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Microscopía y tinción

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Pure Cultures and Streak Plating: Isolation of Single Bacterial Colonies from a Mixed Sample

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Pure Cultures and Streak Plating: Isolation of Single Bacterial Colonies from a Mixed Sample

Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample

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Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample

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Microscopía y tinción: Tinción de Gram, cápsula y endosporas

Overview

Fuente: Rhiannon M. LeVeque¹, Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, y Victor J. DiRita¹
¹ Departamento de Microbiología y Genética Molecular, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, Michigan, Estados Unidos de América

Las bacterias son microorganismos diversos que se encuentran en casi todas partes de la Tierra. Muchas propiedades ayudan a distinguirlos entre sí, incluyendo pero no limitado a tipo de tinción de Gram, forma y disposición, producción de cápsulas, y la formación de esporas. Para observar estas propiedades, se puede utilizar microscopía de luz; sin embargo, algunas características bacterianas (por ejemplo, el tamaño, la falta de coloración y las propiedades refractivas) hacen que sea difícil distinguir las bacterias únicamente con un microscopio ligero (1, 2). Las bacterias de la tinción son necesarias al distinguir los tipos bacterianos con microscopía de luz. Los dos tipos principales de microscopios de luz son simples y compuestos. La principal diferencia entre ellos es el número de lentes utilizadas para magnificar el objeto. Los microscopios simples (por ejemplo, una lupa) tienen una sola lente para magnificar un objeto, mientras que los microscopios compuestos tienen varias lentes para mejorar el aumento (Figura 1). Los microscopios compuestos tienen una lente objetiva cerca del objeto que recoge la luz para crear una imagen del objeto. Esto es emagnificado por el ocular (lente ocular) que agranda la imagen. La combinación de la lente objetivo y el ocular permite un aumento más alto que el uso de una sola lente. Por lo general, los microscopios compuestos tienen múltiples lentes objetivas de diferentes potencias para permitir un aumento diferente (1, 2). Aquí, vamos a discutir la visualización de bacterias con manchas de Gram, manchas de cápsula, y manchas de endospora.

Figura 1: Un microscopio compuesto típico. Las partes más importantes del microscopio están etiquetadas.

La tinción Gram, desarrollada en 1884 por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram (1), diferencia las bacterias en función de la composición de la pared celular (1, 2, 3, 4). Brevemente, se coloca un frotis bacteriano en un portaobjetos del microscopio y luego se fija térmicamente para adherir las células a la diapositiva y hacerlas aceptar más fácilmente de las manchas (1). La muestra termofija se tiñe con Cristal Violeta, convirtiendo las células en púrpura. La diapositiva se lava con una solución de yodo, que fija el Cristal Violet a la pared celular, seguido de un decolorante (un alcohol) para lavar cualquier Crystal Violet no fijo. En el paso final, se añade una contramancha, Safranin, a las celdas de color rojo (Figura 2). Bacterias Gram-positivas mancha púrpura debido a la gruesa capa de peptidoglycan que no es fácilmente penetrado por el decolorante; Bacterias gramnegativas, con su capa de peptidoglycan más delgada y mayor contenido de lípidos, descolorante con el decolorante y se contratienen en rojo cuando se añade Safranin (Figura 3). La tinción de Gram se utiliza para diferenciar las células en dos tipos (Gram-positivo y Gram-negativo) y también es útil para distinguir la forma de la célula (esferas o cocci, varillas, varillas curvas y espirales) y la disposición (células individuales, pares, cadenas, grupos y racimos) (1, 3) .

Figura 2: Esquema del protocolo Gram Staining Protocol. La columna izquierda muestra cómo reaccionan las bacterias Gram-negativas en cada paso del protocolo. La columna derecha muestra cómo reaccionan las bacterias Gram-positivas. Además, se muestran dos formas celulares bacterianas típicas: los bacilos (o varillas) y los cocci (o esferas).

Figura 3: Resultados de la tinción de Gram. Una tinción de Gram de una mezcla de Staphylococcus aureus (cocci púrpura Gram-positivo) y Escherichia coli (barras rojas gramnegativas).

