Overview
ソース: アンドリュー J. ヴァン アルスト1, リアノン M. ルヴェーク1, ナタリア マーティン1, ビクター J. ディリタ1
1ミシガン州立大学微生物・分子遺伝学科、イーストランシング、ミシガン州、アメリカ合衆国
成長曲線は、細菌の成長運動学と細胞生理学に関する貴重な情報を提供します。それらは、細菌が可変増殖条件でどのように反応するかを決定し、特定の細菌に最適な増殖パラメータを定義することを可能にします。原型的な成長曲線は、成長の4つの段階を経て進行します:ラグ、指数、静止、および死(1)。
図1:細菌増殖曲線。バッチ培養で増殖した細菌は、ラグ、指数、静止、死の4つの段階を通じて進行します。ラグフェーズは、細菌が急速な細胞増殖および分裂が可能な生理学的状態に達するのにかかる時間の期間である。指数相は、DNA複製、RNA転写、タンパク質産生がすべて一定の速い速度で起こる最速の細胞増殖および分裂の段階です。静止相は、栄養制限および/または毒性中間蓄積による細菌の増殖の減速および高原化によって特徴付けられる。死期は、重度の栄養制限の結果として細胞リシスが起こる段階である。
ラグフェーズは、細菌が急速な細胞増殖および分裂が可能な生理学的状態に達するのにかかる時間の期間である。この遅れは、細菌が新しい環境に適応するのに時間がかかるために発生します。必要な細胞成分がラグフェーズで生成されると、細菌はDNA複製、RNA転写、タンパク質産生がすべて起こる成長の指数関数的段階に入ります。
Procedure
1. セットアップ
- 必要な実験室材料:液体媒体、固化寒天媒体、エルレンマイヤーフラスコ、15 mL試験管、リン酸緩衝生理食(PBS)、細菌細胞拡散機、70%エタノール、および分光光度計。すべてのソリューションとガラス製品は、使用前に殺菌する必要があります。
- 70%エタノールで殺菌してワークステーションを準備します。メディアの汚染を防ぐために、ブンセンバーナーの近くで作業します。
- 細菌を使用する場合は、適切な個人用保護具と無菌技術を使用する必要があります。細菌培養を行う場合は、ラボコートと手袋が必要です。
- バッファー、ソリューション、試薬のレシピ
- リン酸緩衝生理食液(PBS)(8)。
- ルリア・ベルタニ・ブロス(LB)(9)。
2. プロトコル
- メディアの準備
- 細菌を増殖させ、液体スープと固形寒天(1.5%w/v寒天)の両方の培地を別々のオートクレーブ可能なボトルに調剤する成長培地を特定します。ここで、LBスープとLB寒天は、大腸菌の成長のために調製した。
- オートクレーブで半締め付けキャップでメディアを殺菌し、121 °Cに設定し、35分間使用します。
- 寒天媒体の場合は、オートクレーブ後、50°Cに設定した水風呂に30分間入れ、冷却する。冷却したら、100x15mm円形ペトリ皿に20-25 mL寒天媒体を注ぎます。使用前にプレートを室温で24時間設定してください。
- 細菌の初期調製
- 凍結ストックから、選択した媒体寒天上で単一のコロニー単離物を得るためのストリーク細菌。選択した細菌に対して許容される成長条件でインキュベートする。ここで、大腸菌はLB寒天に縞模様され、一晩37°C(16〜18時間)でインキュベートされる。
- 無菌接種ループを使用して、ストリークプレートから単一のコロニーを選択し、15 mL試験管で4mL液体媒体を接種し、選択した細菌に許容される条件で成長する。ここで、大腸菌は一晩210rpm(16-18h)で振盪で37°Cで成長する。
- 成長曲線の設定
- 成長フラスコ製剤
- オートクレーブ適切なサイズのアーレンマイヤーフラスコ。通常、フラスコ量の合計に対するメディアの比率は 1:5 です。ここで、100mL LB培媒体は500mLフラスコに使用される。
- 血清ピペットを使用して、無菌培分をエルレンマイヤーフラスコに移します。
- 希釈シリーズの準備
- ラベル 15 mL 試験管: -1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、および -9 に 9 mL PBS をそれぞれに分配します。これらの数値は、CFU/mL の計算に使用される希釈係数に対応します。コレクションのタイムポイントごとに、新しいチューブのセットが必要です。(図 2)
