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Immunology

Assay für Zelltod: Chrom Release Assay der zytotoxischen Fähigkeit

Overview

Quelle: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, und Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Mikrobiologie, Immunologie und Krebsbiologie Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Zentrum für Immunologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Institut für Urologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Freimaurerkrebszentrum, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Eine der Hauptfunktionen der Zellen des Immunsystems ist es, Zielzellen zu entfernen, die mit Viren infiziert wurden oder sich in eine Tumorzelle verwandelt haben. In-vitro-Assays zur Messung der zytotoxischen Kapazität von Immunzellen sind seit vielen Jahren ein Grundnahrungsmittel in Laboratorien. Diese Assays wurden verwendet, um die Fähigkeit von T-Zellen, NK-Zellen oder anderen Immunzellen zu bestimmen, Zielzellen in einer antigen-spezifischen oder -unspezifischen Weise abzutöten. Todesliganden (z. B. FasLigand oder TRAIL), Zytokine (z. B. IFNg oder TNF) oder zytotoxische Granulate (z. B. Perforin/Granzym B), ausgedrückt durch Effektorzellen, sind einige Möglichkeiten, wie der Tod von Zielzellen induziert werden kann. Mit der Explosion in der Tumorimmuntherapie Forschung in den letzten Jahren, gibt es wachsendes Interesse an der Suche nach Wirkstoffen, um die zytotoxische Aktivität von Immunzellen zu erhöhen, um die Patientenergebnisse zu verbessern. Umgekehrt sind einige Krankheiten durch die überausuberliche Aktivität der zytotoxischen Aktivität der Immunzelle gekennzeichnet, was zu Bemühungen führt, Wirkstoffe zu identifizieren, um diese Reaktionen zu mildern. So kann ein Assay, bei dem der Anwender eine beliebige Anzahl verschiedener Effektorzellen, Zielzellen und/oder Ansprechmodifikatoren problemlos in das experimentelle Design integrieren kann, als wertvolles Mittel zur schnellen Beurteilung der zytotoxischen Kapazität von Effektorzellen und/oder oder die Reaktionsfähigkeit der Zielzelle.

Diese In-vitro-Assays beinhalten die Vermischung verschiedener Zellpopulationen sowie die Verwendung einer relativ geringen Anzahl von Effektor- und Zielzellen. Eine Notwendigkeit des Assays besteht daher darin, die Zielzellen so zu kennzeichnen, dass sie leicht erkannt und quantitiert werden können, so dass der Benutzer dann die "prozentspezifische Lyse" bestimmen kann, die von den Effektorzellen vermittelt wird. Radioaktivität - insbesondere Chrom 51 (51Cr) in Form von Na251CrO4- ist eine kostengünstige Möglichkeit, zelluläre Proteine innerhalb der Zielzellen schnell und nicht spezifisch zu kennzeichnen (1). Die kurze Etikettierung und die Gesamt-Assay-Zeiten reduzieren das Potenzial für signifikante Veränderungen in der Anzahl und/oder dem Phänotyp der Zielzellen, die das Ergebnis des Tests beeinflussen könnten. Nach dem Verlust der Membranintegrität der Zielzellen infolge der zytotoxischen Aktivität der Effektorzellen werden die 51Cr-markierten Zellproteine innerhalb der Zielzellen in den Kulturüberstand freigesetzt und Quantifizierung. Wie bei jedem Test, der die Funktion von Immunzellen in vitrountersucht, gibt es eine Reihe wichtiger Überlegungen, die Die Leistung des Experiments zu verbessern. Eines der wichtigsten Merkmale ist die Verwendung gesunder Effektor (für maximale zytotoxische Aktivität) und Ziel (für maximale Reaktionsfähigkeit und minimale spontane Tod /51Cr Freisetzung) Zellen. Effektor- und Zielzellkontakt ist erforderlich (was zur allgemeinen Verwendung von rund-bodenden 96-Well-Platten zur Förderung des Zell-Zell-Kontakts führt) (2). Schließlich hängt die Datenanalyse von der Einbeziehung positiver und negativer Zielzellpopulationen ab.