Algunas bacterias producen una capa externa viscosa extracelular llamada cápsula (3, 5). Las cápsulas son estructuras protectoras con varias funciones, incluyendo pero no limitado a la adherencia a las superficies y otras bacterias, protección contra la desecación, y protección contra la fagocitosis. Cápsulas se componen típicamente de polisacáridos que contienen más del 95% de agua, pero algunos pueden contener polialcohols y poliaminas (5). Debido a su composición principalmente no iónica y su tendencia a repeler las manchas, los métodos de tinción simples no funcionan con la cápsula; en su lugar, la tinción de cápsulas utiliza una técnica de tinción negativa que mancha las células y el fondo, dejando la cápsula como un halo claro alrededor de las células (1, 3) (Figura 4). La tinción de la cápsula consiste en frotar una muestra bacteriana en una mancha ácida en un portaobjetos del microscopio. A diferencia de la tinción de Gram, el frotis bacteriano no se fija térmicamente durante una mancha de cápsula. La fijación de calor puede interrumpir o deshidratar la cápsula, lo que provoca falsos negativos (5). Además, la fijación de calor puede encoger las células, lo que resulta en un claro alrededor de la célula que se puede confundir como una cápsula, lo que conduce a falsos positivos (3). La mancha ácida colorea el fondo de la diapositiva; mientras que el seguimiento con una mancha básica, Crystal Violet, colorea las propias células bacterianas, dejando la cápsula sin mancha y apareciendo como un halo claro entre las células y el fondo de la diapositiva (Figura 5). Tradicionalmente, la tinta de la India se ha utilizado como la mancha ácida porque estas partículas no pueden penetrar en la cápsula. Por lo tanto, ni la cápsula ni la célula están manchadas por tinta de la India; en su lugar, el fondo está manchado. Congo Red, Nigrosin, o Eosin se pueden utilizar en lugar de tinta de la India. La tinción de cápsulas puede ayudar a los médicos a diagnosticar infecciones bacterianas cuando examinan los cultivos a partir de muestras de pacientes y guían el tratamiento adecuado del paciente. Las enfermedades comunes causadas por bacterias encapsuladas incluyen neumonía, meningitis y salmonelosis.

Figura 4: Esquema del protocolo de tinción de cápsula. El panel superior muestra el frotis de diapositivas antes de cualquier aplicación de manchas. El panel central muestra cómo el deslizamiento y las bacterias se ven después de la mancha primaria, Congo Red. El panel final muestra cómo la diapositiva y las bacterias se ven después de la contramancha, Crystal Violet.

Figura 5: Resultados de la tinción de la cápsula. Tinción de cápsulas de Acinetobacter baumannii encapsulado (denotado con flechas negras) y Escherichia coli no encapsulado (denotado con flechas blancas). Observe que el fondo es oscuro y a. las células baumannii están teñidas de púrpura. La cápsula alrededor de las células de A. baumannii es evidente como un halo, mientras que E. coli no tiene halo.

En condiciones adversas (por ejemplo, limitación de nutrientes, temperaturas extremas o deshidratación), algunas bacterias producen endosporas, estructuras metabólicamente inactivas que son resistentes al daño físico y químico (1, 2, 8, 9). Las endosporas permiten que la bacteria sobreviva a las duras condiciones protegiendo el material genético de las células; una vez que las condiciones son favorables para el crecimiento, las esporas germinan, y el crecimiento bacteriano continúa. Las endosporas son difíciles de manchar con técnicas de tinción estándar porque son impermeables a los colorantes que se suelen utilizar para la tinción (1, 9). La técnica utilizada rutinariamente para manchar las endosporas es el Método Schaeffer-Fulton (Figura 6),que utiliza la mancha primaria Malachite Green, una mancha soluble en agua que se une relativamente débilmente al material celular, y el calor, para permitir que la mancha se rompa a través de la corteza de la espora (Figura 7). Estos pasos colorean las células en crecimiento (llamadas células vegetativas en el contexto de la biología de la endospora), así como las endosporas y cualquier espora libre (aquellas que ya no están dentro de la envoltura de células anteriores). Las células vegetativas se lavan con agua para eliminar Malaquías Verde; los endospores retienen la mancha debido a la calefacción del verde malaquita dentro de las esporas. Finalmente, las células vegetativas se contratratan con Safranin para visualizar (Figura 8). La tinción de endosporas ayuda a diferenciar las bacterias en ex años de esporas y los años no esporas, así como determina si las esporas están presentes en una muestra que, si está presente, podría conducir a contaminación bacteriana tras la germinación.

Figura 6: Esquema del Protocolo de Tinción de Endospora. La columna izquierda muestra cómo reaccionan las bacterias formadoras de esporas en cada paso del protocolo. La columna derecha muestra cómo reaccionan las bacterias que no forman esporas.

Figura 7: Diagrama de la estructura de la endospora. Célula bacteriana que contiene una endospora con las diversas estructuras de esporas etiquetadas.

