Overview
Fuente: Christopher P. Corbo1, Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1
1 Departamento de Ciencias Biológicas, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
Las células procaquerías son capaces de habitar casi todos los ambientes de este planeta. Como reino, poseen una gran diversidad metabólica, lo que les permite utilizar una amplia variedad de moléculas para la generación de energía (1). Por lo tanto, al cultivar estos organismos en el laboratorio, todas las moléculas necesarias y específicas necesarias para hacer energía deben ser proporcionadas en los medios de crecimiento. Mientras que algunos organismos son metabólicamente diversos, otros son capaces de sobrevivir en ambientes extremos como altas o bajas temperaturas, pH alcalino y ácido, ambientes reducidos o ausentes de oxígeno, o ambientes que contienen alta sal (2,3,4). Llamados "extremofílicos", estos organismos a menudo requieren que estos ambientes intensos proliferen. Cuando los científicos buscan cultivar estos organismos, los componentes de los medios de comunicación, así como las condiciones ambientales específicas, deben tenerse en cuenta para cultivar con éxito los organismos de interés.
Los científicos son capaces de cultivar organismos cultivables en el laboratorio porque entienden los requisitos específicos que esas especies necesitan para crecer. Sin embargo, los organismos culturables representan menos del 1% de las especies que se estima que están en el planeta (5). Los organismos que hemos detectado por secuenciación genética pero que no son capaces de crecer en el laboratorio se consideran inculturables (6). En este momento, no sabemos lo suficiente sobre el metabolismo y las condiciones de crecimiento de estos organismos para replicar su entorno en el laboratorio.
Los organismos fastidiosos se encuentran en algún lugar entre los dos primeros. Estos organismos son culturables, pero requieren condiciones de crecimiento muy específicas, como componentes específicos de los medios de crecimiento y/o condiciones de crecimiento específicas. Dos ejemplos de estos géneros son Neisseria sp. y Haemophilus sp., que requieren glóbulos rojos parcialmente descompuestos (también conocidos como agar de chocolate), así como factores de crecimiento específicos y un entorno rico en dióxido de carbono (7). Sin todos los componentes específicos necesarios, estos organismos no crecerán en absoluto. A menudo, incluso con todos sus requisitos, estos organismos crecen mal.
A diferencia de las células eucariotas, que sólo son capaces de crecer en un ambiente aeróbico, u oxígeno que contiene, las células procasinoticas son capaces de crecer anaeróbicamente utilizando varias vías de fermentación para generar una amplia energía (8). Otros prokaryotes prefieren un ambiente microaerofílico, o de oxígeno reducido, o incluso un ambiente conofílico, o de dióxido de carbono alto (9). Estos organismos son más difíciles de enriquecer, ya que la atmósfera debe ser alterada. Los científicos que trabajan con frecuencia con organismos sensibles a un entorno oxigenado normalmente trabajarían en una cámara anaeróbica e incubadora, donde un gas pesado e inerte como el argón se bombea para desplazar el oxígeno (10). Otros hacen uso de sistemas de paquetes de gas sellados disponibles convencionalmente que utilizan agua para generar hidrógeno y dióxido de carbono, junto con un catalizador como el paladio para eliminar todo el oxígeno atmosférico. Estos kits disponibles comercialmente pueden crear cualquiera de las condiciones atmosféricas antes mencionadas (10).
Ya sea cultivando un patógeno para determinar una posible infección o buscando identificar una especie específica de bacterias presentes en un entorno natural, existe un problema. Ninguna especie bacteriana habita en un hábitat. Las bacterias viven como comunidades multicelulares en todas partes, desde la piel de los seres humanos hasta los océanos de nuestro planeta (11). Al intentar aislar una especie de bacteria, los científicos deben trabajar para excluir los numerosos otros organismos que también habitan el área aislada. Por esta razón, los medios de crecimiento enriquecidos para las bacterias a menudo llevan a cabo dos funciones. La primera es hacer que los medios sean selectivos. Un agente selectivo evitará que algunas especies crezcan, sin inhibir y a menudo incluso promover áotras para crecer (12). La segunda función de los ingredientes de los medios de comunicación puede ser trabajar como agentes diferenciales. Estos agentes permiten la identificación de una característica bioquímica particular de un organismo aislado. Al emparejar varios medios selectivos y diferenciales diferentes junto con condiciones de crecimiento adecuadas, los científicos y diagnósticos son capaces de identificar la presencia de especies bacterianas específicas de un aislado particular.