Das folgende Protokoll wird die Schritte zur Durchführung eines Standard-Freisetzungsassaysvon 51 Cr zur Messung der zytotoxischen Fähigkeit einer Population von Effektorzellen skizzieren, obwohl vor kurzem eine nicht radioaktive Version mit Europium entwickelt wurde. 51 Cr ist ein leistungsstarker Strahlenstrahler. Folglich erfordert die Verwendung dieses Tests ein angemessenes Strahlensicherheitstraining, einen speziellen Laborraum, einen Gammazähler und die Entsorgung radioaktiver Proben.

Die allgemeine Abfolge der Ereignisse in diesem Test sind: 1) 51Cr-markierte Ziele vorbereiten; 2) Effektorzellen vorbereiten und zur Platte hinzufügen, während Die Zielzellen etikettieren; 3) Beschriftete Targets zu Platte hinzufügen; 4) Inkubationsplatte; 5) Ernte Überstand; und 6) Daten analysieren, nachdem Proben auf dem Zähler ausgeführt wurden. Die Proben werden üblicherweise in dreifacher Ausführung vorbereitet und dann gemittelt, um etwaige subtile Pipettierunterschiede zu berücksichtigen.

Die richtige PSA ist für diesen Test wichtig. Insbesondere sollte der Benutzer einen Labormantel und Handschuhe tragen. Sicherheitsbrillen können auf der Grundlage des Labors oder der Institution erforderlich sein. Es sollte eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung der 51Cr in allen Schritten vorhanden sein. Schließlich sollte es spezielle Laborräume und Ausrüstung für die Verwendung von 51Cr, einschließlich aller richtigen Beschilderung, um anzugeben, wo Proben mit 51Cr gehalten werden und ein GeigerZähler mit Gamma-Sonde ausgestattet, um den Raum für mögliche verschmutzung.

In dieser Übungsübung werden wir die Fähigkeit bestimmen, die menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), (CpG stimuliert vs. unstimuliert), Melanomzellen abzutöten, indem wir die menschliche Melanomzelllinie WM793 als Modell und den Chromfreisetzungstest verwenden.

Procedure

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Prozessübersicht

Der typische 51Cr-Release-Assay zur Messung des Zelltodes umfasst folgende Schritte:

  1. Zunächst werden die Zielzellen mit Na2[51Cr]O4beschriftet. Dies unterscheidet sie von den Effektorzellen im Assay.
  2. Während die Zielzellen etikettiert werden, werden die Effektorzellen gesammelt und mit der seriellen Verdünnungstechnik wird eine abnehmende Titration der Effektorzellen in einer runden unteren 96-Well-Assay-Platte erzeugt.
  3. Am Ende der Zielzellkennzeichnung werden die Zellen zuerst gewaschen und dann eine feste Anzahl von Zellen der Assayplatte hinzugefügt, die bereits eine Reihe von Verdünnungen von Effektorzellen enthält.
  4. Als Nächstes wird der Zellmix des Zieleffektors für einen definierten Zeitraum inkubiert, um eine ausreichende Zellinteraktion mit den Zielzellen zu ermöglichen, um die Zelllyse zu mediat.
  5. Schließlich werden die Kulturüberstande geerntet und in Röhren gesammelt. Der 51-Cr-Betrag wird mit einem Gammazähler quantifiziert.
  6. Am Ende werden die Daten gesammelt und verwendet, um die "prozentuale spezifische Zelllyse" der Zielzellen zu berechnen.