Figura 8: Resultados de la tinción de endospora. Una tinción típica de endosporas de Bacillus subtilis. Las células vegetativas (denotadas con las flechas blancas) están teñidas de rojo, mientras que las endosporas (denotadas con las flechas negras) están teñidas de verde.

Procedure

1. Tinción de Gram

Configuración
1. Use guantes y una capa de laboratorio no inflamable, ya que los colorantes mancharán las manos y la ropa.
2. Un quemador Bunsen se utiliza para fijar el calor de las bacterias. Tenga cuidado al trabajar con llamas; atar el pelo largo.
3. Se utilizarán reactivos de tinción de Gram disponibles comercialmente.
4. Limpie las guías del microscopio con toallitas de laboratorio.
Protocolo
1. Pipet 10 L fosfato salina tamponada o caldo de cultivo en tobogán.
2. Unta una colonia bacteriana en el líquido para producir una capa uniforme delgada.
  Nota: No utilice cultivos de más de 24 horas, ya que las bacterias demasiado viejas podrían tener cambios en la pared de su célula que afectarán los resultados de la mancha de Gram (1, 4).
3. Tobogán completamente seco al aire.
4. Una vez secas, las bacterias de reparación de calor al pasar diapositiva a través de la llama (bacterias lado hacia arriba) 4-5 veces.
  Nota: No sostenga el portaobjetos en la llama demasiado tiempo o puede distorsionar las células bacterianas (1).
5. Trabajando sobre el fregadero, sostenga el nivel de la diapositiva y aplique el Cristal Violet de Gram para cubrir completamente las bacterias fijas al calor, permita que se mantengan de pie 45 segundos.
6. Enjuague el exceso de Cristal Violet sosteniendo el portaobjetos en un ángulo y chorros de agua sobre el tobogán y dejándolo correr sobre las bacterias manchadas. No chorro de agua directamente sobre las bacterias.
7. Sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplique la solución de yodo de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas, permita que se mantenga de pie 45 segundos.
8. Enjuague el exceso de yodo como en el paso 1.2.6 anterior.
9. Mientras sostiene la diapositiva en un ángulo, agregue unas gotas de decolorante a la diapositiva, dejándola gotear hacia abajo sobre las bacterias manchadas hasta que la escorrenza esté clara; por lo general, unos 5 segundos. Enjuague inmediatamente con agua como en el paso 1.2.6 anterior.
  Nota: Este es un paso crítico en el protocolo. Permitir que Decolorizador gotear demasiado tiempo o no lo suficiente resultará en falsa tinción de Gram (4).
10. Sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplicar Safranin de Gram para cubrir completamente las bacterias, dejar reposar 45 segundos.
11. Enjuague el exceso de Safranin como en el paso 1.2.6 anterior.
12. Blot, no frote, exceso de agua de la diapositiva usando toallas de papel.
13. Examine la diapositiva en el microscopio utilizando la inmersión en aceite con un objetivo 100X.
Resultados y análisis de datos
1. Las bacterias gram-positivas mancharán el púrpura.
2. Las bacterias gramnegativas mancharán el rojo.
3. La forma (cocci, bacilos, varillas curvas, espirales) de las bacterias será visible.
4. La disposición de las células bacterianas (células únicas, células emparejadas, cadenas de células, racimos, agrupaciones) será visible.

2. Tinción de cápsulas

Configuración
1. Use guantes y un abrigo de laboratorio mientras los colorantes manchan las manos y la ropa.
2. Para preparar una solución de Cristal Violet al 1%, mezcle 0,25 gramos de cristal violeta con 25 ml de agua destilada hasta que se disuelva.
3. Para preparar una solución de 1% Congo Rojo, mezcle 0,25 gramos de Congo Rojo con 25 ml de agua destilada hasta que se disuelva.
4. Limpie las guías con toallitas de laboratorio.
Protocolo
1. Coloque 10 l Congo Rojo en el tobogán.
2. Usando una punta de pipeta, frota una colonia bacteriana en el tinte para producir una capa uniforme delgada.
3. Tobogán completamente seco al aire con mezcla de tinte/célula, 5-7 minutos.
  Nota: No fijar el calor ya que la calefacción puede deshidratar o distorsionar la cápsula.
4. Inunda el frotis con un 1% de cristal violeta durante 1 minuto.
5. Enjuague el exceso de manchas sosteniendo el portaobjetos en un ángulo y chorros de agua sobre el tobogán y dejándolo correr sobre las bacterias manchadas. No chorro de agua directamente sobre las bacterias.
6. Sostenga el portaobjetos en un ángulo de 45 grados hasta que esté completamente secado al aire.
7. Examine el frotis en el microscopio bajo inmersión en aceite con un objetivo 100X.
Resultados y análisis de datos
1. Las células bacterianas mancharán el púrpura.
2. El fondo de la diapositiva se manchará oscuro.
3. Las cápsulas serán un halo claro alrededor de las células sobre un fondo oscuro.

