のウェルに移します。
- 細胞を37°C、5%CO2で3日間インキュベートします。
5. 細胞染色
- 3日目に、ウェル1と3に2 mL HBSS 2%FCSを追加します。
- ピペットを活発に、サンプルを5 mL FACSチューブに移します。
- 37°Cでウェル2-4から残りの細胞をインキュベートし続けます, 5% CO2.彼らは、細胞周期に対する刺激の長期的な影響を調査するために5日目に分析されます。
- 10°Cで7分間370 x gで管を遠心分離します。上清を捨てる。
- 各チューブに100μLの抗体ミックス(表1参照)を追加します。
| 抗体 | フルオロクロム | 希釈 |
| CD3 | パシフィックブルー | 1/100 |
| CD4 | バンブ786 | 1/1600 |
| CD8 | Pe | 1/400 |
| Thy1.2 | BV605 | 1/400 |
表 1:抗体混合組成物。濃縮抗体蛍光コンジュゲートおよびHBSSを用いた4つの抗体カクテル製剤。
- 暗闇の中で氷の上で20分間チューブをインキュベートします。
- HBSS 2%FCSの1 mLを追加し、10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離します。
- 上清を廃棄し、HBSS 2% FCSの200 μLでペレットを再懸濁します。
- 再懸濁ペレットを新しいラベル付き FACS チューブに移します。
- FACSを用いてT細胞増殖を評価する。
- 5日目に、6ウェルプレートの残りの2つのウェルからの細胞と細胞染色プロセスを繰り返す。
6. データ分析
- "FlowJo"ソフトウェアを開き、ファイルを [すべてのサンプル"ウィンドウにドラッグします。
- 3 日目に収集された非刺激セルのファイルをダブルクリックすると、Y 軸に前方散布を持つドット プロットと X 軸のサイド 散布が表示されます。
- 「ポリゴン」をクリックし、リンパ球細胞、Thy1.2+ CD3 +細胞を選択し、CD4+およびCD8 +細胞を区別するゲーティング戦略を作成します(図1参照)。
図1:ゲーティング戦略。細胞は、まず形態に基づいてゲートされます(左:FSC-A、SSC-A)。次いでT細胞(中央:CD3、Thy1.2)をゲートし、さらにCD4+T細胞(オレンジ色)とCD8+T細胞(青)に分割する(右:CD4、CD8)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 他のファイルと同じ手順を繰り返します。
- 分割セルと非分割セルの頻度を決定するには、まず [レイアウト エディタ]をクリックしてセルの母集団を視覚化します。
- CD4 T セルと CD8 T セルを 4 つのチューブのそれぞれから "すべてのサンプル ウィンドウ"にドラッグします。
- 各母集団を表すグラフが表示されます。
- ヒストグラムを使用して結果を視覚化し、異なるチューブと異なる母集団を比較するためのパラメータとして"CFSE"を選択します。
- 非分裂細胞はCFSEの高いレベルを維持するのに対し、増殖細胞はCFSEの含有量を分裂細胞に分割する
- 非分割セルにゲートを作成し、すべてのチューブに適用します。
- 分割セルにゲートを作成し、すべてのチューブに適用します。
- CD3+ セルを分割する頻度を調べるには、"テーブル エディタ"をクリックします。
- 目的の集団をドラッグ - CD8 T細胞を分割し、CD4 T細胞を分割 - "テーブル"に分割します。
- [統計]メニューで[T セルの頻度]を選択し、[テーブルを作成]をクリックして新しいテーブルの頻度を表示します。
- [テーブルの作成]をクリックします。周波数値を表示するには、新しいテーブルに表示します。
ほとんどの免疫学研究では、免疫細胞の増殖を測定することは重要なステップであり、CFSE蛍光色素ベースの方法が一般的に使用されています。適切な細胞分裂は、免疫応答のレベルと特異性の両方を調節するので、免疫細胞にとって重要です。例えば、T細胞は増殖して癌細胞を同定し、殺し、B細胞は特異的抗体を産生する細胞分裂を受ける。CSFEアッセイの全体的な前提は、生細胞に入り、内部のタンパク質に安定的に結合する緑色蛍光色素CFSEで細胞を染色し、永久的な標識をもたらすことを含む。その結果、色素含有親細胞が分裂すると、各娘細胞は親細胞から蛍光の半分を得る。
このプロセスは、その後の分割で継続され、各部門で染料強度が徐々に減少します。所望のエンドポイントでは、各細胞の蛍光強度は、フローサイトメトリーによって測定される。このデータは、細胞が通過した分割の数とパターンを定量化するために使用されます。ここに示すように、蛍光が最も高い細胞集団は親世代由来である。2 番目に高いのは、2 番目の世代に属します。ピークの数によって、セル分割の数が決まります。