1. Kennzeichnung von Zielzellen mit 51Cr

  1. Zunächst bereiten Sie die Zielzellen (hier- menschliche Melanom-Zelllinie WM793) zu einer einzelzelligen Suspension vor.
  2. Entfernen Sie dazu zunächst die Medien aus dem Gewebekulturkolben.
  3. Dann waschen Sie die Zellen mit 5 ml 1X PBS.
  4. Versuchen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml Trypsin für 2 min auf die Platte legen.
  5. Tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen.
  6. Fügen Sie dem Kolben 5 ml RPMI-Medien hinzu und pipen sie das Medium nach oben und unten, um die Zellen zu lösen.
  7. Sammeln Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und zentrieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 1200 U/min. Dekant den Überstand.
  8. Fügen Sie 10 ml Medien in das Pellet und sanft Pipetten sie die Medien nach oben und unten, um die Zellen in Suspension zu bringen.
  9. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer.
  10. Übertragen Sie 1x106 Zellen in ein neues 15 ml konisches Rohr.
  11. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 1200 U/min und dekanieren Sie den Überstand.
  12. Kurz wirbeln Sie das Rohr, um das Zellpellet in dem kleinen Volumen des zurückgelassenen Mediums wieder aufzuhängen.
  13. Fügen Sie der WM793-Zielzellsuspension 100 CIs von 51Cr direkt hinzu.
    Hinweis: Für die jeweilige Radioaktivität sollte ein spezieller Laborraum eingerichtet werden. Darüber hinaus sollte es eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung des 51Cr während aller Schritte sowie eine ordnungsgemäße Beschilderung geben, um anzugeben, wo Proben mit 51Cr aufbewahrt werden. Ein Geigerzähler, der mit einer Pfannkuchensonde ausgestattet ist, ist ebenfalls notwendig, um den Raum für eine mögliche Kontamination zu vermessen.
  14. Fügen Sie ein kleines Stück radioaktives Klebeband in die Röhre, um anzuzeigen, dass die Röhre jetzt radioaktiv ist.
  15. Legen Sie das Rohr in einen 37°C Inkubator mit einem Bleischild und inkubieren Sie 1 h. Streichen Sie das Rohr alle 15-20 Minuten, um die Aufnahme der Zielzelle des Chroms zu erhöhen.
  16. Waschen Sie nach der Inkubationszeit die Zielzellen mit 5 ml FBS, um überschüssige 51Cr zu entfernen.
  17. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1200 U/min für 5 min. Decant radioaktive FBS waschen in entsprechenden Abfallbehälter.
  18. Das Pellet wieder aufhängen und ein zweites Mal mit FBS waschen. Überprüfen Sie das Pellet auf eingebaute Radioaktivität mit einem Geigerzähler.
  19. Setzen Sie das Pellet in 10 ml komplettem Medium wieder auf und erreichen Sie eine Zellkonzentration von 105 Zellen/ml.
    Hinweis: Der Zellzählschritt nach der 51Cr-Kennzeichnung wird hier weitgehend aus Sicherheitsgründen weggelassen. Es kann davon ausgegangen werden, dass die WM793-Zellkonzentration mit der vor der 51Cr-Kennzeichnung identisch war.

2. Vorbereiten von Effektorzellen

  1. Es können verschiedene Effektorzellen verwendet werden, z. B. menschliche oder Maus-T-Zellen und NK-Zellen. In diesem Beispiel wurden PBMCs verwendet, die durch Standarddichtegradientenzentrifugation (bis zu einer Konzentration von 5x106) aus Vollblut isoliert wurden.
  2. Zunächst fügen Sie jedem Brunnen einer der Reihen (hier Reihe A, siehe Tabelle 1) einer 96-well-Rundbodenplatte 100 L Gewebekulturmedium hinzu. Hier werden keine Effektorzellen hinzugefügt, und sie dienen als "Leer" zur Bestimmung der "minimalen/spontanen 51Cr-Freisetzung" aus den Zielzellen.

Figure 1
Tabelle 1: 51Cr Release Assay Layout: Reihe A- Zielzellen (104 Zellen / 100 l) nur mit Medien inkubiert (erzeugt 'leer' zur Bestimmung der "minimum/spontan 51Cr Release"). Zeilen B bis C- Brunnen mit unterschiedlichen Effektor: Zielzellen (E:T)-Verhältnisse, die von 50:1 bis 1,5:1 reichen. Zeile H- Zielzellen (104 Zellen/100 l) inkubiert mit 1% NP-40 (NP-40 lyses die Zielzellen, erzeugung "maximale oder insgesamt 51Cr Freisetzung"). Jedes E:T-Verhältnis wird in dreifacher Auslage für jeden Versuchszustand getestet. Spalte 1-3- unstimulierte PBMCs und Spalte 4-6- CpG-stimulierte PBMCs.

  1. Als nächstes erzeugen Sie eine 2-fache serielle Zellverdünnung der PBMCs (in Dreifacharbeit für jede Versuchsbedingung), um eine Effektorzellkonzentration von 5x105 bis 15.625 Zellen/100 l Medien zu erhalten (hier Zeilen B bis G).
    Hinweis: In diesem Beispiel ist das Anfangseffektor: Zielzelle (E: T) Verhältnis ist 50:1. Dieses Verhältnis kann jedoch je nach experimentellen Besonderheiten angepasst werden.
  2. Lassen Sie die letzte Zeile leer (hier Zeile H), indem Sie diesen Brunnen keine Effektorzellen hinzufügen. (Diese Zeile wird verwendet, um die "Gesamtanzahl/min oder (ca. p. m)" oder die "maximale 51Cr-Version") zu generieren.
  3. Legen Sie die Platte in den 37°C-Inkubator, bis die Zielzellen bereit sind, hinzugefügt zu werden.