3. Mancha de endospora (método Schaeffer-Fulton)

Configuración
1. Use guantes y bata de laboratorio no inflamable para proteger las manos y la ropa de los colorantes y las llamas.
2. Un quemador Bunsen se utiliza para fijar el calor de las bacterias. Tenga cuidado al trabajar con llamas; atar el pelo largo.
3. Para preparar 0.5% Malachite Green solución, mezclar 0.125 gramos Malachite Green con 25 ml de agua destilada hasta que se disuelva.
4. Utilice la solución de reactivo Safranin de Gram, disponible en el uso comercial.
5. Limpie las guías con toallitas de laboratorio.
Protocolo
1. Pipet 10 l fosfato salina tamponada (PBS) o caldo de cultivo en tobogán.
2. Usando una técnica aséptica, frote una colonia bacteriana en el líquido para producir una capa uniforme delgada.
  Nota: Las endosporas generalmente no se forman en células jóvenes, por lo tanto, se recomienda que el cultivo tenga entre 18 y 36 horas (9).
3. Tobogán completamente seco al aire.
4. Fije el calor pasando la diapositiva (bacterias hacia arriba) a través de la llama 4-5 veces.
5. Para ayudar a contener el tinte, coloque un pedazo de papel de lente (cortado para ajustarse al frotis bacteriano) sobre el frotis de calor fijo.
6. Saturar el papel de lente con la solución Malachite Green.
7. Coloque el deslice encima del vaso de precipitados de agua hirviendo en una placa caliente y toque de vapor durante 5 minutos, manteniendo el papel de la lente húmedo agregando más tinte una gota a la vez según sea necesario.
  Nota: Evite sobrecalentar y secar la solución de tinte.
8. Retire la diapositiva del vaso de precipitados, retire y deseche el papel de la lente, deje que la diapositiva se enfríe 2 minutos.
9. Sosteniendo el portaobjetos en un ángulo, enjuague bien chorros de una corriente de agua suave e indirecta sobre el portaobjetos, lo que le permite drenar hacia abajo sobre el frotis.
10. Sosteniendo el nivel de deslizamiento, frotis de inundación con Safranin, dejar reposar 1 minuto.
11. Enjuague el exceso de Safranin como en el paso 3.2.9 anterior.
12. Dejar secar al aire.
13. Examine la diapositiva en el microscopio bajo inmersión en aceite con un objetivo 100X.
Resultados y análisis de datos
1. Las esporas mancharán de verde.
2. Las células vegetativas mancharán el rojo.
3. Algunas células vegetativas contendrán esporas; las células se mancharán de color rojo, mientras que las endosporas se mancharán de color verde.

Las bacterias son organismos vivos microscópicos que tienen muchas características distintivas como la forma, la disposición de las células, si producen o no cápsulas, y si forman esporas. Todas estas características se pueden visualizar mediante la tinción y la ayuda en la identificación y clasificación de diferentes especies bacterianas.

Para examinar las dos primeras características de la forma y disposición de la célula, podemos utilizar una técnica simple llamada tinción de Gram. Aquí, el violeta cristalino se aplica a las bacterias, que se han fijado térmicamente en un tobogán. Luego se aplica un decolorante y cualquier bacteria con una capa gruesa de peptidoglycan manchará púrpura, ya que esta capa no es fácilmente penetrada por el decolorante. Estas bacterias se conocen como Gram positivo.

Las bacterias Gram negativas tienen una capa de peptidoglycan más delgada y desmancharán el decolorante, perdiendo el color púrpura. Sin embargo, mancharán el color rojizo-rosa cuando se añade una mancha de contador de safranina, que se une a una capa de lipopolisacárido en su exterior. Una vez manchadas, las células se pueden observar para la morfología, el tamaño y la disposición, como en cadenas o racimos, lo que ayuda aún más en la clasificación e identificación.

Otra técnica útil en el kit de herramientas del microbiólogo es la mancha de la cápsula, utilizada para visualizar cápsulas externas que rodean algunos tipos de células bacterianas. Debido a la composición no iónica de las cápsulas y la tendencia a repeler las manchas, los métodos de tinción simples no funcionarán. En su lugar, se utiliza una técnica de tinción negativa, que primero mancha el fondo con un colorante ácido, como el rojo Congo, antes de que las células bacterianas se tiñen con violeta cristalino. Esto deja cualquier cápsula presente como un halo transparente alrededor de las células.

