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Microbiology

Anreicherungskulturen: Kultivieren von aeroben und anaeroben Mikroben auf selektiven und differenziellen Medien

Overview

Quelle: Christopher P. Corbo1, Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

Prokaryotische Zellen sind in der Lage, fast jede Umgebung auf diesem Planeten zu bewohnen. Als Königreich besitzen sie eine große metabolische Vielfalt, die es ihnen ermöglicht, eine Vielzahl von Molekülen für die Energieerzeugung zu verwenden (1). Daher müssen bei der Kultivierung dieser Organismen im Labor alle notwendigen und spezifischen Moleküle, die zur Energiegewinnung erforderlich sind, in den Wachstumsmedien bereitgestellt werden. Während einige Organismen metabolisch vielfältig sind, sind andere in der Lage, in extremen Umgebungen wie hohen oder niedrigen Temperaturen, alkalischen und sauren pH-Werten, reduzierten oder sauerstoffarmen Umgebungen oder Umgebungen mit hohem Salzgehalt (2,3,4) zu überleben. Diese Organismen, die als "Extremophile" bezeichnet werden, erfordern oft, dass sich diese intensiven Umgebungen ausbreiten. Wenn Wissenschaftler versuchen, solche Organismen zu züchten, müssen die Medienkomponenten sowie spezifische Umweltbedingungen berücksichtigt werden, um die Voninteresseer erfolgreich zu kultivieren.

Wissenschaftler sind in der Lage, kultivierbare Organismen im Labor anzubauen, weil sie die spezifischen Anforderungen verstehen, die diese Arten brauchen, um zu wachsen. Kultikörnbare Organismen machen jedoch weniger als 1 % der Arten aus, die sich schätzungsweise auf dem Planeten befinden (5). Organismen, die wir durch Gensequenzierung nachgewiesen haben, aber nicht im Labor wachsen können, gelten als unkultibilierbar (6). Zu diesem Zeitpunkt wissen wir nicht genug über den Stoffwechsel und die Wachstumsbedingungen dieser Organismen, um ihre Umgebung im Labor zu replizieren.

Schnelle Organismen liegen irgendwo zwischen den beiden ehemaligen. Diese Organismen sind kultivierbar, erfordern aber sehr spezifische Wachstumsbedingungen, wie z. B. spezifische Wachstumsmedienkomponenten und/oder spezifische Wachstumsbedingungen. Zwei Beispiele für solche Gattungen sind Neisseria sp. und Haemophilus sp., die beide teilweise abgebaute rote Blutkörperchen (auch als Schokoladenagar bekannt) sowie spezifische Wachstumsfaktoren und ein an Kohlendioxid reiches Umfeld erfordern (7). Ohne alle erforderlichen spezifischen Komponenten werden diese Organismen überhaupt nicht wachsen. Oft, selbst mit all ihren Anforderungen, wachsen diese Organismen schlecht.

Im Gegensatz zu eukaryotischen Zellen, die nur in einer aeroben oder sauerstoffhaltigen Umgebung wachsen können, sind prokaryotische Zellen in der Lage, anaerob mit mehreren Fermentationswegen zu wachsen, um reichlich Energie zu erzeugen (8). Andere Prokaryoten bevorzugen eine mikroaerophile oder reduzierte Sauerstoffumgebung oder sogar eine kapnophile oder hohe Kohlendioxidumgebung (9). Diese Organismen sind schwieriger zu bereichern, da die Atmosphäre verändert werden muss. Wissenschaftler, die häufig mit Organismen arbeiten, die empfindlich auf eine sauerstoffhaltige Umgebung reagieren, würden normalerweise in einer anaeroben Kammer und einem Inkubator arbeiten, wo ein schweres, inertes Gas wie Argon eingepumpt wird, um den Sauerstoff zu verdrängen (10). Andere nutzen konventionell verfügbare versiegelte Gaspaketsysteme, die Wasser zur Erzeugung von Wasserstoff und Kohlendioxid verwenden, zusammen mit einem Katalysator wie Palladium, um den gesamten Luftsauerstoff zu entfernen. Diese kommerziell erhältlichen Kits können eine der oben genannten atmosphärischen Bedingungen schaffen (10).

