Summary
Här beskriver vi hur man tjudra en fluga i en lukt magnetisk-tjuder (OMT) apparater. Vi beskriver hur du vill justera sällsynta jordartsmetaller magneter och hamnar lukt, och hur man ställer priser massflöde för både stimulans leverans och vakuumsug för att uppnå optimal lukt spårning.
Abstract
Det har stått klart i många år att insekter använder visuella ledtrådar för att stabilisera sin rubrik i en vind ström. Många djur spåra lukter transporteras i vinden. Som sådan, visuell stabilisering av vindsidan spåra direkt stöd i lukt spårning. Men lukt-signaler direkt inflytande visuell spårning beteende oberoende av vind-signaler? Dessutom har den senaste tidens störtflod av forskning om neurofysiologi och neurobehavioral genetik luktsinne i Drosophila motiverade allt mer tekniskt sofistikerade och kvantitativa beteendemässiga analyser. Här ändrade vi en magnetisk tjuder system som ursprungligen utformades för vision experiment genom att utrusta arenan med smala lukt laminärt flöde plymer. En fluga är limmad till en liten stål-pin och svävar i ett magnetfält som gör det möjligt att gira fritt. Liten diameter mat lukt plymer är riktade nedåt över flugan huvud, framkalla stabila spårning av en hungrig fluga. Här fokuserar vi på de kritiska mekanik tjudra, rikta in magneter, utformar lukt plym, och bekräftar stabil lukt spårning.
Protocol
Inledning
Den OMT är en anpassning av en magnetisk tjuder system [1] syftar till att införa en "virtuell plym simulator". Följande protokoll kommer att förklara hur man korrekt tjudra flugor (del 1) och ge strategier för inrättandet av magneter (del 2) och massa-flöde regleras lukt leveranssystem (del 3). Den information som beskrivs här är optimerad för just detta system och kan variera för komponenter med andra tekniska specifikationer.
Del 1: Internetdelning flyger
Stegen för att tjudra beskrivs här liknar många tidigare studier [2], men anpassade för användning i en OMT [3]. Korrekt tjudra är avgörande för att säkerställa stabila och repeterbara experimentella studier. Vikten av noggrann tjudra kan inte överskattas.
- Samla flyger 4-6 dagar efter eclosion och svälta dem i 4-6 timmar. Placera en kimwipe fuktad med vatten i foodless flaskan för att förhindra uttorkning.
- Överföring ett parti flyger från en flaska till en liten flaska och sätt in det i en mässing blockera Peltier kylning skede satt till cirka 4 grader Celsius. Rätt temperatur anesthetizes flugorna inom ca 30 sekunder.
- Sortera flugor på den kalla ytan på kylning scenen. En fuktig Kimwipe säkerställer konstant kyla och fukttransporterande från nagelbanden. Välj den största honorna för dragning.
- Med hjälp av en fin pensel, trycka på en enda fluga på plats i specialbyggda sarkofagen formad för att rymma en enda vild typ kvinnliga bananflugan.
Figur 1.
Klicka här för att se en större version av bilden. - Vi positionen en minutien stift (Böter Science Tools) med en magnetisk stång monterad på en mikromanipulator. Stiftet ska placeras så att den trubbiga änden vidrör ryggen bröstkorgen precis bakom huvudet mellan de två flyglarna. Stiftet ska vara helt lodräta när man ser rakt på mot ögonen. Även en liten mängd 'roll "mellan fluga och stift kan inte tolereras. Den sida-view vinkel mellan stiftet och den långa axeln av kroppen bör vara en näsa upp vinkel på 30 grader i förhållande till horisonten (bild 1). OBS: För optimal funktion i magneten tjuder, kan stiften måste trimmas till kortare längder. Detta beror helt på avståndet mellan fjädring magneter.
- När minutien stift är justerad, använd en tunn ståltråd att tillämpa en liten droppe av UV-aktiverad lim (Electrolite Corp) till den trubbiga änden av minutien stift.
- Manipulera stiftet så limmet droppe vidrör flugans bröstkorgen precis ovanför huvudet. Med rätt droppstorleken bör limmet glödga och flödet från tappen på bröstkorgen. Var noga med att inte använda för mycket lim.
- Cure limmet med två 20 sekunders skurar av UV-ljus.
- Placera den fasta flyger åt sidan och upprepa. Skiva små fyrkanter av Kimwipe och med pincett ge en till varje bundna flyga för att hindra flykten.
- Efter en timmes återhämtning, tjudrade flugor är redo för experiment.