加えて、一次免疫細胞を用いれば、例えばT細胞のような特定の細胞集団は、CFSEと共に異なる色蛍光色素で標識することができ、同時に多色フローサイトメトリーを用いて同定することができる。新しいデータを同じグラフにプロットすることができ、異なるCFSE染色強度を有するT細胞サブ集団を示し、それによってT細胞の増殖速度を特異的に分析することができる。このビデオは、抗CD3抗体で刺激されるマウス脾細胞のCFSE染色のためのプロトコルを示しています。これに続いて、T細胞を標識し、細胞増殖を追跡するフローサイトメトリーに染色する。
まず、適切な防護服と実験室用手袋を着用してください。次に、まず洗剤で鉗子を洗い、ハサミを解剖し、次に70%のエタノールで拭き取り、清潔なペーパータオルで拭きます。50ミリリットルのチューブに1ミリリットルのFCSと49ミリリットルのHBSSを組み合わせることで、2%の胎児子牛血清(FCS)濃度のハンクのバランス塩溶液(HBSS)を50ミリリットルを準備します。溶液を約10回上下にゆっくりとピペッティングして混ぜます。次いで、脾臓Bリンパ球のFACS単離に関するビデオプロトコルで実証されているようにマウス脾臓細胞を単離する。
4本の15ミリリットルチューブに1~4本のラベルを付け、7番目の単離された脾臓細胞に10回1回を加えます。次に、各チューブに HBSS 2% FCS の 3 ミリリットルを追加します。次いで、5マイクロモルカルボキシフルオレセインスクハニミジルエステル、またはCFSEの1マイクロリットルを各チューブにピペットする。5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cでチューブを10分間インキュベートします。チューブ1と2の細胞は刺激されません。脾臓CD4およびCD8 T細胞の増殖の基礎レベルを明らかにするために使用されます。
これらのチューブにHBSS 2%FCSのピペット10ミリリットル。チューブ3および4は、細胞周期に及ぼす影響を観察するために抗CD3抗体によって刺激される。HBSS 2% FCSおよび抗CD3抗体の10ミリリットルを、1ミリリットル当たり2.5マイクログラムの最終濃度でチューブ3および4に添加する。次に、すべてのチューブを370 x gで10°Cで7分間遠心分離します。上清を捨てる。HBSS 2% FCSの2ミリリットルでペレットを再ステープルし、得られた溶液を6ウェルプレート上の別々のウェルにピペットします。サンプルのアイデンティティを追跡するために、プレートに1から4まで慎重にラベルを付けます。3日間、摂氏37度、CO25%で細胞をインキュベートします。
3日目に、1と3の管からの細胞を含むべきであるウェル1と3にHBSS 2%FCSの2ミリリットルを追加します。ピペットを上下に激しく上下に動かし、サンプルをラベル付きの5ミリリットルFACSチューブに移します。6ウェルプレートをインキュベーターに戻します。ウェル2と4からのこれらの残りの細胞は、細胞周期に対する刺激の長期的な影響を調査するために5日目に分析されます。10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離し、上清を廃棄します。次に、各チューブに100マイクロリットルの抗体ミックスを追加します。暗闇の中で氷の上で20分間チューブをインキュベートします。次に、各チューブにHBSS 2%FCSの1ミリリットルを追加し、10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。HBSS 2%FCSの200ミリリットルでペレットを再中断し、よく混ぜます。再懸濁ペレットを新しいラベル付きFACSチューブに移します。
次いで、FACSプロトコルに示すようにフローサイトメトリーを用いてT細胞増殖を評価する。細胞をゲートしてリンパ系CD3陽性細胞を選択し、CD4陽性細胞とCD8陽性細胞を区別し、チューブ1と3のデータを記録する。5日目に、6ウェルプレートの残りの2つのウェルからの細胞と細胞染色プロセスを繰り返す。