Ob die Kultivierung eines Krankheitserregers zur Bestimmung einer potenziellen Infektion oder die Suche nach einer bestimmten Bakterienart in einer natürlichen Umgebung, ein Problem besteht. Keine bakterienart bewohnt einen Lebensraum. Bakterien leben als mehrzellige Gemeinschaften überall von der Haut des Menschen bis zu den Ozeanen unseres Planeten (11). Bei dem Versuch, eine Bakterienart zu isolieren, müssen Wissenschaftler daran arbeiten, die zahlreichen anderen Organismen auszuschließen, die ebenfalls das isolierte Gebiet bewohnen. Aus diesem Grund erfüllen angereicherte Wachstumsmedien für Bakterien oft zwei Funktionen. Die erste besteht darin, die Medien selektiv zu machen. Ein selektiver Wirkstoff verhindert das Wachstum einiger Arten, hemmt aber nicht und fördert oft sogar andere zum Wachsen (12). Die zweite Funktion der Medienbestandteile kann sein, als Differentialmittel zu arbeiten. Solche Wirkstoffe ermöglichen die Identifizierung eines bestimmten biochemischen Merkmals eines isolierten Organismus. Durch die Kombination mehrerer verschiedener selektiver und differentialer Medien mit geeigneten Wachstumsbedingungen sind Wissenschaftler und Diagnostiker in der Lage, das Vorhandensein bestimmter Bakterienarten aus einem bestimmten Isolat zu identifizieren.

Ein Beispiel für ein selektives und differenziertes Medium, das bei der Identifizierung hilft, ist im Falle des klinisch signifikanten Organismus Staphylococcus aureus. Dieser Organismus ist in der Regel auf Mannitol Salz Agar kultiviert. Dieses Medium wählt nicht nur für Organismen, die in einer hohen Salzumgebung leben können, die einige Gramm-Positive wie Staphylokokkenenthalten, sondern hemmt auch alle Salzempfindlichen Organismen. Der Mannitolzucker ist die Differentialkomponente dieses Mediums. Von allen klinisch signifikanten Staphylococcus-Arten ist nur S. aureus in der Lage, Mannitol zu fermentieren. Diese Fermentationsreaktion erzeugt Säure als Nebenprodukt, wodurch der rote Methylrotindikator in den Medien gelb wird. Andere Staphylococcus-Arten (wie Staphylococcus epidermidis) können zwar wachsen, lassen die Medien zwar rot.

Diese Laborübung zeigt die richtige aseptische Technik, sowie die richtige Impfung von Wachstumsmedien aus Brühe. Es führt auch das Wachstum von gewöhnlichen Schadstoffen auf Anreicherungsmedien, die Verwendung eines Gaspakets anaerobe Kultursystem für anaerobe Bakterien, und die Verwendung von verschiedenen selektiven und differentialen Medien für die mutmaßliche Identifizierung von Gram positiven und gramnegativen Bakterien.

Procedure

1. Vorbereitung

  1. Vor Beginn die Hände gründlich waschen und handschuhe in entsprechend größe anziehen.
  2. Sterilisieren Arbeitsfläche mit 5% Natriumhypochlorit (Bleichmittel) und gründlich trocknen.
  3. Legen Sie eine Impfschleife in einen leeren 120 mL Erlenmeyer Kolben, damit er die Bankspitze während der Arbeit nicht berührt.

2. Wachstumsmedien und Kulturen

  1. Sammeln Sie vier Platten Mannitol Salt Agar (MSA), Eosin Methylenblau Agar (EMB) und acht Tryptic Soja-Agar (TSA) aus dem Kühlschrank (diese können kommerziell erworben werden).
  2. Legen Sie Platten auf den gereinigten Arbeitsbereich.
  3. Sammeln Sie die folgenden BrüheKulturen: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, und Proteus vulgaris. Seien Sie vorsichtig: Da es sich um aerobe Organismen handelt, sollten die Kappen der Röhren leicht locker sein.
  4. Legen Sie alle Kulturen in einem Reagenzglasregal auf die gereinigte Arbeitsfläche.