Un ejemplo de un medio selectivo y diferencial que ayuda a la identificación es en el caso del organismo clínicamente significativo Staphylococcus aureus. Este organismo se cultiva típicamente en agar sal de manitol. Este medio no sólo selecciona para sólo los organismos que pueden vivir en un ambiente de alta sal, que incluyen algunos gram positivos como Staphylococcus,sino que también inhibe cualquier organismo sensible a la sal. El azúcar de manitol es el componente diferencial de este medio. De todas las especies clínicamente significativas de Staphylococcus, sólo S. aureus es capaz de fermentar manitol. Esta reacción de fermentación produce ácido como subproducto que hace que el indicador rojo metilo rojo en los medios se vuelva amarillo. Otras especies de Staphylococcus (como Staphylococcus epidermidis)aunque capaces de crecer, dejarán los medios de color rojo.
Este ejercicio de laboratorio demuestra una técnica aséptica adecuada, así como la inoculación adecuada de los medios de crecimiento del caldo. También introduce el crecimiento de organismos contaminantes comunes en medios de enriquecimiento, el uso de un sistema de cultivo anaeróbico de paquete de gas para bacterias anaeróbicas, y el uso de diferentes medios selectivos y diferenciales para la identificación presunta de gramos bacterias positivas y gramnegativas.
Procedure
1. Preparación
- Antes de comenzar, lávese bien las manos y ponte guantes de tamaño adecuado.
- Esterilice la superficie de trabajo con 5% de hipoclorito sódico (blanqueador) y seque bien.
- Coloque un lazo de inoculación en un matraz Erlenmeyer vacío de 120 ml para que no toque la parte superior del banco mientras trabaja.
2. Medios de crecimiento y culturas
- Reúne cuatro platos de agar sal mannitol (MSA), agar azul de eosina metileno (EMB) y ocho agar de soja tríptico (TSA) del refrigerador (estos se pueden comprar comercialmente).
- Coloque las placas en el área de trabajo limpia.
- Reúne los siguientes cultivos de caldo: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidisy Proteus vulgaris. Tenga cuidado: como se trata de organismos aeróbicos, las tapas de los tubos deben estar ligeramente sueltas.
- Coloque todos los cultivos en un bastidor de tubo de ensayo en la superficie de trabajo limpia.
3. Transferencia de cultivos e incubación
- Párese o siéntese en el banco con todos los materiales al alcance.
- Para utilizar la técnica aséptica para transferir las bacterias a la placa, primero flamee el lazo hasta que esté brillante anaranjado - y luego deje que se enfríe en el aire.
- Mientras el lazo se enfría, tome el cultivo de caldo de E. coli,y luego abra la tapa con el uso de su dedo meñique.
- Llama rápidamente la abertura del tubo. Esto evita la contaminación.
- Sumerja el lazo en el tubo y saque el organismo en el primer cuadrante de una placa EMB.
- Después de que se realiza la primera racha, llama el bucle, y luego realizar una segunda racha cruzando la primera racha sólo una o dos veces. Esto permitirá el aislamiento de una sola colonia y determinar si hay alguna contaminación.
- Repita esto hasta que los cuatro cuadrantes de la placa hayan sido rayados.
- Ahora, transfiera cada uno de los cuatro organismos de la misma manera de rayado para que el producto final sea una placa MSA, una placa EMB y dos placas TSA separadas por organismo.