3. Hinzufügen von 51Cr beschrifteten WM793-Zielzellen zum Assay

  1. Nach der Inkubationszeit die Zielzellen aus dem Inkubator entfernen und mit 5 ml FBS waschen, um überschüssige 51Cr zu entfernen.
  2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1200 U/min für 5 min, mit einer bestimmten Zentrifuge.
  3. Entfernen Sie die FBS-Waschanlage (radioaktiver Überstand) in einen geeigneten Abfallbehälter.
  4. Wiederholen Sie den Waschschritt, indem Sie das Pellet in einem frischen 5 ml FBS wieder aufhängen.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 1200 U/min für 5 min.
  6. Schließlich das Pellet in 10 ml des kompletten Mediums wieder aussetzen.
  7. Gießen Sie die 51Cr-markierte WM793-Zellsuspension (105 Zellen/ml) in ein Einweg-Reagenzreservoir.
  8. Fügen Sie dann 100 l dieser beschrifteten Zielzellen zu jedem Brunnen der 96-Well-Effektor-Zellplatte hinzu, wobei eine Mehrkanalpipette verwendet wird.
  9. Als Nächstes fügen Sie 100 L von 1% NP-40 (in Wasser) in die Reihe der Brunnen, die frei von Effektorzellen sind (hier Zeile H). 1% NP-40 wird die Zielzellen lysieren, und somit dienen diese Brunnen als Kontrollen, um die "Gesamtanzahl/min, oder (c. p. m)" oder die maximale 51Cr-Freisetzung zu bestimmen.
  10. Befestigen Sie deckel auf Platte, indem Sie ein kleines Stück gasdurchlässiges Klebeband auf jeder Seite der Platte hinzufügen und legen Sie ein Stück radioaktives Klebeband auf den Deckel, um anzuzeigen, dass es 51Cr enthält.
  11. Kurz gesagt, zentrieren Sie die Platte bei 1200 U/min. Wenn nur eine Versuchsplatte verwendet wird, fügen Sie der Zentrifuge eine Ausgleichsplatte hinzu.
    Hinweis: Es ist wichtig, eine Zentrifuge zu verwenden, die für den Umgang mit radioaktiven Proben markiert ist.
  12. Entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge.
  13. Legen Sie die Platte in einen 37°C Inkubator mit einem kleinen Stück Bleiabschirmung über die Platte für zusätzliche Sicherheit. Inkubieren Sie für 16 h, um eine Zielzelllyse zu ermöglichen.
    Hinweis: Die Inkubationszeit kann je nach verwendeten Effektorzellen und möglichem Tötungsmechanismus zwischen 4 und 18 h variieren.

4. Ernte der Übertreibungen

  1. Am Ende der Inkubationszeit entfernen Sie vorsichtig das Band um den Rand der Platte und entfernen Sie den Deckel.
  2. Als nächstes legen Sie den Ernterahmen auf die Platte, um sicherzustellen, dass die kleinen Filterscheiben für jeden der Baumwollstecker vorhanden sind. Dadurch wird die Sammlung eines zellfreien Überstandes sichergestellt.
  3. Nun drücken Sie langsam und sanft die Baumwollstopfen in die Brunnen.
  4. Nach ca. 10 Sekunden den Druck auf die Baumwollstecker loslassen und dann die Baumwollstecker auf Rohrstreifen übertragen.
  5. Legen Sie jedes dieser Rohre in ein sekundäres FACS-Rohr.
  6. Schließlich laden Sie FACS-Röhren auf den Gammazähler und führen Sie die Proben aus, um die Menge von 51Cr zu quantifizieren, die in jedem Zustand freigesetzt wird. Die Proben werden in der Regel 1 Minute lang gemessen, was eine einfache Bestimmung der "Zählungen/Minute" ermöglicht.
  7. Zeichnen Sie sorgfältig die Reihenfolge auf, in der die Rohre in den Zähler geladen wurden.