3. Übertragung von Kulturen und Inkubation

  1. Stehen oder sitzen Sie auf der Bank mit allen Materialien in Reichweite.
  2. Um die aseptische Technik zu verwenden, um die Bakterien auf die Platte zu übertragen, zünden Sie zuerst die Schleife, bis sie orange leuchtet - und lassen Sie sie dann in der Luft abkühlen.
  3. Während die Schleife abkühlt, nehmen Sie die Brühe Kultur von E. coli, und öffnen Sie dann die Kappe mit Ihrem rosa Finger.
  4. Brennen Sie die Öffnung des Rohres schnell. Dies verhindert eine Kontamination.
  5. Tauchen Sie die Schleife in die Röhre und streifen Sie den Organismus auf den ersten Quadranten einer EMB-Platte.
  6. Nachdem der erste Streifen durchgeführt wird, flammen Sie die Schleife, und führen Sie dann einen zweiten Streifen durch, der den ersten Streifen nur ein- oder zweimal kreuzt. Dies ermöglicht die Isolierung einzelner Kolonien und um festzustellen, ob eine Kontamination vorliegt.
  7. Wiederholen Sie dies, bis alle vier Quadranten der Platte gestreift sind.
  8. Übertragen Sie nun jeden der übrigen Organismen auf die gleiche Streifenbeschichtungsweise, so dass das Endprodukt eine MSA-Platte, eine EMB-Platte und zwei separate TSA-Platten pro Organismus ist.
  9. Sobald alle Organismen übertragen wurden, flammen Sie die Schleife ein letztes Mal und legen Sie sie weg.
  10. Legen Sie 1 TSA-Platte mit jedem Organismus in die Gaspackung und schütteln Sie dann einen Gasbeutel, bevor Sie ihn in die Kammer neben den Platten legen. Dicht fest versiegeln.
  11. Alle Platten bei 37°C über Nacht inkubieren.
  12. Sterilisieren Sie die Arbeitsfläche ein letztes Mal mit 5% Bleichmittel.

4. Lese- und Aufzeichnungsergebnisse

  1. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und legen Sie sie auf eine saubere Laborbank
  2. Beachten Sie das Wachstum der Organismen auf jedem Teller in Ihrem Labor-Notebook. Nehmen Sie insbesondere detaillierte Anmerkungen zu:
    1. Anzahl und Größe der Kolonien (falls vorhanden) auf jeder Platte, für jeden plattierten Stamm
    2. Aussehen des Agars, der alle Kolonien umgibt, die auf den MSA-Platten wachsen
    3. Aussehen von Kolonien, die auf den EMB-Platten wachsen
    4. Wachstumsunterschiede zwischen den TSA-Platten, die außerhalb des Gaspakets angebaut werden

Bakterien sind in der Lage, fast jede Umgebung auf der Erde zu bewohnen, von Wüstentundra bis zu tropischen Regenwäldern. Diese Fähigkeit, sehr unterschiedliche Nischen zu kolonisieren, ist auf ihre Anpassungsfähigkeit und enorme metabolische Vielfalt zurückzuführen, die es ihnen ermöglicht, eine Vielzahl von Molekülen für die Energieerzeugung zu nutzen. Es ist diese massive Vielfalt, die zu dem Phänomen führt, dass weniger als 1% der Bakterienarten auf dem Planeten als kultivierbar gelten und diese nur aufgrund eines Verständnisses ihrer spezifischen metabolischen und ökologischen Bedürfnisse möglich sind.