- Una vez que todos los organismos han sido transferidos, llama el bucle una última vez y lo guarda.
- Coloque 1 placa TSA con cada organismo en el paquete de gas y, a continuación, agite un sobre de gas antes de colocarlo en la cámara junto a las placas. Selle bien.
- Incubar todas las placas a 37oC durante la noche.
- Esterilice la superficie de trabajo una última vez con 5% de lejía.
4. Lectura y grabación de resultados
- Retire las placas de la incubadora y colóquelas en un banco de laboratorio limpio
- Tome nota del crecimiento de los organismos en cada placa de su cuaderno de laboratorio. En particular, tome notas detalladas sobre:
- Números y tamaño de las colonias (si están presentes) en cada plato, para cada cepa chapada
- Apariencia del agar que rodea a las colonias que crecen en las placas MSA
- Apariencia de cualquier colonia que crezca en las placas EMB
- Diferencias en el crecimiento entre las placas TSA cultivadas fuera en comparación con el interior del paquete de gas
Las bacterias son capaces de habitar casi todos los ambientes de la Tierra, desde la tundra desértica hasta las selvas tropicales. Esta capacidad de colonizar nichos muy diferentes se debe a su adaptabilidad y gran diversidad metabólica, lo que les permite utilizar una amplia variedad de moléculas para la generación de energía. Es esta enorme variedad de diversidad lo que conduce al fenómeno que menos del 1% de las especies bacterianas en el planeta se consideran culturables y estas sólo son posibles debido a una comprensión de sus necesidades metabólicas y ambientales específicas.
Realizar manipulaciones de medios y medio ambiente en el laboratorio no sólo permite a los investigadores experimentar para encontrar las condiciones óptimas para el cultivo de una especie de interés, sino que también permite el enriquecimiento, el proceso de las condiciones cambiantes para seleccionar para especies específicas de un cultivo mixto. Algunas especies microbianas son generalistas y capaces de tolerar una amplia variedad de estados o ambientes. Estos organismos pueden crecer fácilmente en condiciones de laboratorio, pero también se les puede impedir que crezcan si se les da un hábitat extremo, lo que puede ayudar si el objetivo es enriquecer para los organismos de un cultivo mixto que son tolerantes a esta condición.
Los organismos fastidiosos pueden ser culturables, pero sólo cuando se cumplen condiciones específicas. Las especies de Neisseria o Haemophilus, por ejemplo, requieren medios que contengan glóbulos rojos parcialmente descompuestos y una alta concentración de dióxido de carbono, lo que también puede desalentar el crecimiento de otras especies. Los extremófilos son nombrados por su preferencia por condiciones extremas, tales como temperaturas muy bajas o altas, condiciones reducidas o ausentes de oxígeno, o en presencia de alta sal. Estas condiciones son probablemente intolerables para la mayoría de los otros microbios.
Para enriquecer aún más para un organismo de interés, algunos tipos de medios contienen indicadores que dan una idea del metabolismo del organismo. El agar sal de manitol inhibe el crecimiento de organismos sensibles a la sal alta. Las bacterias Gram negativas típicamente no pueden sobrevivir, pero el género Gram positivo Staphylococcus es capaz de prosperar. Además, el agar MSA indica cualquier colonia capaz de fermentar manitol porque los subproductos ácidos de fermentación convertirán el indicador rojo metilo en los medios de comunicación a un amarillo brillante. Esto puede permitir una selección más específica de una especie.
Otro medio de enriquecimiento común, Eosin Methylene Blue, contiene tintes azules de eosina y metileno, que son tóxicos para los organismos gram positivos. También contiene lactosa y bacterias en estas placas que pueden fermentar esto producirá ácidos que reducen el pH fomentando la absorción del tinte. Estas colonias toman grandes cantidades de pigmento y aparecen oscuras y metálicas. En este laboratorio, crecerá cuatro organismos de prueba diferentes a través de tres condiciones de medios diferentes y luego en condiciones aeróbicas versus anaeróbicas antes de observar su desarrollo.