CD3刺激がCD4およびCD8陽性細胞の細胞周期に及ぼす影響を3日及び5日後に分析する。開始するには、FlowJo アイコンをクリックし、[すべてのサンプル] ウィンドウにファイルをドラッグします。3 日目に収集された非刺激セルのファイルをダブルクリックすると、Y 軸に前方散布を持つドット プロットが表示され、X 軸上に横散布します。ポリゴンをクリックして、その形態に基づいてリンパ球集団を円形にします。サブ集団識別ウィンドウで、母集団リンパ球に名前を付け、[OK] をクリックします。次に、円で囲まれた母集団をダブルクリックし、新しいウィンドウで、Y 軸の Thy1.2 を選択し、X 軸で CD3 を選択します。次に、ポリゴンをクリックして CD3 と Thy1.2 の二重正のセルを丸で囲みます。新しいサブ母集団識別ウィンドウで、母集団に T セルに名前を付け、[OK] をクリックします。次に、円で囲まれた母集団をダブルクリックします。新しいウィンドウで、Y 軸の CD4 を選択し、X 軸で CD8 を選択します。次に、ポリゴンをクリックして CD4 陽性の母集団を丸で囲みます。新しいサブ母集団識別ウィンドウで、母集団 CD4 T セルに名前を付け、[OK] をクリックします。次に、ポリゴンをクリックして CD8 陽性の母集団を丸で囲みます。新しいサブ母集団識別ウィンドウで、母集団 CD8 T セルに名前を付け、[OK] をクリックします。他のファイルと同じ手順を繰り返します。
分割セルと非分割セルの頻度を決定するには、まずレイアウト エディタをクリックしてセルの母集団を視覚化します。次に、CD4 T セルと CD8 T セルを 4 つのチューブのそれぞれから[すべてのサンプル]ウィンドウにドラッグします。母集団を表すグラフが表示されます。チューブごとに、CD8 Tセルのドットプロットをダブルクリックし、グラフ定義の下にあるヒストグラムを選択して結果を視覚化します。パラメータとして CFSE を選択して、各時点で刺激された細胞母集団と非刺激細胞母集団を比較します。非分裂細胞はCFSEの高いレベルを維持するのに対し、増殖細胞はCFSEの含有量を分裂細胞に分割する。
Shift キーを押しながら、ヒストグラムをダブルクリックします。新しいウィンドウで[範囲]をクリックし、最高峰に対応するCFSEの範囲を選択します。サブ母集団識別ウィンドウで、母集団に非分割 CD8 T セルに名前を付け、人口分割 CD8 セルにラベルを付けます。ここで、各チューブ内の分割CD4 T細胞と非分割CD4 T細胞を選択して繰り返します。CD3陽性セルを分割する頻度を調べるには、テーブルエディタをクリックします。次に、対象の母集団をドラッグし、CD8 T細胞を分割し、CD4 T細胞をテーブルに分割します。[統計] メニューで、[T セルの頻度] を選択します。次に、[テーブルの作成] をクリックして、新しいテーブルの頻度を表示します。
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Results
この実験では、インビトロ培養中の脾臓CD4+およびCD8+T細胞の増殖を行った。 3日後、刺激の有無にかかわらずCD4+およびCD8+T細胞の両方で強い増殖は見られなかった。これは、CSFE のピークが減少していない図 2の上部パネルで見ることができます。しかし、5日後には、CSFEピークの減少から明らかな両方の集団で増殖が見え始めました(下パネル、図2)。CFSE染色は、CD4+およびCD8+T細胞の両方が刺激後により多く分裂したことを明らかに示している。また、CD8+T細胞は、刺激の5日後にCD4+T細胞よりもわずかに増殖性が高いと思われた。
図2:CD4対CD8T細胞増殖。3日目(上パネル)及び5日目(下パネル)におけるT細胞の増殖。細胞周期は、2つの異なる日に刺激の有無にかかわらずCD4およびCD8 T細胞との間で比較される。CD4およびCD8 T細胞は、刺激されるとより増殖する。CD8刺激T細胞は5日目にCD4刺激T細胞よりも多く増殖する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Applications and Summary
増殖アッセイは、細胞の活性化の程度を決定するために免疫学などの異なる分野でしばしば使用されます。また、腫瘍診断で患者の腫瘍の攻撃性を決定するために行われます。CFSE染色は、時間の経過とともに免疫細胞集団の増殖を追従するのに有用な技術である。他の方法では、細胞周期の特性を可能にします。BrdUは、CFSEと同等のものが細胞分割にのみ組み込まれる。最近のFucciマウスモデルは、追加の染色なしで、細胞周期相の検出を可能にします。
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References
- Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
- Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
- Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).
