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Microbiology

Tests de susceptibilité aux antibiotiques : Tests d'epsilomètre pour déterminer les valeurs MIC de deux antibiotiques et évaluer la synergie antibiotique

Overview

Source: Anna Blàckberg1, Rolf Lood1
1 Département des sciences cliniques Lund, Division de médecine de l'infection, Centre biomédical, Université de Lund, 221 00 Lund Suède

La connaissance des interactions entre les antibiotiques et les bactéries est importante pour comprendre comment les microbes évoluent la résistance aux antibiotiques. En 1928, Alexander Fleming découvre la pénicilline, un antibiotique qui exerce sa fonction antibactérienne en interférant avec la régénération de la paroi cellulaire (1). D'autres antibiotiques avec divers mécanismes d'action ont été découverts par la suite, y compris des médicaments qui inhibent la réplication de l'ADN et la traduction des protéines chez les bactéries; cependant, aucun nouvel antibiotique n'a été développé ces dernières années. La résistance aux antibiotiques actuels a augmenté, ce qui a entraîné des maladies infectieuses graves qui ne peuvent pas être traitées efficacement (2). Ici, nous décrivons plusieurs méthodes pour évaluer la résistance aux antibiotiques dans les populations bactériennes. Chacune de ces méthodes fonctionne, quel que soit le mécanisme d'action des antibiotiques utilisés, parce que la mort bactérienne est le résultat mesuré. La résistance aux antibiotiques est non seulement rapidement disséminée spécifiquement dans les milieux hospitaliers, mais aussi dans toute la société. Afin d'étudier de tels moyens de résistance, différentes méthodes ont été développées, y compris le test Epsilomètre (E-test) et le test de dilution du bouillon (3).

Le test électronique est une méthode bien établie et un outil rentable qui quantifie les données de concentration inhibitrice minimale (MIC), la plus faible concentration d'un antimicrobien qui inhibe la croissance visible d'un micro-organisme. Selon la souche bactérienne et les antibiotiques utilisés, la valeur du MIC peut varier entre le sous-g/mL et le 4. Le test Électronique est effectué à l'aide d'une bande de plastique contenant un gradient antibiotique prédéfini, qui est imprimé avec l'échelle de lecture du MIC en 'g/mL. Cette bande est directement transférée sur la matrice d'agar lorsqu'elle est appliquée sur la plaque d'agar inoculée. Après l'incubation, une zone d'inhibition elliptique symétrique est visible le long de la bande à mesure que la croissance bactérienne est empêchée. LE MIC est défini par la zone d'inhibition, qui est le point de terminaison où l'ellipse croise la bande. Une autre méthode courante pour déterminer LE MIC est la méthode de dilution des microbroths. La dilution du microbroth incorpore différentes concentrations de l'agent antimicrobien ajouté à un milieu bouillon contenant des bactéries inoculées. Après l'incubation, le MIC est défini comme la plus faible concentration d'antibiotiques qui empêche la croissance visible (5). Il s'agit également d'une méthode quantitative qui peut être appliquée à plusieurs bactéries. Les inconvénients de cette méthode comprennent la possibilité d'erreurs lors de la préparation des concentrations des réactifs et le grand nombre de réactifs requis pour l'expérience. La mesure de la résistance aux antibiotiques est impérative du point de vue clinique et de la recherche, et ces méthodes in vitro d'étude de la résistance sont discutées et présentées ci-dessous.

Le profil de résistance pour une bactérie spécifique peut être appliqué afin d'optimiser le traitement antibiotique afin de déterminer si un patient bénéficierait d'un traitement combiné par rapport à un traitement unique. Pour l'utilisation de plus d'un antibiotique à la fois, il est impératif de connaître leurs interactions les uns avec les autres et s'ils ont un effet additif, synergique ou antagoniste. Un effet additif peut être vu lorsque l'effet articulaire des antibiotiques équivaut à la puissance des antibiotiques individuels administrés à dose égale. La synergie entre les antibiotiques, d'autre part, est présente lorsque l'effet articulaire des antibiotiques est plus puissant que si le médicament serait administré seul (6). L'application de combinaisons de traitement antimicrobien est utilisée pour éviter l'apparition de la résistance aux antimicrobiens afin d'améliorer l'effet du traitement antibiotique individuel (7). La connaissance de l'antagonisme est également aussi importante pour prévenir l'utilisation inutile de combinaisons d'antimicrobiens. La méthodologie de test électronique offre des moyens simples et de plusieurs façons de déterminer la synergie et l'antagonisme possibles entre les différents agents antimicrobiens. Afin de faire face à la prolifération des agents pathogènes résistants aux antibiotiques, la connaissance des mécanismes synergiques et antagonistes possibles de certains antibiotiques est importante, ce qui entraîne une efficacité clinique et lutte contre la multirésistance aux médicaments.