La última técnica de tinción principal que se cubre aquí puede ayudar a determinar si las bacterias que se estudian forman esporas. En condiciones adversas, algunas bacterias producen endosporas, estructuras latentes, duras, no reproductivas, cuya función principal es asegurar la supervivencia de las bacterias a través de períodos de estrés ambiental, como temperaturas extremas o deshidratación. Sin embargo, no todas las especies bacterianas producen endosporas, y son difíciles de manchar con técnicas estándar porque son impermeables a muchos colorantes. El método Schaeffer-Fulton utiliza la mancha verde malaquita, que se aplica a las bacterias fijadas a un deslizamiento. A continuación, el portaobjetos se lava con agua antes de ser manchado con safranina. Las células vegetativas aparecerán de color rosáceo-rojo, mientras que cualquier endospora presente aparecerá verde. En este video, aprenderás cómo realizar estas técnicas comunes de tinción bacteriana y luego examinarás las muestras de tinción usando microscopía de luz.

Para comenzar el procedimiento, ate el cabello largo y ponte el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una capa de laboratorio y guantes.

A continuación, limpie un portaobjetos de microscopio fresco con una toallita de laboratorio. A continuación, pipetear 10 microlitros de 1X solución salina tamponada de fosfato en la primera diapositiva. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para seleccionar una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Unta la colonia bacteriana en el líquido para producir una capa delgada y uniforme. Ajuste la corredera en la parte superior del banco y deje que se seque completamente al aire.

Una vez secado, encienda un quemador Bunsen para calentar las bacterias. Usando pinzas, pase el deslizamiento a través de la llama del quemador varias veces, con la bacteria hacia arriba, teniendo cuidado de no sostener el portaobjetos en la llama demasiado tiempo, lo que puede distorsionar las células.

Ahora, trabajando sobre el fregadero, sostenga el nivel de la diapositiva y aplique varias gotas de violeta de cristal de Gram para cubrir completamente el frotis bacteriano y luego, coloque el portaobjetos en el banco para que se pare durante 45 segundos. A continuación, sostenga el portaobjetos en un ángulo y saque suavemente una corriente de agua sobre la parte superior de la diapositiva, teniendo cuidado de no chorro squirt el frotis bacteriano directamente. Ahora, sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplique la solución de yodo de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas y luego, deje que se mantenga reposar durante otros 45 segundos. A continuación, enjuague cuidadosamente el yodo de la diapositiva, como se muestra anteriormente. Mientras sostiene la diapositiva en un ángulo, agregue unas gotas del decolorante de Gram a la diapositiva, lo que le permite correr hacia abajo sobre las bacterias manchadas, sólo hasta que la escorrenza esté clara, durante aproximadamente 5 segundos. Inmediatamente, enjuague con agua como se muestra anteriormente. Esto limitará la decoloración excesiva del frotis. A continuación, sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplicar la contramancha de safranina de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas. Después de 45 segundos, enjuague suavemente la safranina del tobogán con agua, como se muestra anteriormente, y luego, seque con toallas de papel.

Por último, agregue una gota de aceite de inmersión directamente a la diapositiva y, a continuación, examine la diapositiva con un microscopio de luz con una lente objetivo de aceite 100X.

Para comenzar este protocolo de tinción, primero coloque el equipo de protección personal correcto y, a continuación, asegúrese de que los portaobjetos de vidrio que se utilizarán estén limpios.

A continuación, prepare las soluciones. Para hacer una solución violeta de cristal al 1%, mezcle 0,25 gramos de polvo violeta de cristal con 25 mililitros de agua destilada y vórtice hasta que se disuelva. A continuación, prepare una solución roja del 1% en el Congo mezclando 0,25 gramos de polvo rojo del Congo con 25 mililitros de agua destilada y vórtice hasta que se disuelva. Ahora, pipeta 10 microlitros de la solución roja del Congo en el portaobjetos. Usando una punta de pipeta limpia y estéril, seleccione una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Luego, frota la colonia bacteriana en el tinte para producir una capa delgada y uniforme. Seque completamente al aire el portaobjetos bacteriano durante 5-7 minutos. Una vez que el portaobjetos esté seco, inunda el frotis con suficiente 1% de cristal violeta para cubrir el frotis y déjalo separación durante 1 minuto. Ahora, sostenga el portaobjetos en un ángulo y squirt suavemente una corriente de agua en la parte superior de la diapositiva, teniendo cuidado de no chorros de la bacteria directamente. Continúe sosteniendo el portaobjetos en un ángulo de 45 grados hasta que se seque completamente al aire. Por último, agregue una gota de aceite de inmersión directamente a la diapositiva y, a continuación, examine la diapositiva con un microscopio de luz con un objetivo de aceite 100X.