5. Datenanalyse

  1. Hier wurden den ersten drei Spalten unstimulierte PBMCs hinzugefügt und cpG-stimulierte PBMCs (CpG ODN, (1 g/ml) für 24 h) zu den Spalten 4-6 hinzugefügt. Siehe Tabelle 2.
1 2 3 4 5 6 7 8
pro 1251 1157 1086 917 1118 1140
B 1832 1986 1971 7629 7913 8180
c 1677 1739 1428 5454 5055 5268
D 1638 1552 1734 4239 3582 3786
E 1658 1580 1339 2818 2623 2750
f 1579 1472 1483 2028 1779 1769
g 1326 1325 1184 1801 1654 1565
h 9220 9367 8067 8774 9647 8236
Durchschnitt von A1,A2,A3 -> 1164.67 Spontanc.p.m 1058.33
J Durchschnitt von B1,B2,B3 -> 1929.67 9.91% 7907.33 87.50% 50:1
kb Durchschnitt von C1,C2,C3 -> 1614.67 5.83% 5259 53.67% 25:1
l Durchschnitt d1,D2,D3 -> 1641.33 6.17% 3869 35.91% 12.5:1
m Durchschnitt von E1,E2,E3 -> 1525.67 4.68% 2730.33 21.36% 6.25:1
N Durchschnitt von F1,F2,F3 -> 1511.33 4.49% 1858.67 10.22% 3.12:1
O Durchschnitt von G1,G2,G3 -> 1278.33 1.47% 1673.33 7.86% 1.56:1
seiten Durchschnitt h1,H2,H3 -> 8884.67 Maximal c.p.m 8885.67
Unstim PBMC CpG-Stim PBMC E:T-Verhältnis

Tabelle 2: 51Cr-Release-Assay-Daten: Datenwerte "Anzahl pro Minute" / "c. p. m", durchschnitts c. p. m-Werte und berechnete prozentspezifische Lysewerte.

  1. Die gesammelten Daten (Anzahl pro Minute, d.h. c.p.m) wurden in die Zellen einer Kalkulationstabelle in der gleichen Weise eingegeben, wie die Proben in der Originalplatte angeordnet waren.
  2. Zunächst wurden die Durchschnittswerte der Triplicate berechnet. Tabelle 2 - Zellen I3 bis P3, für nicht stimulierte PBMCs und Zellen I6 bis P6, für CpG-stimulierte PBMCs.
  3. Nach der Ermitteltur der Durchschnittswerte wurde der prozentuale Anteil der spezifischen Lyse für jede Bedingung anhand der folgenden Formeln

  4. Der Prozentuale Anteil der spezifischen Lyse wurde für jede Bedingung berechnet (Tabelle 2 - Zellen J4 bis O4, für nicht stimulierte PBMCs und J7 bis O7, für nicht stimulierte PBMCs).

In diesem Video werden Sie beobachten, wie Sie den Chromfreisetzungstest durchführen und das zytotoxische Potenzial der Effektorzellen bestimmen.

Immunzellen sind verantwortlich für die Identifizierung und Entfernung potenziell schädlicher Zellen, wie Krebs oder virusinfizierte Zellen, aus dem Körper, der ein integraler Bestandteil der Immunantwort ist. Mehrere Immunzellen, wie T-Zellen und NK-Zellen, besitzen eine Eigenschaft, die als zytotoxisches Potenzial bekannt ist, die die Fähigkeit ist, Zielzellen zu identifizieren und Proteine zu sezernieren, die Proteinabbau, Lyse und Tod dieser Zielzellen induzieren. Die Quantifizierung des zytotoxischen Potenzials ist entscheidend für die Messung der Aktivierung und Potenz von Immunzellen, und der Chromfreisetzungstest wird häufig für diesen Zweck verwendet.

Diese Methode ermöglicht es Benutzern, Zytoxizität durch bestimmte Arten von Immunzellen unter verschiedenen Bedingungen induziert zu vergleichen, was für die Untersuchung der Krebsimmuntherapie und immunitätsbedingte Krankheiten wertvoll ist. Zunächst werden die Zielzellen, wie Krebszellen, mit einem radioaktiven Isotop, Chrom 51, inkubiert, das von den Zellen aufgenommen wird. Als nächstes werden diese radiobeschrifteten Zellen mit den isolierten Immunzellen von Interesse, auch Effektorzellen genannt, in einer runden Bodenplatte mit 96-Well-Platte kultiviert, um die Interaktion zwischen den beiden Zelltypen zu erleichtern.