La détermination de la synergie à l'aide des tests e peut être divisée en deux approches générales : les tests croisés et non croisés. Bien que les deux tests de synergie s'appuient sur la connaissance antérieure des valeurs individuelles du MIC, les deux approches sont légèrement différentes en méthodologie et en approche conceptuelle. Dans un test de synergie non croisé, le premier antibiotique de la paire à être testé est placé sur une plaque d'agar inoculée avec des bactéries. Après avoir permis aux antibiotiques de la première bande infuser la plaque (par exemple après 1 heure), la bande est enlevée et une nouvelle bande contenant le deuxième antibiotique est placé au même endroit que le premier, en veillant à placer les deux valeurs MIC individuelles sur le dessus de chaque ot son. La zone d'inhibition qui en résulte peut ensuite être analysée comme décrite ci-dessus, et la synergie calculée sur la base de l'équation 1.

Équation 1 - Concentrations inhibitrices fractionnelles (FIC)

Les valeurs de la marque sont des valeurs qui démontrent une synergie.

Tout en récompensant l'examinateur avec des plaques faciles à analyser, la méthode est un peu laborieuse et longue en raison du changement de bandes, ainsi que la nécessité d'utiliser deux plaques par expérience. Au lieu de cela, un test croisé est souvent utilisé. Au lieu d'ajouter les deux bandes d'essai E différentes par la suite sur l'autre (aprèsl'enlèvement de la première), les deux sont placés simultanément, mais sous la forme d'une croix (angle de 90 degrés), avec les deux valeurs MIC précédemment déterminées formant l'angle de 90 degrés. Par cette approche, une seule plaque est nécessaire par test de synergie, ainsi que moins de travail, ce qui en fait un choix préféré en dépit d'être un peu plus difficile à analyser. Les nouvelles valeurs du MIC dans l'approche combinée des antibiotiques peuvent être visualisées comme les zones d'inhibition modifiées, après quoi la synergie peut être déterminée par l'équation 1.

Au lieu d'utiliser une approche de plaque d'agar, une approche de microbroth peut souvent être préférentielle en raison de sa plus grande flexibilité (par exemple, la capacité de choisir des concentrations spécifiques d'antibiotiques en dehors des limites d'une bande de test électronique). En outre, les tests de microbroth sont suggérés pour être plus sensibles en raison de leur distribution uniforme d'antibiotiques dans une solution liquide, ne dépend pas de la dissociation dans une phase solide (plaque d'agar). Les puits dans une microplaque de 96 puits seront inoculés avec un nombre fixe de bactéries (106 cfu/mL : la concentration bactérienne peut être estimée par des mesures OD600 nm, des normes de turbidité, ou par des échantillons de placage de 10x dilutions bactériennes en série), et antibiotiques dans différentes dilutions seront ajoutés aux puits. De même, pour les bandes e-test MIC est déterminé comme l'intersection (bien / spot) avec la plus faible concentration d'antibiotiques inhibant la croissance visible des bactéries.

Objectif expérimental

  • Le projet ci-dessous décrit les stratégies visant à déterminer les valeurs MIC de la pénicilline G et de la gentamicine du groupe G de Streptococcus par deux méthodes différentes, le test électronique et la dilution du microbroth. Pour l'essai électronique, les plaques d'agar De Mueller-Hinton inoculées avec le groupe G de Streptococcus ont été employées en combination avec des bandes de gradient de la pénicilline G et/ou de la gentamicine ; tandis que MH-broth avec 50% de sang de cheval lysé et 20 mg/mL -NAD ont été utilisés avec des antibiotiques solubles avec streptocoque groupe G dans une approche de microbroth.

Matériaux

  • Colonies bactériennes sur une plaque d'agar de sang, stockées 7 jours dans 4 oC
  • Plaques d'agar de sang
  • 0.5 Norme McFarland
    • 1% BaCl2
    • 1% H2SO4
  • Tube salin (2 mL)
  • Applicateur à pointe de coton
  • Plaques d'agar Mueller-Hinton (plaques MHA)
  • Bouillon MH avec 50% de sang de cheval lysé et 20 mg/mL-NAD (MH-F)
  • E-test pénicilline/gentamicin (ou antibiotiques d'intérêt) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, France, Suède)
  • Pénicilline/gentamicine (ou antibiotiques d'intérêt (poudre/solution))

Remarque : Les médias spécifiques utilisés pour la croissance bactérienne peuvent varier selon les espèces.