Die Durchführung von Manipulationen von Medien und Umwelt im Labor ermöglicht es Forschern nicht nur, zu experimentieren, um die optimalen Bedingungen für die Kultivierung einer Art von Interesse zu finden, sondern ermöglicht auch die Anreicherung, den Prozess der Veränderung der Bedingungen für die Auswahl für spezifische Arten aus einer Gemischten Kultur. Einige mikrobielle Arten sind Generalisten und in der Lage, eine Vielzahl von Staaten oder Umgebungen zu tolerieren. Solche Organismen können unter Laborbedingungen leicht wachsen, aber sie können auch daran gehindert werden, zu wachsen, wenn ihnen ein extremer Lebensraum gegeben wird - was helfen kann, wenn das Ziel darin besteht, sich für Organismen aus einer gemischten Kultur zu bereichern, die diesem Zustand gegenüber tolerant sind.

Schnelle Organismen können kultivierbar sein, aber nur, wenn bestimmte Bedingungen erfüllt sind. Neisseria- oder Haemophilus-Arten benötigen beispielsweise Medien, die teilweise abgebaute rote Blutkörperchen und eine hohe Kohlendioxidkonzentration enthalten, was auch das Wachstum anderer Arten abschrecken kann. Extremophile sind nach ihrer Vorliebe für extreme Bedingungen, wie sehr niedrige oder hohe Temperaturen, reduzierte oder Sauerstoff mangelende Bedingungen, oder in Gegenwart von hohem Salz benannt. Diese Bedingungen sind für die meisten anderen Mikroben wahrscheinlich unerträglich.

Um einen Organismus von Interesse weiter anzureichern, enthalten einige Medientypen Indikatoren, die Einblicke in den Stoffwechsel des Organismus geben. Mannitol Salz Agar hemmt das Wachstum von Organismen empfindlich auf hohe Salz. Gram negative Bakterien in der Regel nicht überleben, aber die gram positive Staphylococcus Gattung sind in der Lage zu gedeihen. Darüber hinaus zeigt der MSA-Agar alle Kolonien an, die Mannitol fermentieren können, da die sauren Nebenprodukte der Fermentation den Methylrotindikator in den Medien in ein helles Gelb verwandeln. Dies kann eine spezifischere Auswahl einer Art ermöglichen.

Ein weiteres gemeinsames Anreicherungsmedium, Eosin Methylenblau, enthält Eosin- und Methylenblaufarbstoffe, die für grampositive Organismen giftig sind. Es enthält auch Lactose und Bakterien auf diesen Platten, die dies fermentieren können, um Säuren zu produzieren, die den pH-Wert fördernde Farbstoffaufnahme senken. Diese Kolonien nehmen große Mengen an Pigment ein und erscheinen dunkel und metallisch. In diesem Labor wachsen Sie vier verschiedene Testorganismen unter drei verschiedenen Medienbedingungen und dann unter aeroben versus anaeroben Bedingungen, bevor Sie ihre Entwicklung beobachten.

Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, waschen Sie Ihre Hände gründlich und trocknen Sie sie, bevor Sie die entsprechend großen Laborhandschuhe anziehen. Dann sterilisieren Sie die Arbeitsfläche mit 5% Bleichmittel und wischen Sie sie gründlich ab. Als nächstes nehmen Sie eine sterile Impfschlaufe und legen Sie sie in einen leeren 125-Milliliter-Kolben, damit er die Bankoberfläche nicht berührt. Dann, aus dem Kühlschrank, sammeln vier Platten Von Mannitol Salt Agar, oder MSA, vier Platten von Eosin Methylen Blue Agar, EMB, und acht Tryptic Soy Agar, oder TSA, Platten. TSA-Medium ist ein nicht-selektives Wachstumsmedium, das für die beiden unterschiedlichen Umweltbedingungen verwendet wird. Schließlich sammeln Sie Ihre Kulturen des Interesses in einem Rohrregal. Hier werden Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermisund Proteus vulgaris angebaut.