Para realizar la tinción de endospora, primero, prepare una solución verde malaquita al 0,5% mezclando 0. 125 gramos de polvo verde malaquita con 25 mililitros de agua destilada, y luego vórtice la solución hasta que se disuelva. A continuación, pipeta 10 microlitros de 1X PBS en el centro de la diapositiva. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para seleccionar una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Unta las bacterias en el líquido para producir una capa delgada y uniforme. Ahora, pon la corredera en la parte superior del banco y deja que se seque completamente al aire. Una vez secado, encienda un quemador Bunsen para calentar las bacterias. Pase el deslizamiento a través de la llama del quemador azul varias veces, con el lado de la bacteria hacia arriba. Luego, una vez que la diapositiva se haya enfriado, coloque un pedazo de papel de lente precortado sobre el frotis de calor fijo. A continuación, encienda una placa eléctrica hasta el entorno más alto y ponga a hervir un vaso de agua.

Saturar el papel de la lente con la solución verde malaquita y, usando pinzas, coloque el tobogán encima del vaso de precipitados de agua hirviendo al vapor durante 5 minutos. Mantenga el papel de la lente húmedo añadiendo más tinte, una gota a la vez, según sea necesario. A continuación, de nuevo con pinzas, recoger la diapositiva del vaso de precipitados y quitar y desechar el papel de la lente. Deje que la diapositiva se enfríe durante 2 minutos. Trabajando sobre el fregadero, sostenga la corredera en un ángulo y squirt suavemente una corriente de agua sobre la parte superior de la diapositiva. Ahora, sostenga el nivel de la diapositiva y aplique safranina para cubrir completamente la diapositiva. A continuación, deje que se quede de pie durante 1 minuto. A continuación, sostenga la diapositiva en un ángulo y enjuague como se muestra anteriormente. Deje que el portaobjetos se seque al aire en la parte superior del banco. Por último, añadir una gota de aceite de inmersión directamente a la diapositiva, y luego, examinar la diapositiva con un microscopio de luz, con un objetivo de aceite 100X.

En el protocolo de tinción de Gram, pueden resultar dos manchas de diferentes colores. La tinción púrpura oscura indica que las bacterias son Gram-positivas, y que han conservado la mancha violeta cristalina. Por el contrario, la tinción de color rosa rojizo es una característica de las bacterias Gram-negativas, que en su lugar será coloreada por la mancha de contador de safranina. Además, diferentes formas y arreglos de bacterias se pueden visualizar después de la tinción de Gram. Por ejemplo, es posible diferenciar Cocci, o bacterias redondas, de Bacillus en forma de varilla, o identificar bacterias que forman hebras, en comparación con las que normalmente se agregan como grumos, o ocurren por separado.

En una imagen de microscopio teñido de cápsula, las células bacterianas normalmente se teñirán púrpura, y el fondo de la diapositiva debe estar teñido oscuramente. Contra este fondo oscuro, las cápsulas de la bacteria, si están presentes, aparecerán como un halo claro alrededor de las células.

Por último, en la tinción de endosporo, las células vegetativas serán teñidas de rojo por la mancha de contracuña de safranina. Si las endosporas están presentes en la muestra, estas conservarán la mancha verde malaquita y aparecerán de color verde azulado.

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Applications and Summary

Las bacterias tienen características distintivas que pueden ayudar en su identificación. Algunas de estas características se pueden observar mediante la tinción y la microscopía de luz. Tres técnicas de tinción útiles para observar estas características son la tinción de Gram, tinción de cápsulas y tinción de endospora. Cada técnica identifica diferentes características de las bacterias y se puede utilizar para ayudar a los médicos a recomendar tratamientos para pacientes, identificar posibles contaminantes en muestras o productos alimenticios y verificar la esterilidad de la muestra.

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References

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Las bacterias son organismos vivos microscópicos que tienen muchas características distintivas como la forma, la disposición de las células, si producen o no cápsulas, y si forman esporas. Todas estas características se pueden visualizar mediante la tinción y la ayuda en la identificación y clasificación de diferentes especies bacterianas.

Para examinar las dos primeras características de la forma y disposición de la célula, podemos utilizar una técnica simple llamada tinción de Gram. Aquí, el violeta cristalino se aplica a las bacterias, que se han fijado térmicamente en un tobogán. Luego se aplica un decolorante y cualquier bacteria con una capa gruesa de peptidoglycan manchará púrpura, ya que esta capa no es fácilmente penetrada por el decolorante. Estas bacterias se conocen como Gram positivo.