Procedure

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1. Tests d'epsilomètre (E-tests)

  1. arrangement
    1. Portez des gants et une blouse de laboratoire
    2. Préparer l'espace de travail en le stérilisant à l'aide de 70 % d'éthanol
    3. Recueillir les plaques d'agar Mueller-Hinton (plaques MHA)
  2. Préparation d'une norme de turbidité McFarland no 0.5
    1. Préparer une solution de 1% de chlorure de baryum (BaCl2):
      Ajouter 1 gramme de chlorure de baryum anhydre (BaCl2) dans 100 ml d'eau distillée. Vortex bien.
    2. Préparer une solution de 1% d'acide sulfurique (H2SO4):
      Ajouter 1 ml de H2SO4 concentré dans 99 ml d'eau distillée. Vortex bien.
    3. Préparer une norme de turbidité McFarland no 0.5 :
      50 l Solution BaCl2 en 5 ml de 1% H2SO4 solution. Vortex la solution bien pour obtenir une suspension turbide.
    4. Gardez la norme de turbidité McFarland no 0.5 dans un tube recouvert de papier d'aluminium. Conserver à 25oC pendant un maximum de 6 mois. Vortex bien à une solution homogène avant utilisation.
  3. Préparation des plaques MHA
    1. Scrape Streptococcus groupe G bactéries de la plaque d'agar de sang à l'aide d'une boucle stérile. Mélanger dans 1mL de salin, et le vortex à une suspension de la bactérie.
    2. Comparez la suspension à une norme McFarland no 0.5 pour obtenir la même turbidité afin d'avoir la même taille d'inoculum pendant les expériences. Ajuster la concentration à l'aide d'un salin ou d'une bactérie supplémentaire.
    3. Inoculer les plaques MHA à l'aide d'un applicateur à pointe de coton stérile. Écouvillons la plaque délicatement pour couvrir la surface. Procédez avec l'une des trois méthodes décrites ci-dessous (1.4-1.6).
  4. Test unique de résistance aux antibiotiques. Streptococcus groupe G, résistance à la pénicilline G ou gentamicine 
    1. Placez une bande d'essai E (pénicilline G ou gentamicine) au centre de la plaque MHA (figure 1 A,B).
    2. Incuber pendant 18-20 heures, 37oC.
    3. Lisez les résultats. Le MIC est mesuré comme la zone d'inhibition qui croise la bande d'essai d'antibiotiques notée (Figure 1 C,D).

Figure 1
Figure 1 : Test électronique unique. Placement d'une bande E-test de A) pénicilline G et B) gentamicine sur une plaque d'agar Mueller Hinton recouverte de colonies bactériennes d'un groupe G streptocoques avant (A et B) et après (C et D) du jour au lendemain incubation à 37oC 5% CO2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Test de synergie inter-approche. Streptococcus groupe G, résistance à la pénicilline G et gentamicine.
    1. Placez deux bandes d'essai Électronique avec différents antibiotiques (p. ex. pénicilline G et gentamicine) sur la plaque MHA inoculée dans une formation croisée.
      1. Pour obtenir les résultats les plus précis, visez à placer la croix à un angle d'environ 90 degrés à l'intersection des échelles à leurs valeurs MIC, précédemment déterminées à l'essai unique de résistance aux antibiotiques (figure 2 A).
      2. Notez qu'une fois que les bandes sont placées sur la plaque d'agar, elles ne doivent pas être déplacées, puisque certains antibiotiques peuvent déjà avoir été absorbés par la plaque. Par conséquent, il est plus approprié de maintenir les bandes à un angle légèrement erroné (p. ex. 85 degrés) et jusqu'à 1-2 mm de la valeur réelle du MIC. Il est conseillé d'exécuter l'expérience en triplicate pour réduire ce problème.
    2. Incuber pendant 18-20 heures, 37oC.
    3. Lisez les résultats. Le MIC est mesuré comme la zone d'inhibition qui croise la bande d'essai antibiotique notée sur chaque bande de test Électronique respective (figure 2 B).
    4. Utilisez la formule pour la concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) (Équation 1) afin de déterminer la synergie.

Figure 2
Figure 2 : Détection du synergisme - test croisé. Résultats des tests de synergie antimicrobienne s'est fait au MIC de la pénicilline G et de la gentamicine sur le groupe G de Streptococcus avant (A) et après (B) l'incubation pendant la nuit à 37 oC 5 % CO2. Un angle de 90 degrés est formé entre les deux valeurs MIC individuelles (pénicilline G : 0,094 g/mL, gentamicine : 8 g/mL). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Approche non croisée de test de synergie. Streptococcus groupe G, résistance à la pénicilline G et gentamicine.
    1. Placez la bande e-test au centre de la plaque MHA (Figure 3 A,D).
    2. Marquez l'endroit où la valeur MIC précédemment déterminée se trouvait sur chaque bande.
    3. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
    4. Jeter la bande d'essai E pour chaque plaque MHA (Figure 3 B,E).
    5. Placez la deuxième bande d'essai électronique (contenant un antibiotique différent) sur la zone de la bande enlevée antérieure respectivement afin que leurs valeurs MIC correspondent à la marque et soient alignées.
    6. Incuber pendant 18-20 heures, 37oC.
    7. Lisez les résultats. Le MIC est mesuré comme la zone d'inhibition qui croise la bande d'essai antibiotique notée sur chaque bande de test Électronique respective (figure 3 C,F).
    8. Afin de déterminer la synergie, la formule de concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) est utilisée (Équation 1).