- 寒天プレート製剤
- 収集時間と希釈係数を持つラベルプレート。各タイムポイントには、希釈ごとに1つのプレートがあります。
- 成長フラスコ製剤
- 成長曲線プロトコル
- メディアの接種
- ステップ2.2.2の一部として調製された一晩の液体培養を使用して、フラスコ培地を1:1000体の培養量で接種する。ここで、100 μLの一晩液体培養を100mL LB培養剤に添加する。
- メディアを旋回して、細菌を均等に分配します。
- タイムポイントコレクション
- 成長条件の設定
- 所定の細菌に対して選択された実験的な成長条件にフラスコを置きます。タイムポイントは、急速に成長する細菌のために頻繁に取られるべきであり、成長が遅い細菌のためにより長い間隔で取ることができる。ここで、大腸菌は毎分210回転(rpm)で揺れ、1時間ごとに取られるタイムポイントで37°Cで成長します。
- 光学密度(OD600)測定
- 開始時点(t = 0)を含む各タイムポイントで、細菌培養の1 mLを撤回し、分光光度計キュベットに分配する。
- キュベットをきれいに拭き取り、600 nmの波長で光学密度を記録します。光密度読み取り値が 1.0 より大きい場合は、900 μL の新鮮な媒体で培養 1:10 の 100 μL を希釈し、光学密度を記録し、OD600 測定の場合にこの値に 10 を掛けます。
- コロニー形成ユニット(CFU/mL)測定
- 各タイムポイントで、細菌培養の1 mLを撤回し、PBSの9 mLを含む-1ガラス試験管に分配する。
- 希釈シリーズの場合は、-1チューブからすべての希釈チューブを-9に連続的に1mL転送し、各転写後に渦を起用します。(図 2)
- 希釈ごとに、対応する標識された固体媒体寒天プレートに100μLの細胞懸濁液を分配する。(図 2)
- エタノールで殺菌したセル拡散機を用いて、文泉バーナーの炎を通過し、寒天の表面に触れて冷却し、寒天板の表面が乾燥するまで100μLの細胞懸濁液を広げる。
- バクテリアの増殖を支える温度でスプレッドプレートを逆さまにインキュベートします。ここで、大腸菌を37°Cでインキュベートする。
- インキュベーション後、一度目に見えるコロニーが発生したら、各プレート上の細菌コロニーの数をカウントし、各タイムポイントですべてのプレートに関連する希釈係数と共にこれらの値を記録します。
- 成長条件の設定
- メディアの接種
3. データ分析と結果
- 光学密度(OD600)成長曲線プロット
- 光学密度(OD600)と時間を半ログスケールでプロットします。(図 3)
- コロニー形成ユニット(CFU/mL)成長曲線プロット
- 各タイムポイントについて、コロニー数が30〜300菌の範囲内に収まる希釈プレートを選択します。コロニー数に希釈係数を掛け、100 μL スプレッドが CFU/mL を計算する際に追加の 1:10 希釈と見なされるため、10 を掛けます。
- コロニー形成単位と時間を半ログスケールでプロットします。(図 4)
- 各タイムポイントについて、コロニー数が30〜300菌の範囲内に収まる希釈プレートを選択します。コロニー数に希釈係数を掛け、100 μL スプレッドが CFU/mL を計算する際に追加の 1:10 希釈と見なされるため、10 を掛けます。
- 光学密度とコロニー形成ユニットの関係
- OD600とCFU/mLの関係が1.0 OD600を超える精度が低いため、OD600読み取り値が1.0 OD600以下の線形スケールでコロニー形成単位と光学密度をプロットします。ここでは、最初の 6 つのタイムポイントがプロットされます。(図 5)
- 方程式と R2値を表示する線形回帰近似曲線を生成します。
- 細菌の倍増時間の決定
- コロニー形成単位成長曲線プロットを使用して、指数相の間に、グラフ上の2つの点をそれらの間で最も急な勾配で識別し、倍増時間を計算します。
- 倍増時間の計算
- ΔTime = t2 - t1、 t 1 = タイムポイント1およびt2 = タイムポイント 2
-
、ここで b = t 2の細菌数、B = t1の細菌数、およびn = 世代数。 派生元: .