Die Gesamteinrichtung des Assays beinhaltet die Inkubation einer bestimmten Anzahl von Zielzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Immunzellen, zusammen mit entsprechenden Kontrollen. Die Co-Kultur ermöglicht es den Effektorzellen, Apoptose und Lyse in den Zielzellen zu induzieren, was zur Freisetzung des intrazellulären Chroms 51 in den Überstand führt. Dann wird zu einem voroptimierten Zeitpunkt der Überstand, der das freigesetzte Chrom enthält, aus allen Brunnen geerntet. Das radioaktiv ist deaktiv istde Chrom 51, erfährt spontan radioaktiven Zerfall, um Gammastrahlung auszusenden. Die Gammastrahlungswerte in den Überständen aus allen Brunnen in der Assayplatte stellen eine quantifizierbare Ausgabe der Lyse der Zielzellen dar. Dies wird mit einem Gammazähler gemessen, der dann verwendet wird, um das zytotoxische Potenzial der Immunzellen zu bestimmen.

Zunächst werden die Zielzellen, in diesem Beispiel die menschliche Melanomzelllinie WM793, zu einer einzelzelligen Suspension präpariert. Entfernen Sie dazu zunächst die Medien aus dem Gewebekulturkolben und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern 1X PBS. Dekantieren Sie die PBS und fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin auf die Platte für etwa zwei Minuten. Tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen, und fügen Sie dann fünf Milliliter RPMI-Medien in den Kolben. Pipette die Medien nach oben und unten, um die Zellen zu sammeln und fügen Sie diese Suspension zu einem 15 Milliliter konischen Rohr.

Legen Sie das Rohr in die Zentrifuge für fünf Minuten bei 1200 U/min. Entfernen Sie als Nächstes das Medium aus dem Rohr, um sicherzustellen, dass das Zellpellet nicht gestört wird. Streichen Sie vorsichtig den Boden des Rohres, um das Zellpellet zu stören und fügen Sie 10 Milliliter Medien in das Rohr. Dann, sanft Pipette die Medien nach oben und unten, um die Zellen in Suspension zu bringen. Als nächstes bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und übertragen Sie zwei Milliliter der ursprünglichen Zellsuspension in ein neues 15 Milliliter konisches Rohr. Legen Sie das Rohr in eine Zentrifuge und pellet die Zellen bei 12 hundert RPM für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation das überschüssige Medium aus dem Rohr in einen Abfallbehälter gießen. Kurz wirbeln Sie das Rohr, um das Zellpellet in dem kleinen Volumen des zurückgelassenen Mediums wieder aufzuhängen.

Bereiten Sie als Nächstes die Verwendung von Chromium 51 vor, indem Sie in einen Laborraum wechseln, der für diese spezielle Radioaktivität vorgesehen ist. Es sollte eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung des Chromium s. 51 in allen Schritten sowie eine ordnungsgemäße Beschilderung geben, um anzugeben, wo Proben mit Chrom 51 aufbewahrt werden. Ein Geigerzähler, der mit einer Pfannkuchensonde ausgestattet ist, ist auch notwendig, um im Raum für eine mögliche Kontamination zu dienen.

Einmal für die ordnungsgemäße Verwendung von Radioaktivität eingerichtet, fügen Sie 100 Mikrocuries Chrom 51 direkt in die Zielzellsuspension. Fügen Sie dann ein kleines Stück radioaktives Klebeband in die Röhre ein, um anzuzeigen, dass die Probe und das Rohr jetzt radioaktiv sind. Legen Sie das Rohr in einen 37 Grad Celsius Inkubator mit einem Bleischild und inkubieren Sie für eine Stunde, das Rohr alle 15 bis 20 Minuten zu flicken.