Figure 3
Figure 3 : Détection du synergisme - test non croisé. Résultats des tests de synergie antimicrobienne s'estconcentré sur le MIC de la pénicilline G et de la gentamicine sur le groupe De Streptococcus G. A) bande de gentamicin (8 g/mL centré) au-dessus de la bactérie du groupe G de Streptococcus, B) Enlèvement de la bande de gentamicine, C ) Bande combinée de gentamicine / pénicilline G (0,094 g/mL centré) au-dessus de la bactérie Streptococcus groupe G, D) penicilline G bande (0,094 g/mL centré), E) Enlèvement de la penicilline G bande, F) Pénicilline combinée G / la bande de gentamicine (8 g/mL centré) sur le dessus des bactéries du groupe G de Streptococcus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Test de bouillon

  1. arrangement
    1. Portez des gants et une blouse de laboratoire
    2. Préparer l'espace de travail en le stérilisant à l'aide de 70 % d'éthanol
    3. Recueillir 15mL de bouillon MH avec 50% de sang de cheval lysé et 20 mg/mL de NAD (MH-F)
  2. (Facultatif) Effectuer un e-test [Protocole 1] pour déterminer le MIC sur le milieu solide
    1. Bien qu'elles soient facultatives, ces connaissances permettront une meilleure conception expérimentale (p. ex., les concentrations d'antibiotiques ajoutés peuvent être conçues pour entourer la valeur du MIC déterminée à partir de la plaque), ce qui améliorera les chances d'une expérience réussie.
  3. Préparation d'un inoculum bactérien. Comme indiqué ci-dessus, la concentration bactérienne peut être estimée par des mesures OD nm ou des normes de turbidité McFarland
    1. Méthode OD600 nm
      1. Obtenir une suspension bactérienne avec une concentration bactérienne établie
      2. Diluer la culture dans le bouillon MH-F pour obtenir un OD600 de 0,003
    2. Méthode de turbidité McFarland
      1. Mettre 15 ml de bouillon MH-F dans un tube stérile.
      2. Inoculer le bouillon MH-F avec des bactéries (d'une assiette) à un niveau McFarland. Vortex la solution vigoureusement. Verser la solution dans un plat stérile Petri.
  4. Préparation des antibiotiques
    1. Déterminer la concentration d'antibiotiques souhaitées
      1. Identifier la valeur du MIC à partir du test E (p. ex. 0,125 g/mL pour la pénicilline G et 8 g/mL pour la gentamicine)
      2. Multipliez la valeur MIC de la plaque d'agar par 24-27, correspondant à quatre-sept dilutions en série 2x. Ce sera la concentration de départ d'antibiotiques. (ex. pour la pénicilline G, sept dilutions en série 2x : 0,125 g/mL x 27 à 16 g/mL; pour la gentamicine, quatre dilutions en série 2x 8 g/mL x 24 x 128 g/mL
      3. Multiplier la valeur de départ souhaitée 100x afin de déterminer générer une concentration en stock des antibiotiques (p. ex. stocks de 1,6 mg/mL de pénicilline G et de 12,8 mg/mL de gentamicine)
    2. Préparer une concentration de 100x stocks d'antibiotiques en conséquence
      1. Dissoudre les antibiotiques dans 10mL d'eau autoclaved, et le vortex pour générer une solution de stock (par exemple 16 mg de pénicilline G et 128 mg de gentamicine pour créer les stocks ci-dessus)
  5. Ajouter des bactéries aux puits microplaques
    1. Aliquot 200 le bouillon MH-F contenant des bactéries inoculum aux puits dans les 3 premières rangées d'une plaque de microtiter de 96 puits pour une expérience dans le triplicate.
  6. Ajouter des antibiotiques aux puits microplaques
    1. Ajouter 200 l de bouillon MH-F supplémentaire avec des bactéries à la première colonne de puits (A1, B1, C1) pour porter le volume total à 400 l.
    2. Ajouter 4 ll de la concentration en stock d'antibiotiques à la première colonne de puits. Étant donné que l'échantillon contient 400 L, il se traduira par une dilution 100x des antibiotiques.
    3. Générez une dilution en série 2x en transférant 200 bactéries/antibiotiques de A1 à A2, jusqu'à A11. Pipet vigoureusement entre les dilutions. Répétez l'étape pour des lignes supplémentaires.
    4. Retirez 200 L de la colonne 11 afin que le volume final dans tous les puits soit de 200 l.
    5. Laissez la dernière colonne (A12, B12, C12) sans antibiotiques, comme contrôles.
  7. Déterminer les valeurs du MIC
    1. Incuber la plaque microtiter de 96 puits pendant 24 heures à 37oC sans trembler.
    2. La valeur du MIC est définie comme le dernier puits de la série de dilution qui ne présente aucune croissance visible des bactéries (figure 4). Cette valeur, cependant, ne peut être digne de confiance que si la taille d'inoculum d'origine était correcte.