- 次の方法で倍増時間を計算します。
、ここで b = t 2の細菌数、B = t1の細菌数、およびn = 世代数。 派生元: 細菌は細胞分裂と呼ばれるプロセスを通して再生し、2つの同一の娘細胞をもたらす。成長条件が良好であれば、細菌集団は指数関数的に成長します。
細菌の増殖曲線は、時間の関数として培養中の細菌の量をプロットします。典型的な成長曲線は、ラグフェーズ、指数相、静止相、死相の4段階を経て進行します。ラグフェーズは、細菌が急速に成長し、分裂できる状態に到達するのにかかる時間です。この後、細菌は指数相に移行し、急速な細胞増殖および分裂を特徴とする。この段階における細菌培養の指数関数的増殖速度は、特定の条件下で細菌が繁殖できる最速の速度である倍増時間として表すことができる。静止した段階は、細菌細胞の成長高原と環境栄養素の枯渇のために成長と死亡率が均等に出てくる次に来る。最後に、細菌は死期に入る。これは、細菌の成長が急激に減少し、重度の栄養枯渇が細胞の分解につながる場所です。
2つの技術を使用して、培養中に存在する細菌の量を定量化し、成長曲線をプロットすることができます。これらの1つ目は、コロニー形成単位(CFC)を介して行う。CFCを得るためには、9つの希釈の1〜10シリーズが定期的な時点で行われる。これらの希釈の第1は、この例では陰性のもので、9mLのPBSおよび1mLの細菌培養物を含む。1:10希釈係数をもたらす。次いで、この溶液の1mLが次のチューブに転移し、負の2つ、1:100希釈係数をもたらす。このプロセスは、最後のチューブ、負の9を通して継続し、最終的な希釈係数は11億です。この後、各希釈の100マイクロリットルがめっきされる。その後、プレートをインキュベートし、クローンコロニーをカウントします。30 ~ 300 コロニーの間に成長する特定の時間ポイントの希釈プレートは、その時点のミリリットルあたりの CCF を計算するために使用されます。
細菌濃度を測定する第2の一般的な方法は、光学密度です。培養の光学密度は、分光光度計を用いて、メディアブランクに関連して即座に測定することができる。通常、600ナノメートルの波長(OD600とも呼ばれる)は、細胞密度が増加するにつれて増加するこれらの測定に使用されます。光学密度はCFCよりも精度が低いが、瞬時に得ることができ、比較的少ない試薬を必要とするので便利です。両方の技術を一緒に使用して、培養の細菌細胞数をより正確に近似する標準曲線を作成できます。このビデオでは、大腸菌の時立シリアル希釈からCFCとOD600測定を得る方法を学びます。次に、CFUとOD600測定値を用いた2つの成長曲線をそれぞれ、標準曲線で関連する前にプロットする。
細菌を使用する場合は、ラボコートや手袋などの適切な個人用保護具を使用し、適切な無菌技術を観察することが重要です。
この後、70%のエタノールでワークステーションを殺菌します。まず、LBスープとLB固体寒天媒体を別々の自動クレーブ可能なボトルに準備します。ボトルのキャップを部分的に閉じた後、35分間摂氏121度に設定されたオートクレーブでメディアを殺菌します。次に、寒天媒体を50°Cに設定した水浴で30分間冷やします。冷却したら、各ペトリ皿に20~25mLを注ぎます。この後、プレートを室温で24時間設定します。
後で液体細菌培養物を生成するために使用される単一のコロニー単離物を調剤するには、以前に凍結したストックと適切なストリークメッキ技術を使用して、LB寒天の単離のために大腸菌を縞させます。一晩で摂氏37度で料理をインキュベートします。この後、ストリークプレートから単一のコロニーを選択する前に、寒天上の炎殺菌接種ループを冷却します。15 mL試験管に4mLの液体媒体を接種する。その後、210 rpmで振りながら一晩37°Cで大腸菌を成長させます。