Antes de comenzar el experimento, lávese bien las manos y séquelas, antes de ponerse guantes de laboratorio de tamaño adecuado. Luego, esterilizar la superficie de trabajo con 5% de lejía, limpiándola a fondo. A continuación, tome un lazo inoculante estéril y colóquelo en un matraz vacío de 125 mililitros para que no toque la superficie del banco. Luego, del refrigerador, recoge cuatro platos de Agar sal Mannitol, o MSA, cuatro placas de agar azul de eosina metileno, EMB y ocho placas de agar de soja tríptico, o TSA. El medio TSA es un medio de crecimiento no selectivo que se utilizará para las dos condiciones ambientales diferentes. Por último, reúna sus culturas de interés en un estante de tubo. Aquí, Se cultivará Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermisy Proteus vulgaris.
Para empezar, encienda un quemador Bunsen, que se utilizará para esterilizar las herramientas. A continuación, coloque una placa MSA, una placa EMB y dos placas TSA cerca de la mano. A continuación, seleccione uno de los cultivos bacterianos. Inoculará las cuatro placas con la primera cultura. Con la mano libre, coge el bucle inoculante y luego esteriliza en la llama del quemador hasta que brille de color naranja durante un par de segundos. Deje que el bucle se enfríe en el aire. A continuación, abra el tubo de cultivo de caldo y flamee rápidamente la abertura. Sumerja el lazo en el cultivo y luego raye el organismo en el primer cuadrante de la primera placa. A continuación, la llama esterilizar el bucle de nuevo y rayar el segundo cuadrante. Repite esta acción de esterilización de llamas y luego raya para completar el tercer y cuarto cuadrante. El rayado de esta manera debe dar colonias aisladas y también permitir la confirmación de que el cultivo no está contaminado.
Ahora, reemplace la tapa y etiquete la parte inferior de la placa con el nombre de la bacteria, el tipo de medio, la fecha y sus iniciales. A continuación, repita el revestimiento de rayas utilizando el mismo cultivo bacteriano para cada una de las tres placas restantes teniendo cuidado de etiquetarlas cada vez. Ahora que el primer cultivo ha sido rayado, repita estos pasos para que las otras bacterias obtengan una placa MSA inoculada, una placa EMB y dos placas TSA para cada especie. Una vez que todos los organismos han sido transferidos, llama el bucle una última vez.
Para determinar qué organismos pueden crecer en un entorno de oxígeno reducido, abra un sistema de cámara de gas sellado y coloque un conjunto de cuatro placas de bacterias DelaT en su interior. A continuación, coloque un sobre de condición anaeróbica en la cámara y séllelo firmemente. Finalmente, coloque todas las placas, incluidas las que están dentro del sistema de cámara de gas sellado, en una incubadora de 37 grados Celsius durante la noche. En el futuro, comprobar las placas cada 24 a 48 horas para dar a las colonias tiempo para crecer y metabolizar cualquier indicador reactivos.
Para evaluar qué tan bien respondieron las diferentes especies bacterianas a cada condición de crecimiento, primero examine las placas para el crecimiento y registre qué especies fueron capaces de producir colonias en cada tipo de medio y en la condición anaeróbica versus aeróbica. Tenga en cuenta el color de los organismos que crecen, así como los tamaños y la forma de las colonias.
El medio de agar sal de manitol es selectivo para organismos gram positivos que son capaces de sobrevivir en 6. 5% de cloruro de sodio. En este experimento, esto significó que el gramo negativo E. coli y P. vulgaris no crecieron debido a las altas concentraciones de sal. S. epidermis y S. aureus fueron capaces de crecer, sin embargo, confirmando que son gram positivos. Además, hay una clara diferencia entre las dos especies porque el S. aureus es capaz de fermentar manitol convirtiendo el indicador rojo metilo en los medios a un amarillo brillante debido a los subproductos ácidos de la fermentación. Esto no se vio en el caso de S. epidermis.