Figure 4
Figure 4 : Détermination du MIC par dilution du bouillon. MIC est ici défini comme le dernier puits qui montre la clarté (pas de croissance des bactéries) avant qu'il ne change la turbidité. Les lignes sont des doublons de la valeur MIC de la pénicilline G et les lignes sont des doublons de la valeur MIC de la gentamicine, à la fois par rapport à un isolat du groupe Streptococcus G. A) résultat expérimental réel, B) interprétation schématique des valeurs de A ( gris et pas de croissance; blanc et la croissance). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Procédure schématique de la série de dilution pour compter la concentration originale des bactéries. Les dilutions ont été effectuées telles que décrites (20 l diluées dans 180 l pour une série de dilution 10x), puis 10 L des rangées A-H sont plaquées sur deux plaques d'agar de sang distinctes comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Déterminer la taille originale de l'inoculum
    REMARQUE: Les essais de microbroth sont très sensibles pour la taille originale d'inoculum utilisée. Une taille excessive d'inoculum donnera un résultat faussement positif, puisque les antibiotiques ajoutés ne pourront plus inhiber la croissance à ce ratio. Par conséquent, il est essentiel de vérifier combien de bactéries ont été ajoutées aux micropuits. Bien que les données ne soient pas disponibles au moment de l'expérience (en raison du besoin d'incubation de 24 heures), elles serviront de contrôle. Si le nombre de bactéries ajoutées se situe dans la plage de concentration indiquée, les valeurs MIC peuvent être fiables. Si l'inoculum était trop haut ou trop bas, l'expérience doit être répétée.
    1. Diluer en série les bactéries
      1. Préparer une plaque de microtiter de 96 puits pour diluer la concentration bactérienne d'origine afin de déterminer la taille de l'inoculum. L'optimum est un volume de 200 L avec 105-6 bactéries. Pour effectuer les dilutions, d'abord aliquot 180 L stérile PBS à chaque puits en B-H (en triple1-3).
      2. Ensuite, ajoutez 100 'l de solution bactérienne à A (en triplicate 1-3).
      3. Générer une dilution en série 10x (en triplicate) en transférant 20 bactéries de A à B, pipet vigoureusement. Répétez les étapes pour C-H.
    2. Plaquer les dilutions bactériennes pour la détermination de la taille de l'inoculum
      1. Marquez les plaques d'agar de sang selon la figure 5.
      2. Transférer 10 l de la dilution en série à la plaque selon la figure 5.
      3. Incuber la plaque à 37oC pendant 20-24 heures.
    3. Déterminer la taille de l'inoculum bactérien
      1. Compter les nombres bactériens dans les endroits dans les colonies de 5-50 (figure 6).
      2. Calculer la taille initiale de l'inoculum en calculant la moyenne des échantillons triplicate, multiplier par le facteur de dilution (par exemple 10x pour les échantillons B, 100x pour les échantillons C, 1000x pour les échantillons D, etc.) et ensuite par 100 pour compenser le volume de repérage de 10 L, ce qui a pour résultat le taille de l'inoculum en cfu/mL. Si l'inoculum est dans 105-6 cfu/mL les données MIC peuvent être fiables.

Figure 6
Figure 6 : Détermination de la taille de l'inoculum. Les bactéries inoculées selon la figure 5 ont été incubées pendant 20-24 heures à 37oC, puis comptées. La rangée D compte un bon nombre de colonies (p. ex. 5-50). Les échantillons en A ne sont pas dilués, B est dilué 10x, C est dilué 100x, et D est dilué 1000x, et seulement 10 L est plaqué dans chaque endroit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La susceptibilité aux antibiotiques est définie comme la sensibilité d'une bactérie aux antibiotiques et peut être mesurée à l'aide d'un test de dilution du bouillon ou d'un test d'epsilomètre, également appelé E-test.

Dans la méthode de dilution du bouillon, un nombre normalisé de bactéries sont ajoutés à un milieu de croissance contenant des dilutions antibiotiques en série. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se développer à des concentrations plus élevées d'antibiotiques, mais continuent de se multiplier aux concentrations d'antibiotiques les plus faibles, ce qui entraîne la turbidie des médias. La plus faible concentration d'antibiotiques à laquelle les bactéries ne peuvent plus survivre ou se multiplier est appelée la concentration inhibitrice minimale, ou MIC, valeur de l'antibiotique pour les bactéries données.