成長曲線で使用される細菌培養の1:1000体積を設定するには、まずオートクレーブ500 mLエルレンマイヤーフラスコを得る。次に、50 mLの血清ピペットを使用して、100mLの無菌培った培方をフラスコに移します。次に、9本の15ml試験管を1~9本と連続してラベルを付けます。これらの数値は、コロニー形成単位(CFU)の計算に使用される希釈係数に対応します。次に、各チューブに1X PBSの9 mLを追加します。この後、対応する時間ポイントと成長する希釈因子で準備された寒天プレートにラベルを付けます。大腸菌のこの例では、開始時点の後、時間ポイントは 1 時間に 1 回取得されます。予め調べて調製した一晩液体大腸菌培養を用いて、オートクレーブ500mLエルレンマイヤーフラスコに培養剤を1:1000体の培養量で接種する。メディアを旋回して、細菌を均等に分配します。
分光光度計をブランキングした後、糸くずのない拭き取りでキュベットをきれいにします。次に、培地に培養の1mLを分配し、分光光度計に入れ、その培養の光学密度を時点ゼロで得る。その後、210 rpmで振って37°Cで大腸菌を成長させます。点ゼロ後の各時点で、フラスコから別の1mLの細菌培養を撤回し、光学密度測定を繰り返す。光学密度の読み取り値が 1.0 より大きい場合は、900 マイクロリットルの新鮮な培養物で 100 マイクロリットルの細菌培養物を希釈し、もう一度光学密度を測定します。この値は、OD 600 測定に対して 10 を掛けることができます。
各時点のコロニー形成単位測定を得るために、各時点でフラスコからさらに1mLの細菌培養を引き出す。混合する負の1つの試験管と渦に細菌培養を分配する。次いで、まず負の1つのチューブから1mLを負の2本のチューブと渦に移して混合して希釈系列を行う。負の2本のチューブからマイナスの3本のチューブと渦に1 mLを移して混合します。このシリアル転送を続けて、すべての希釈管を負の9チューブに下ろします。希釈ごとに対応するラベル付きプレートに100マイクロリットルの細胞懸濁液を分配します。希釈のたびに、エタノールで細胞拡散機を殺菌し、ブンセンバーナーの炎を通し、寒天の表面を接種から離して冷却します。次に、セル拡散機を用いて、寒天板の表面が乾燥するまでセル懸濁液を広げる。プレートを摂氏37度で逆さまにインキュベートします。目に見えるコロニーが発生したら、各プレート上の細菌コロニーの数をカウントします。これらの値と、各時点で各プレートに関連する希釈係数を記録します。
OD 600 成長曲線を作成するには、すべてのデータ ポイントがテーブルに正しく入力されていることを確認したら、すべてのタイム ポイントと対応するデータを選択します。コロニー形成単位成長曲線プロットを生成するには、コロニー数が各時点で30~300個の細菌の範囲内に入った希釈板を選択する。コロニー数に希釈係数を掛け、次に 10 を掛けます。これは、100マイクロリットルの広がりは、1ミリリットル当たりのコロニー形成単位を計算する際に追加の1:10希釈と見なされるためです。この後、コロニー形成単位と時間を半対ログスケールでプロットします。
OD 600およびCFU測定で生成されたこれらのプロットは、それぞれ、大腸菌成長運動学に関する貴重な情報を提供することができます。光学密度とコロニー形成ユニットを関連させることができ、OD 600測定から1ミリリットル当たりのCCFを推定できるため、将来の実験で時間と材料を節約できます。