Las bacterias Gram negativas tienen una capa de peptidoglycan más delgada y desmancharán el decolorante, perdiendo el color púrpura. Sin embargo, mancharán el color rojizo-rosa cuando se añade una mancha de contador de safranina, que se une a una capa de lipopolisacárido en su exterior. Una vez manchadas, las células se pueden observar para la morfología, el tamaño y la disposición, como en cadenas o racimos, lo que ayuda aún más en la clasificación e identificación.

Otra técnica útil en el kit de herramientas del microbiólogo es la mancha de la cápsula, utilizada para visualizar cápsulas externas que rodean algunos tipos de células bacterianas. Debido a la composición no iónica de las cápsulas y la tendencia a repeler las manchas, los métodos de tinción simples no funcionarán. En su lugar, se utiliza una técnica de tinción negativa, que primero mancha el fondo con un colorante ácido, como el rojo Congo, antes de que las células bacterianas se tiñen con violeta cristalino. Esto deja cualquier cápsula presente como un halo transparente alrededor de las células.

La última técnica de tinción principal que se cubre aquí puede ayudar a determinar si las bacterias que se estudian forman esporas. En condiciones adversas, algunas bacterias producen endosporas, estructuras latentes, duras, no reproductivas, cuya función principal es asegurar la supervivencia de las bacterias a través de períodos de estrés ambiental, como temperaturas extremas o deshidratación. Sin embargo, no todas las especies bacterianas producen endosporas, y son difíciles de manchar con técnicas estándar porque son impermeables a muchos colorantes. El método Schaeffer-Fulton utiliza la mancha verde malaquita, que se aplica a las bacterias fijadas a un deslizamiento. A continuación, el portaobjetos se lava con agua antes de ser manchado con safranina. Las células vegetativas aparecerán de color rosáceo-rojo, mientras que cualquier endospora presente aparecerá verde. En este video, aprenderás cómo realizar estas técnicas comunes de tinción bacteriana y luego examinarás las muestras de tinción usando microscopía de luz.

Para comenzar el procedimiento, ate el cabello largo y ponte el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una capa de laboratorio y guantes.

A continuación, limpie un portaobjetos de microscopio fresco con una toallita de laboratorio. A continuación, pipetear 10 microlitros de 1X solución salina tamponada de fosfato en la primera diapositiva. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para seleccionar una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Unta la colonia bacteriana en el líquido para producir una capa delgada y uniforme. Ajuste la corredera en la parte superior del banco y deje que se seque completamente al aire.

Una vez secado, encienda un quemador Bunsen para calentar las bacterias. Usando pinzas, pase el deslizamiento a través de la llama del quemador varias veces, con la bacteria hacia arriba, teniendo cuidado de no sostener el portaobjetos en la llama demasiado tiempo, lo que puede distorsionar las células.

Ahora, trabajando sobre el fregadero, sostenga el nivel de la diapositiva y aplique varias gotas de violeta de cristal de Gram para cubrir completamente el frotis bacteriano y luego, coloque el portaobjetos en el banco para que se pare durante 45 segundos. A continuación, sostenga el portaobjetos en un ángulo y saque suavemente una corriente de agua sobre la parte superior de la diapositiva, teniendo cuidado de no chorro squirt el frotis bacteriano directamente. Ahora, sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplique la solución de yodo de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas y luego, deje que se mantenga reposar durante otros 45 segundos. A continuación, enjuague cuidadosamente el yodo de la diapositiva, como se muestra anteriormente. Mientras sostiene la diapositiva en un ángulo, agregue unas gotas del decolorante de Gram a la diapositiva, lo que le permite correr hacia abajo sobre las bacterias manchadas, sólo hasta que la escorrenza esté clara, durante aproximadamente 5 segundos. Inmediatamente, enjuague con agua como se muestra anteriormente. Esto limitará la decoloración excesiva del frotis. A continuación, sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplicar la contramancha de safranina de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas. Después de 45 segundos, enjuague suavemente la safranina del tobogán con agua, como se muestra anteriormente, y luego, seque con toallas de papel.

Por último, agregue una gota de aceite de inmersión directamente a la diapositiva y, a continuación, examine la diapositiva con un microscopio de luz con una lente objetivo de aceite 100X.

Para comenzar este protocolo de tinción, primero coloque el equipo de protección personal correcto y, a continuación, asegúrese de que los portaobjetos de vidrio que se utilizarán estén limpios.