Dans un E-test, une bande de plastique imprégnée d'un gradient prédéfini d'antibiotique est appliquée sur une pelouse fraîchement répandue de bactéries sur une agar Mueller-Hinton, ou MH-A, plaque Petri. L'antibiotique se diffuse dans le support d'agar, où il est pris par les bactéries. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se multiplier et mourront, formant une zone claire autour de la bande Électronique, qui est appelée zone d'inhibition de la croissance. Au point où la croissance se croise avec la bande Électronique, la valeur correspondante sur l'échelle donne la valeur MIC de l'antibiotique.

Souvent, les antibiotiques sont utilisés en combinaison pour empêcher l'émergence de souches résistantes aux antibiotiques de bactéries. Il en résulte souvent un effet synergique plutôt qu'additif. Synergique signifie que l'effet combiné des deux antibiotiques est plus grand que la somme de leurs activités individuelles. Cependant, l'effet n'est considéré comme significatif que lorsque la valeur MIC de la combinaison d'antibiotiques diminue d'au moins deux fois. Ce critère est évalué en calculant l'indice de concentration inhibitrice fractionnaire, ou FIC. En résumant le rapport du MIC de chaque antibiotique en combinaison avec le MIC de chaque antibiotique individuellement, un indice FIC inférieur à 0,5 indique une synergie.

La synergie antibiotique peut être mesurée à l'aide de deux méthodes basées sur l'e-test : un test non croisé ou un test croisé. Dans un test non croisé, premièrement, les e-bandes pour deux antibiotiques différents avec des valeurs MIC prédéterminées sont appliquées à deux plaques distinctes. Une fois que les antibiotiques se sont diffusés dans le milieu, les e-bandes d'origine sont enlevées et les E-bandes pour les antibiotiques alternatifs sont placées de telle sorte que leurs écailles de MIC se trouvent exactement sur les échelles de MIC des bandes précédentes. Dans un test croisé, qui est une version plus rapide de l'essai non croisé, les E-bandes des deux antibiotiques sont placées ensemble dans une formation croisée, de sorte que les écailles de leurs marques MIC forment un angle de 90 degrés à l'intersection. Après l'incubation dans les deux techniques, la valeur MIC de chaque antibiotique en combinaison avec l'autre antibiotique est lue au point où la zone d'inhibition de la croissance se croise avec le bord de la bande Électronique. Ensuite, l'indice FIC est calculé.

Cette vidéo démontrera comment déterminer la valeur MIC d'un antibiotique donné pour une bactérie donnée à l'aide d'un test électronique et d'un test de dilution micro bouillon. Vous apprendrez également comment déterminer la synergie entre deux antibiotiques à l'aide d'un test croisé et d'un test non croisé.

Pour commencer, mettez tout équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants de laboratoire et une blouse de laboratoire. Ensuite, stériliser l'espace de travail à l'aide de 70% d'éthanol. Ensuite, recueillir 15 millilitres de bouillon stérile Mueller-Hinton avec 50% de sang de cheval lysé et 20 milligrammes par millilitre de bêta-nicotinamide. Et cinq à huit plaques d'agar Mueller-Hinton. Maintenant, pour préparer un numéro standard de turbidité McFarland 0.5, mesurez 9.95 millilitres de solution d'acide sulfurique de 1%. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de 1% de chlorure de baryum solution à la solution d'acide sulfurique. Vortex la solution bien pour obtenir une suspension turbide. Couvrir le tube de papier d'aluminium et le réserver. Ensuite, dispenser un millilitre de solution saline dans un tube de 15 millilitres.

Utilisez une boucle stérile pour gratter un échantillon de la croissance bactérienne de votre plaque d'essai bactérienne, ici, Streptococcus groupe G. Ensuite, placez la boucle chargée de bactéries dans la solution saline, remuer doucement, puis vortex le tube bien. Maintenant, placez la suspension bactérienne et les normes de turbidité McFarland côte à côte et comparez-les pour l'équivalence de turbidité. Ajouter des colonies saline ou bactériennes supplémentaires jusqu'à ce que la turbidité de la suspension bactérienne corresponde à celle de la norme. Une fois que la turbidité désirée est obtenue, trempez un applicateur stérile de pointe de coton dans la suspension bactérienne. Pour inoculer la plaque MH-A, tamponnez doucement toute la surface de la plaque avec un mouvement en zigzag. Ensuite, étiquetez les côtés inférieurs des plaques avec le nom de la bactérie et la date.