Während die Zielzellen etikettiert werden, bereiten Sie eine einzelzellige Suspension von Effektorzellen vor. In diesem Beispiel wurden menschliche periphere Mono-Kernzellen oder PDMCs aus Vollblut durch Standarddichtegradientzentrifugation bis zu einer Konzentration von 5 mal 10 bis 6 isoliert. Übertragen Sie diese Effektorzellsuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir und fügen Sie dann 200 Mikroliter dieser Suspension in jede Bohrung der Reihe B in einer 96-well-Rundbodenplatte ein. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter RPMI zu jedem Brunnen in Reihe C bis G der Platte hinzu.

Beginnen Sie nun mit der Durchführung serieller Verdünnungen der PBMCs, um einen Bereich von Effektorzellennummern zu erhalten, indem Sie zuerst 100 Mikroliter der Zellen in den Brunnen in Zeile B entfernen und diese zu Zeile C hinzufügen. Verdünnen Sie dann die Effektorzellen weiter, indem Sie 100 Mikroliter Zellen von Zeile C in Zeile D übertragen. Sobald Zeile G erreicht ist, bewegen Sie 100 Mikroliter aus den Brunnen, um ein endgültiges Volumen von 100 Mikrolitern in jedem Brunnen in dieser Reihe zu hinterlassen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Gewebekulturmedium zu den Brunnen in Reihe A hinzu, um als Kontrolle für die spontane Freisetzung von Chrom 51 aus den Zielzellen zu dienen, da dieser Zeile keine Effektorzellen hinzugefügt werden sollten. Legen Sie dann eine Platte in einen 37 Grad Celsius Inkubator, bis die Zielzellen bereit sind, hinzugefügt zu werden.

Nach der Inkubationszeit entfernen Sie die Zielzellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit 5 MilliliterFBS, um überschüssiges Chrom 51 zu entfernen. Legen Sie dann das Rohr in eine bestimmte Zentrifuge und drehen Sie bei 1200 U/min für 5 Minuten. Entfernen Sie die radioaktive FBS-Waschanlage in einen geeigneten Abfallbehälter und wiederholen Sie den Waschschritt, indem Sie das Pellet in einem frischen 5 Milliliter FBS wieder aufhängen. Legen Sie das Rohr in eine bestimmte Zentrifuge und drehen Sie die Zellen wieder bei 1200 U/min für 5 Minuten. Entfernen Sie die zweite Wäsche und überprüfen Sie das Pellet auf eingebaute Radioaktivität mit einem Geigerzähler. Schließlich das Pellet in 10 Milliliter n komplettem Medium aussetzen und das Chrom 51 mit Zielzellsuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir gießen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter dieser beschrifteten Zielzellen zu jedem Brunnen der 96-Well-Effektor-Zellplatte hinzu. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter von 1% NP-40 in Wasser zu den Brunnen in Reihe H hinzu, um alle Zielzellen in dieser Zeile zu lysieren. Diese Brunnen werden als Steuerung verwendet, um die Gesamtzahlprominute oder cpm zu bestimmen.

Nun, da die Platte vorbereitet ist, sichern Sie den Deckel, indem Sie ein kleines Stück Klebeband auf jeder Seite der Platte hinzufügen und legen Sie ein Stück radioaktives Klebeband auf den Deckel, um anzuzeigen, dass es Chrom 51 enthält. Legen Sie die Platte dann in eine Zentrifuge, die für den Umgang mit radioaktiven Proben markiert ist. Wenn nur eine Versuchsplatte verwendet wird, fügen Sie der Zentrifuge eine Ausgleichsplatte hinzu. Stellen Sie die Zentrifuge auf 1200 U/min und bringen Sie die Platte auf Denspeed. Sobald Die Geschwindigkeit, stoppen Sie die Maschine. Entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge. Legen Sie die Platte dann in einen 37 Grad Celsius Inkubator mit einem kleinen Stück Bleiabschirmung über die Platte für zusätzliche Sicherheit. 16 Stunden lang inkubieren, damit die Zielzellen lysieren können.

Am Ende der Inkubationszeit entfernen Sie vorsichtig das Band um den Rand der Platte, und entfernen Sie den Deckel. Als nächstes legen Sie den Ernterahmen auf die Platte, um sicherzustellen, dass die kleinen Filterscheiben für jeden der Baumwollstecker vorhanden sind. Nun drücken Sie langsam und sanft die Baumwollstopfen in die Brunnen. Nach etwa zehn Sekunden den Druck auf die Baumwollstecker loslassen und dann die Baumwollstecker auf Rohrstreifen übertragen. Legen Sie jedes dieser Rohre in ein sekundäres FACS-Rohr. Schließlich laden Sie die FACS-Röhren auf einen Gammazähler und führen Sie die Proben aus, um die in jedem Zustand freigesetzte Chrommenge 51 zu quantifizieren. Zeichnen Sie sorgfältig die Reihenfolge auf, in der die Rohre in den Zähler geladen wurden.