A continuación, prepare las soluciones. Para hacer una solución violeta de cristal al 1%, mezcle 0,25 gramos de polvo violeta de cristal con 25 mililitros de agua destilada y vórtice hasta que se disuelva. A continuación, prepare una solución roja del 1% en el Congo mezclando 0,25 gramos de polvo rojo del Congo con 25 mililitros de agua destilada y vórtice hasta que se disuelva. Ahora, pipeta 10 microlitros de la solución roja del Congo en el portaobjetos. Usando una punta de pipeta limpia y estéril, seleccione una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Luego, frota la colonia bacteriana en el tinte para producir una capa delgada y uniforme. Seque completamente al aire el portaobjetos bacteriano durante 5-7 minutos. Una vez que el portaobjetos esté seco, inunda el frotis con suficiente 1% de cristal violeta para cubrir el frotis y déjalo separación durante 1 minuto. Ahora, sostenga el portaobjetos en un ángulo y squirt suavemente una corriente de agua en la parte superior de la diapositiva, teniendo cuidado de no chorros de la bacteria directamente. Continúe sosteniendo el portaobjetos en un ángulo de 45 grados hasta que se seque completamente al aire. Por último, agregue una gota de aceite de inmersión directamente a la diapositiva y, a continuación, examine la diapositiva con un microscopio de luz con un objetivo de aceite 100X.

Para realizar la tinción de endospora, primero, prepare una solución verde malaquita al 0,5% mezclando 0. 125 gramos de polvo verde malaquita con 25 mililitros de agua destilada, y luego vórtice la solución hasta que se disuelva. A continuación, pipeta 10 microlitros de 1X PBS en el centro de la diapositiva. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para seleccionar una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Unta las bacterias en el líquido para producir una capa delgada y uniforme. Ahora, pon la corredera en la parte superior del banco y deja que se seque completamente al aire. Una vez secado, encienda un quemador Bunsen para calentar las bacterias. Pase el deslizamiento a través de la llama del quemador azul varias veces, con el lado de la bacteria hacia arriba. Luego, una vez que la diapositiva se haya enfriado, coloque un pedazo de papel de lente precortado sobre el frotis de calor fijo. A continuación, encienda una placa eléctrica hasta el entorno más alto y ponga a hervir un vaso de agua.

Saturar el papel de la lente con la solución verde malaquita y, usando pinzas, coloque el tobogán encima del vaso de precipitados de agua hirviendo al vapor durante 5 minutos. Mantenga el papel de la lente húmedo añadiendo más tinte, una gota a la vez, según sea necesario. A continuación, de nuevo con pinzas, recoger la diapositiva del vaso de precipitados y quitar y desechar el papel de la lente. Deje que la diapositiva se enfríe durante 2 minutos. Trabajando sobre el fregadero, sostenga la corredera en un ángulo y squirt suavemente una corriente de agua sobre la parte superior de la diapositiva. Ahora, sostenga el nivel de la diapositiva y aplique safranina para cubrir completamente la diapositiva. A continuación, deje que se quede de pie durante 1 minuto. A continuación, sostenga la diapositiva en un ángulo y enjuague como se muestra anteriormente. Deje que el portaobjetos se seque al aire en la parte superior del banco. Por último, añadir una gota de aceite de inmersión directamente a la diapositiva, y luego, examinar la diapositiva con un microscopio de luz, con un objetivo de aceite 100X.

En el protocolo de tinción de Gram, pueden resultar dos manchas de diferentes colores. La tinción púrpura oscura indica que las bacterias son Gram-positivas, y que han conservado la mancha violeta cristalina. Por el contrario, la tinción de color rosa rojizo es una característica de las bacterias Gram-negativas, que en su lugar será coloreada por la mancha de contador de safranina. Además, diferentes formas y arreglos de bacterias se pueden visualizar después de la tinción de Gram. Por ejemplo, es posible diferenciar Cocci, o bacterias redondas, de Bacillus en forma de varilla, o identificar bacterias que forman hebras, en comparación con las que normalmente se agregan como grumos, o ocurren por separado.

En una imagen de microscopio teñido de cápsula, las células bacterianas normalmente se teñirán púrpura, y el fondo de la diapositiva debe estar teñido oscuramente. Contra este fondo oscuro, las cápsulas de la bacteria, si están presentes, aparecerán como un halo claro alrededor de las células.

Por último, en la tinción de endosporo, las células vegetativas serán teñidas de rojo por la mancha de contracuña de safranina. Si las endosporas están presentes en la muestra, estas conservarán la mancha verde malaquita y aparecerán de color verde azulado.

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