Pour commencer, sortir une bande de pénicilline G E-test, en la tenant par le bord avec des forceps. Placez délicatement la bande au centre de la plaque MH-A fraîchement tamponnée et remplacez le couvercle. Dans cet exemple, un deuxième antibiotique, la gentamicine, est également testé. Ainsi, le processus de placement de bande est répété avec la deuxième plaque et une bande de e-test de gentamicine. Pour déterminer les résultats du test E, collectez la première plaque qui contient la bande de test G E de la pénicilline. Maintenant, déterminez le point où la zone d'inhibition se croise avec la bande d'antibiotiques. Lisez la valeur numérique correspondante sur l'échelle. Cette valeur représente la valeur MIC de la pénicilline G. Déterminer la valeur MIC pour la gentamicine de la même manière.

Pour commencer, inoculer une plaque MH-A avec des bactéries souches du groupe G de Streptococcus. Étiquetez le fond de la plaque avec le nom des bactéries, des antibiotiques à utiliser et de la date. Maintenant, placez une bande d'essai e pour l'antibiotique d'intérêt dans le centre de la plaque. Ensuite, maintenez la deuxième bande d'essai à un angle de 90 degrés à la première bande et localisez sa marque MIC. Pose doucement la deuxième e-bande sur la première au point où les deux valeurs MIC se croisent. Une fois les bandes placées, ne les déplacez pas. Ensuite, incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures.

Après avoir inoculé deux plaques MH-A, avec des bactéries souches du groupe G de Streptococcus, placez une bande d'essai E pour un antibiotique à la surface d'une plaque. Ensuite, placez une bande d'essai électronique pour l'autre antibiotique sur la deuxième plaque comme démontré. À l'aide d'une boucle d'inoculation en plastique, marquez la valeur MIC de chaque antibiotique à la surface de sa plaque respective. Ensuite, couvrez les assiettes et incuber à température ambiante pendant une heure. Après cela, utilisez des forceps pour enlever les bandes E. Ensuite, collectez l'une des plaques et une bande de test E pour l'autre antibiotique. Maintenez la bande E-test sur l'empreinte laissée par la première bande et localisez le point où la valeur MIC sur la bande E s'aligne avec la ligne marquée. Placez délicatement la bande à ce point d'intersection. Répétez ce processus pour la deuxième plaque et incubez les deux plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures.

Tout d'abord, obtenir une suspension bactérienne avec une concentration bactérienne établie et diluer la culture dans le bouillon MHF pour atteindre un OD600 de 0,003. Ensuite, peser 16 milligrammes de pénicilline G et 128 milligrammes de gentamicine. Transférer chaque antibiotique sec pesé dans des tubes coniques de 215 millilitres. Ajouter 10 millilitres d'eau distillée à chacun des tubes coniques et bien mélanger par vortex. Étiqueter les tubes avec le nom et la concentration des antibiotiques.

En effectuant l'analyse en triplicate, ajouter 400 microlitres de la solution bactérienne de travail dans les premiers puits de trois rangées d'une plaque de microtimètre de 96 puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la solution bactérienne de travail dans le bouillon MHF aux puits des trois rangées. Maintenant, pour générer une dilution antibiotique en série double, d'abord ajouter quatre microlitres de stock d'antibiotiques au premier puits, générant une dilution 100 fois. Séquentiellement, transférer 200 microlitres de bactéries-antibiotique solution à chaque puits, à partir du premier puits à travers le puits deuxième à dernier dans chaque rangée, assurer un bon mélange par pipetting deux à trois fois après chaque transfert. Jetez les 200 derniers microlitres de solution bactéries-antibiotiques.

Pour déterminer les résultats du test de micro dilution du bouillon pour la pénicilline G, localiser d'abord les puits qui ne présentent aucune croissance bactérienne visible, indiquée par un manque de turbidité. À partir de ces puits, identifiez le puits avec la plus faible concentration d'antibiotiques. Cela représente la valeur MIC de la pénicilline G pour les bactéries testées. La valeur MIC de la gentamicine peut être déterminée en utilisant le même résultat et la même technique.

Pour déterminer les résultats de l'essai non croisé, collectez la première plaque, qui contient une bande de pénicilline G E. Ensuite, déterminez le point où la zone d'inhibition de la croissance se croise avec la bande d'antibiotiques. La valeur correspondante sur l'échelle représente la valeur MIC pour la pénicilline G en combinaison avec la gentamicine. Dans cet exemple, la valeur MIC en combinaison est de 0,064 microgramme par millilitre.

Maintenant, recueillir la deuxième plaque, qui contient la bande E gentamicine, et de déterminer la valeur MIC en combinaison comme précédemment démontré. Pour évaluer l'effet de la combinaison, calculez d'abord la concentration inhibitrice fractionnaire ou FIC pour la pénicilline G en divisant le MIC en combinaison par le MIC de l'antibiotique seul. Répétez ce processus pour la gentamicine. Ensuite, calculez l'indice FIC à l'aide de l'équation indiquée ici. Une réduction de deux fois de la valeur du MIC en combinaison donne une valeur de l'indice FIC inférieure ou égale à 0,5 et démontre une synergie entre la pénicilline G et la gentamicine. Dans ce cas, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Ainsi, les résultats ne démontrent pas de synergie entre la pénicilline G et la gentamicine avec la souche Streptococcus groupe G.