Hier wurden zu den ersten 3 Bahnen und CPG-stimulierte PMBCs zu den Bahnen 4 bis 6 hinzugefügt. In diesem Beispiel wurden die Zahlen pro Minute in die Zellen einer Kalkulationstabelle eingegeben, wie die Proben in der originalen Platte angeordnet waren und die Mittelwerte der Triplicate berechnet wurden. Für die erste Bedingung wurden beispielsweise die Zellen A1, A2 und A3 in Zelle I3 gemittelt. Sobald die Durchschnittswerte ermittelt wurden, kann der Prozentsatz der spezifischen Lyse für jede Bedingung mit dieser Formel berechnet werden. Um beispielsweise die prozentuale spezifische Lyse für die nicht stimulierten Zellen zu berechnen, die ein Verhältnis von 50 zu 1 Effektorzellen zu Zielzellen hatten, wurde das spontane CPM, das in diesem Beispiel 1164,67 beträgt, vom experimentellen CPM 1129 subtrahiert. 67. Diese Zahl kann dann durch die Differenz zwischen dem maximalen CPM und dem spontanen CPM dividiert und dann mit 100 multipliziert werden, um die prozentuale spezifische Lyse zu geben. Diese wird dann für jede Bedingung berechnet. Diese Daten können dann grafisch dargestellt werden, um einen Vergleich des E-T-Verhältnisses mit der prozentspezifischen Lyse sowohl für die nicht stimulierten PBMCs als auch für die VON CPG stimulierten PBMCs zu zeigen. In diesem Beispiel stimulierten Effektorzellen mit CPG effektiver abgetötete Zielzellen, da das Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen zunahm. Dieser Anstieg wurde bei den nicht stimulierten PBMCs nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine CPG-Stimulation für den beobachteten Anstieg der Zielzelllyse notwendig ist.

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Results

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In diesem Beispiel töteten Effektorzellen, die mit CpG stimuliert wurden (Abbildung 1, schwarze Kreise),die Zielzellen effektiver ab, da das Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen zunahm. Dieser Anstieg wurde in den nicht stimulierten PBMCs(weiße Kreise)nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine CpG-Stimulation für die beobachtete Erhöhung der Zielzelllyse notwendig ist.

Figure 1
Abbildung 1: 51Cr-Assay-Streudiagramm: Tumorzidenaktivität durch humane PBMCs, unstimuliert(weiße Kreise)und nach Stimulation mit CpG (schwarze Kreise), getestet mit verschiedenen Effektoren: Zielzellverhältnisse (E: T) . 50:1 bis 1,5:1).

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Applications and Summary

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Der hier beschriebene Assay hat eine erhebliche Flexibilität, da je nach gestellter Frage eine Vielzahl von Effektor- und Zielzellen eingesetzt werden kann. Beispielsweise kann die Spezifität der Effektorzellen durch die Verwendung verschiedener Zielzellen oder den Mechanismus der Effektorzelltötung durch die Verwendung von Zellen mit einem Mangel an bestimmten Proteinen oder die Verwendung von proteinspezifischen Inhibitoren bestimmt werden. Ein großes Problem mit dem 51Cr Release Assay ist das Potenzial für eine hohe spontane Freisetzungsrate durch die Zielzellen. Allein (ohne Effektorzellen) sollte die spontane Freisetzung von 51Cr durch die Zielzellen idealerweise nicht mehr als 30% der gesamten ("maximalen") Freisetzung durch die Zielzellen sofort Lyse betragen. Höhere spontane Freisetzungsraten können auf die Verwendung ungesunder Zielzellen zurückzuführen sein, entweder aufgrund schlechter Gesundheit (z. B. verlängerte Kultur einer Zelllinie) oder einer übermäßig langen Etikettierungszeit.

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References

  1. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
  2. Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).
Assay für Zelltod: Chrom Release Assay der zytotoxischen Fähigkeit
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