Um zu beginnen, beleuchten Sie einen Bunsenbrenner, der verwendet wird, um die Werkzeuge zu sterilisieren. Legen Sie dann eine MSA-Platte, eine EMB-Platte und zwei TSA-Platten in der Nähe. Wählen Sie dann eine der Bakterienkulturen aus. Sie werden alle vier dieser Platten mit der ersten Kultur impfen. Mit Ihrer freien Hand, nehmen Sie die Impfschlaufe und dann sterilisieren Sie es in der Flamme des Brenners, bis es orange für ein paar Sekunden leuchtet. Lassen Sie die Schleife in der Luft abkühlen. Dann öffnen Sie die Brühe Kulturrohr und schnell flammen die Öffnung. Tauchen Sie die Schleife in die Kultur und streifen Sie dann den Organismus auf den ersten Quadranten der ersten Platte. Dann flammen Die Schleife wieder und streifen den zweiten Quadranten. Wiederholen Sie diese Aktion der Flammensterilisation und dann streifen, um den dritten und vierten Quadranten abzuschließen. Streaking auf diese Weise sollte isolierte Kolonien geben und auch die Bestätigung ermöglichen, dass die Kultur nicht kontaminiert ist.

Ersetzen Sie nun den Deckel und beschriften Sie den Boden der Platte durch den Namen der Bakterien, den Medientyp, das Datum und Ihre Initialen. Wiederholen Sie dann die Streifenbeschichtung mit der gleichen Bakterienkultur für jede der verbleibenden drei Platten, wobei Sie darauf achten, sie jedes Mal zu kennzeichnen. Nun, da die erste Kultur gestreift wurde, wiederholen Sie diese Schritte für die anderen Bakterien, um eine geimpfte MSA-Platte, eine EMB-Platte und zwei TSA-Platten für jede Art zu erhalten. Sobald alle Organismen übertragen sind, entzünden Sie die Schleife ein letztes Mal.

Um zu bestimmen, welche Organismen in einer reduzierten Sauerstoffumgebung wachsen können, öffnen Sie ein versiegeltes Gaskammersystem und platzieren Sie einen Satz von vier TSA-Bakterienplatten darin. Dann legen Sie einen anaeroben Zustandsbeutel in die Kammer und versiegeln Sie ihn fest. Schließlich legen Sie alle Platten, einschließlich der erborts im versiegelten Gaskammersystem, über Nacht in einen 37-Grad-Grad-Inkubator. In Zukunft überprüfen Sie die Platten alle 24 bis 48 Stunden, um den Kolonien Zeit zu geben, zu wachsen und alle Indikator-Reaktanten zu verstoffwechseln.

Um zu beurteilen, wie gut die verschiedenen Bakterienarten auf jede Wachstumsbedingung reagierten, untersuchen Sie zunächst die Platten auf Wachstum und erfassen Sie, welche Arten in der Lage waren, Kolonien auf jedem Medientyp und in der anaeroben versus aeroben Bedingung zu produzieren. Beachten Sie die Farbe der wachsenden Organismen sowie die Größe und Form der Kolonien.

Das Mannitol-Salz-Agar-Medium ist selektiv für grampositive Organismen, die in 6 überleben können. 5% Natriumchlorid. In diesem Experiment bedeutete dies, dass das Gramm negative E. coli und P. vulgaris aufgrund der hohen Salzkonzentrationen nicht wuchsen. S. epidermis und S. aureus konnten jedoch wachsen und bestätigten, dass sie grampositiv sind. Darüber hinaus gibt es einen deutlichen Unterschied zwischen den beiden Arten, weil der S. aureus in der Lage ist, Mannitol zu fermentieren, der den Methylrot-Indikator in den Medien aufgrund der sauren Nebenprodukte der Fermentation in ein helles Gelb verwandelt. Dies war im Fall von S. epidermisnicht zu sehen.

Das EMB-Medium hingegen ist selektiv für gramnegative Organismen, da die eosin- und methylenblauen Farbstoffe toxisch für grampositive Zellen sind. Die äußere Membran von gramnegativen Bakterien verhindert, dass diese toxischen Farbstoffe in die Zellen gelangen, was bedeutet, dass sie wachsen können. Darüber hinaus zeigt dieses Medium an, ob die vorhandenen Bakterienarten in der Lage sind, Lactose zu fermentieren. Hier färben sich E. coli-Kolonien in einer dunkelvioletten Farbe, manchmal mit einem grünen metallischen Glanz, der auf Gärung hinweist. P. vulgaris wächst auf diesem Medium, fermentiert aber keine Lactose und erscheint daher ein hellrosa bis violett es in Gegenwart des Farbstoffs. Im anaeroben Zustand sollten die Bakterienarten auf TSA-Medien noch wachsen, können dies aber im Vergleich zu solchen mit reichlich Sauerstoff sehr schlecht tun. Dies liegt daran, dass keine der Testarten anAerobes sind.