これを行うには、OD 600読み取り値が 1 以下の直線スケールで、オプティカル密度に対してコロニー形成単位をプロットします。0. この後、Y = MX + B 形式で線形回帰トレンドラインを生成し、M は勾配、B は y 切片です。データポイントを右クリックし、トレンドラインと線形を追加します。次に、チェックボックスをオンにしてグラフ上の方程式を表示し、グラフに R 二乗値を表示します。R 二乗値は、データが適合回帰直線にどの程度一致したかを統計的に測定したものです。この例では、最初の 6 つの時点点が x 軸に OD 600、Y 軸に 1 ミリリットルあたりの CFC でプロットされます。同じ成長条件を持つ将来の実験では、これらの傾き値と Y 切片値をこの方程式に接続して、OD 600 の読み取り値から CFC を推定できます。次に、コロニー形成単位成長曲線プロットを見てみましょう。指数フェーズでは、それらの間に最も急な勾配を持つ 2 つのポイントを識別します。倍率を計算するには、まず選択した時間ポイント間の時間の変化を計算します。次に、ここに示す方程式を使用して世代の変化を計算します。ここで、小文字bは、点数3における細菌数3と大文字Bが時点2における細菌数である。最後に、時間の変化を世代の変化で割ります。この例では、倍の時間は 0 です。26時間15分19秒異なる実験処理間で倍増時間を比較することで、特定の細菌種に対する最良の成長条件を特定することができます。したがって、最も低い倍増時間の治療は、試験された条件の中で最も最適である。
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Results
コロニー形成単位と光学密度のプロットは、成長運動を視覚化する2つの方法です。CFU/mLとOD600の関係を決定することにより、光学密度プロットは、時間の経過に伴うCFU/mLの推定値も提供します。最短の倍増時間をもたらす条件は、与えられた細菌の増殖に最適と考えられる。
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Applications and Summary
成長曲線は、細菌の成長運動学と生理学を理解するために貴重です。それらは、細菌が可変増殖条件でどのように反応するかを決定し、特定の細菌に最適な増殖パラメータを定義することを可能にします。コロニー形成ユニットと光学密度プロットの両方には、ラグ相の持続時間、到達した最大細胞密度、および細菌の倍増時間の計算を可能にする貴重な情報が含まれています。成長曲線はまた、同じ成長条件下で異なる細菌間の比較を可能にします。さらに、光学密度は初期の接種を標準化する手段を提供し、他の実験の一貫性を高める。
成長曲線実験を設計する際に使用する方法を決定するには、考慮する必要があります。成長曲線を生成するための好ましい方法として、コロニー形成単位プロットは、バッチ培養における生存可能な細胞数をより正確に反映する。コロニー形成ユニットプロットはまた、光学密度測定を妨げる条件で細菌の増殖を測定することを可能にする。しかし、それは試薬の広範な使用を必要とし、より時間のかかるプロセスであり、手動で行う必要があります。光学密度プロットは精度が低く、コロニー形成単位の推定値のみを提供し、固有の細菌ごとに標準曲線を生成する必要があります。光学密度は、時間がはるかに少なく、多くの試薬を必要としないため、主に利便性のために使用されます。光学密度に最も魅力的なのは、分光光量インキュベーターが自動的に成長曲線を生成し、一度にテストできる培養条件の数を大幅に増加させ、常に培養に出席する必要性を排除できることです。
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References
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