Pour déterminer les résultats de l'essai croisé, déterminez d'abord le point où les zones d'inhibition de la croissance se croisent avec leurs bandes E respectives. Lisez la valeur numérique sur chaque bande de test Électronique qui correspond à ce point d'intersection. Ces valeurs représentent la valeur MIC en combinaison pour la pénicilline G et la gentamicine. Ensuite, pour évaluer l'effet de la combinaison, calculez l'indice FIC à l'aide de l'équation indiquée ici. Dans cet exemple, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Cela signifie que la pénicilline G et la gentamicine n'agissent pas en synergie contre la souche Streptococcus du groupe G.

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Results

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Valeurs MIC en E-test
Les valeurs du MIC individuel ont été identifiées à la figure 1 comme étant de 0,094 g/mL pour la pénicilline G et de 8 g/mL pour la gentamicine. Pour les tests de synergie, les deux ont démontré une valeur MIC pour la pénicilline G de 0,064 g/mL (Figures 2, 3), tandis que la gentamicine avait un MIC 4 g/mL pour les essais croisés et non croisés. Notez qu'un léger écart entre les tests croisés et non croisés peut se produire en raison des différents temps d'incubation des bandes dans les deux paramètres.

Calcul de la synergie
L'équation pour FIC est la suivante:

1,18 euros (pas de synergie)

Détermination du MIC dans le bouillon
La nébulosité des puits a indiqué la croissance bactérienne, et donc aucune inhibition ne s'est produite. Le premier puits clair avec pénicilline G (figure 4) contenait 0,12 g/mL de pénicilline G, et c'était donc la valeur du MIC. Pour la gentamicine, le premier puits clair était présent à 8 g/mL de gentamicine. La valeur de la pénicilline G était légèrement plus élevée que lors de l'utilisation d'un test Électronique, en raison de la résolution plus élevée de la bande (par exemple sur la base d'une dilution en série de facteur 1,5x, et non d'un facteur 2x).

Taille d'inoculum
Pour déterminer la taille de l'inoculum, une approche telle qu'elle est décrite aux chiffres 5 et 6 a été utilisée. Les colonies ont été comptées dans la rangée D (1000x dilution), ajoutant jusqu'à 7, 8 et 8 dans la série triplicate avec une valeur moyenne de 7,67 cfu. Le nombre de colonies neeed à multiplier avec le facteur de dilution (par exemple 1000x), ainsi qu'avec 100 pour obtenir cfu/mL, donnant une taille d'inoculum d'environ 8 x 105, bien dans la taille d'inoculum ciblée de 105-6 cfu/mL.

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Applications and Summary

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La résistance aux antibiotiques est un problème de santé mondial. Afin de déterminer les mécanismes de résistance des microbes, des méthodes de test de synergie et d'antagonisme avec différents antibiotiques sont cruciales. La méthode E-test est rapide, facile à reproduire, et peut être utilisée pour étudier n'importe quel potentiel synergique des thérapies combinées. La méthode de dilution du bouillon peut également être évaluée pour prédire l'activité bactéricide. Afin d'étudier les mécanismes de résistance de différents microbes, la connaissance des interactions antibiotiques synergiques et antagonistes est cruciale. La combinaison d'antibiotiques peut être une stratégie pour augmenter l'efficacité du traitement et faire face à une résistance aux antibiotiques. Dans les tests effectués ici, nous avons été en mesure de déterminer les valeurs MIC de la pénicilline G et la gentamicine pour le groupe G Streptococcus. Nous avons également démontré que les deux antibiotiques n'affichent pas d'effets synergiques, ne serait donc pas une option de traitement préférée pour de telles infections.

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References

  1. Tan SY, Tatsumura Y. Alexander Fleming (1881-1955): Discoverer of penicillin. Singapore Medical Journal. 56 (7):366-7. (2015)
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  3. Pankey GA, Ashcraft DS, Dornelles A. Comparison of 3 E-test (®) methods and time-kill assay for determination of antimicrobial synergy against carbapenemase-producing Klebsiella species. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 77 (3):220-6. (2013)
  4. EUCAST: European Committee On Antimicrobial Susceptibility Testing (www.eucast.org).
  5. Wiegand I, Hilpert K, Hancock RE. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2):163-75. (2008)
  6. Doern CD, When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12):4124-28. (2014)
  7. Worthington RJ, Melander C. Combination approaches to combat multi-drug resistant bacteria. Trends in Biotechnology. 31 (3):177-84. (2013)
Tests de susceptibilité aux antibiotiques : Tests d'epsilomètre pour déterminer les valeurs MIC de deux antibiotiques et évaluer la synergie antibiotique
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