Experimente wie diese zur Bereicherung der Wachstumsumgebung können dazu beitragen, eine bestimmte Art von einer gemischten Probe zu begünstigen und zu isolieren. Sie können auch dazu beitragen, die optimalen Wachstumsbedingungen für verschiedene Bakterienarten in einem Labor zu bestimmen und so die weitere Forschung zu unterstützen.

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Results

Mannitol Salz Agar (MSA): Dieses Medium ist selektiv für grampositive Organismen, die in 6,5% Natriumchlorid überleben können. Die gramnegativen Organismen Escherichia coli und Proteus vulgaris sollten aufgrund der hohen Salzkonzentration auf diesem Medium nicht wachsen können. S. epidermidis und S. aureus sollten wachsen können. Die Medien sind unterschiedlich zwischen den beiden, weil der S. aureus in der Lage ist, das Mannitol zu fermentieren - drehen die Methylrot-Anzeige hellgelb aufgrund der Produktion von Säure als Fermentationsnebenprodukt. S. epidermidis sollte die rosa Farbe auf dem Teller beibehalten.
HINWEIS: Wenn Kolonien klein sind, kann das Wachstum auf diesem Medium eine zusätzliche Inkubation für insgesamt bis zu 48 Stunden bei optimaler Temperatur erfordern - hier 37°C.

Eosin Methylen Blauer Agar (EMB): Dieses Medium ist selektiv für gramnegative Organismen, daher sollten Escherichia coli und Proteus vulgaris Platten Wachstum aufweisen. Die Eosin- und Methylenblaufarbstoffe sind toxisch für grampositive Zellen, so dass keine Streptococcus-Art wachsen sollte. Die äußere Membran gramnegativer Zellen verhindert, dass die Farbstoffe in die Zellen gelangen. Dieses Medium ist differenziert, weil es ermöglicht, für die Fähigkeit des Organismus zu testen, Laktose zu fermentieren. E. coli färbt sich aufgrund der Gärung von Laktose in den Medien eine leuchtend violette Farbe (oft mit einem grünen metallischen Glanz, wenn sie lange genug kultiviert wird). Die P. vulgaris, obwohl in der Lage zu wachsen, fermentiert nicht Lactose (aber es ist in der Lage, andere Zucker zu fermentieren).

Tryptic Soja Agar (TSA): Dieses Medium ist nicht selektiv, daher sollten alle Studienarten wachsen. Vergleicht man jedoch die aeroben und anaeroben Bedingungen, sollten die Platten aus dem Gaspaket weniger Wachstum zeigen (und kleinere Kolonien). Dies liegt daran, dass keines der Bakterien, die in der Demonstration angebaut werden, aerobes sind, aber ihr optimaler Wachstumszustand umfasst Sauerstoff.

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Applications and Summary

Verschiedene Bakterienarten sind in der Lage, in verschiedenen Umgebungen zu wachsen und sind in der Lage, verschiedene Kohlenstoffquellen als eine Möglichkeit zur Erzeugung von Energie zu verwenden. Bei der Arbeit mit diesen als Kulturen im Labor ist es wichtig, die Komponenten der Wachstumsmedien, mit denen gearbeitet wird, zu kennen und die Wachstumsmedien an die Bakterienarten anzugleichen. Wissenschaftler und Diagnostika können die unterschiedlichen biochemischen Reaktionen auch nutzen, um verschiedene Arten von anderen zu isolieren und Bakterien in einer gemischten Umgebung zu unterscheiden und zu identifizieren.

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References

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