El medio EMB, por otro lado, es selectivo para los organismos gram negativos porque los tintes azules de eosina y metileno son tóxicos para las células gram positivas. La membrana externa de bacterias gram negativas evita que estos dedos tóxicos entren en las células, lo que significa que son capaces de crecer. Además, este medio indica si la especie bacteriana presente es capaz de fermentar la lactosa. Aquí, las colonias de E. coli se tornan de color púrpura oscuro, a veces con un brillo metálico verde que indica la fermentación. P. vulgaris crece en este medio pero no fermenta lactosa y así aparece un ligero rosado a púrpura por estar en presencia del tinte. En la condición anaeróbica, las especies bacterianas en los medios de la TSA todavía deben crecer, pero pueden hacerlo muy mal en comparación con aquellos con amplio oxígeno. Esto se debe a que ninguna de las especies de ensayo son anaerobios obligatorios.
Experimentos como este para enriquecer el entorno de crecimiento pueden ayudar a favorecer y aislar una especie específica de una muestra mixta. También pueden ayudar a determinar las condiciones óptimas de crecimiento para diferentes especies bacterianas en un entorno de laboratorio, ayudando así a la investigación adicional.
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Results
Agar sal mannitol (MSA): Este medio es selectivo para organismos gram positivos que son capaces de sobrevivir en 6.5% cloruro de sodio. Los organismos gramnegativos Escherichia coli y Proteus vulgaris no deben ser capaces de crecer en este medio debido a la alta concentración de sal. S. epidermidis y S. aureus deben ser capaces de crecer. El medio es diferencial entre los dos porque el S. aureus es capaz de fermentar el manitol - girando el indicador rojo metilo amarillo brillante debido a la producción de ácido como subproducto de fermentación. S. epidermidis debe mantener el color rosa en la placa.
NOTA: Si las colonias son pequeñas, el crecimiento en este medio puede requerir incubación adicional para un total de hasta 48 horas a temperatura óptima - aquí, 37oC.
Eosin Methylene Blue agar (EMB): Este medio es selectivo para organismos gram negativos, por lo que las placas Escherichia coli y Proteus vulgaris deben exhibir crecimiento. Los tintes azules de eosina y metileno son tóxicos para las células gram positivas, por lo que ninguna de las especies de Streptococcus debe crecer. La membrana externa de las células gramnegativas impide que los tendedes entren en las células. Este medio es diferencial porque permite que uno pruebe la capacidad del organismo para fermentar la lactosa. E. coli se convierte en un color púrpura brillante (a menudo con un brillo metálico verde si se cultiva lo suficiente) debido a la fermentación de la lactosa en los medios. El P. vulgaris,aunque capaz de crecer, no fermenta lactosa (sin embargo es capaz de fermentar otros azúcares).
Agar de soja tríptico (TSA): Este medio no es selectivo, por lo que todas las especies de estudio deben crecer. Sin embargo, comparando las condiciones aeróbicas frente a anaeróbicas, las placas del paquete de gas deben mostrar menos crecimiento (y colonias más pequeñas). Esto se debe a que ninguna de las bacterias cultivadas en la demostración son aerobios obligatorios, pero su condición de crecimiento óptimo incluye oxígeno.
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Applications and Summary
Diferentes especies bacterianas son capaces de crecer en diferentes ambientes y son capaces de utilizar diferentes fuentes de carbono como una forma de generar energía. Cuando se trabaja con estos como cultivos en el laboratorio, es importante conocer los componentes de los medios de crecimiento con los que se trabaja y hacer coincidir los medios de crecimiento con las especies bacterianas. Los científicos y diagnósticos también pueden explotar las diferentes reacciones bioquímicas como una forma de aislar diferentes especies de otras y como una forma de distinguir e identificar bacterias en un entorno mixto.
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References
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