- Felaktig limning kan hindra en fluga förmåga att prestera i magneten arenan. Varje fluga bör kontrolleras för jämn rotation i början av varje experiment för att se till att flugorna är ordentligt limmade. Detta kan göras genom att vrida ett randigt mönster med en tillräckligt stor rumslig perioden för att framkalla starka optomotor svar [4]. Om fluga är limmad vid fel tonhöjd vinkel eller lutande på stiftet med avseende på rulla axeln, flugan får (i) inte snurra alls, (ii) har ett begränsat utbud av rörelse, eller (iii) rotera i ojämn hastighet. I ovanstående fall flugan skall kasseras och ersättas med en ny. Om detta löser problemet att det var troligen ett fall av felaktig limning. (Om att ersätta flyger inte löser problemet, se del 2.4)
Del 2: Justera magneter
Justera magneter (sällsynta jordarter-magnets.com) korrekt är nödvändigt för att flyga till en smidig 360 graders rörelseomfång. Följ dessa steg för att rätta till magneter.
- Den nedre ringen magneter hålls horisontellt med en plasthylsa och placeras direkt ovanpå en tydlig vakuumkammare (figur 1, beskrivs närmare i del 3). Den övre stången magneten är fast vertikalt ca 3 / 4 "ovanför nedre magneter.
- Ungefär anpassa den övre och undre magneter visuellt genom att placera den övre stången magneten direkt ovanför mittpunkten på den nedre ringen magneter. Det är bra att fästa den övre magneten på en mikromanipulator (Siskiyou Inc.) för fina skala justering.
- Epoxy en V-juvel lagret (små delar) på undersidan av den övre magneten för att minimera roterande friktionen och standardisera flyga positionering.
- Placera en fluga på arenan och justera den horisontella och vertical positionen för det övre magneten tills flugan kan smidigt och stadigt rotera 360 grader i gir axeln. Varje fluga bör kontrolleras för jämn rotation i början av varje experiment för att se till att magneterna är rätt inställd och att enskilda minutien stift inte är skadade (se avsnitt 1.11). Om magneterna inte är korrekt inställd i farten kan (i) inte snurra alls (ii) har ett begränsat rörelseomfång (iii) rotera i ojämn hastighet. Om problemet är löst genom att ersätta flyga med en ny, det var troligtvis på grund av en limning problem (se del 1). Om dessa problem finns för varje flyga, är det sannolikt ett problem med anpassningen av magneterna och ytterligare justeringar kommer att krävas.
- Varning: samtidigt som du spelar med sällsynta jordartsmetaller magneter kan vara kul, de är mycket farliga. Missbruk leder till skadad utrustning och / eller mindre kroppsskada. Var extremt försiktig med dessa lockande ändå lätt underskattas magneter.
Del 3: Lukt Leverans
- Lukten leverans systemet bygger på en tidigare beskrivits [5] och är den svåraste att optimera (bild 1). Det kräver mycket tålamod och trial-and-error. Följ dessa steg för att uppnå en stabil lukt spårning.
- Den ursprungliga utformningen av lukten systemet kräver kör smalspåriga Teflon slang (små delar) från gasen multiplexer (Sable Systems International) till egenbyggda vatten / lukt injektionsflaskor. Utloppet av dessa flaskor ansluts direkt till rören Engångssprutor hamnen med samma teflon slangar.
- En klar akryl vakuumkammare placeras under arenan för att stödja magneter. Vi använder oss av en 4mm glasrör monteras under flugan ansluten till vakuumkammaren att föra vakuum öppningen närmare flyga och minska öppningens diameter.
- Placera en tjudrad flyga in i arenan med hjälp av pincetten.
- Sätt på en attraktiv doft (äppelcidervinäger fungerar bra), och visuellt kontrollera att flyga spår av lukt. Om flugan verkar ha någon preferens för lukt, följa de kommande tre steg. Detta kan kräva flera flugor, och flera studier.
- Justera placeringen av lukt porten tills flugan verkar spåra lukt. Vi monterade lukten portarna på micromanipulators (Siskiyou Inc.) och placerade 4mm rygg-och 3mm främre på flugans huvud.
- Justera massflödet tills flugan verkar spåra lukt. Våra inställningar 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).
- Justera flöde vakuum tills flugan verkar spåra lukt. Vi sätter räntan vakuumflödet på 13l/min med ett flöde regulator (Cole Parmer). OBS: Bygga vakuum matarledningar kan variera över tiden som orsakar fluktuationer i plym struktur. Det kan vara bra att ansluta en extern vakuumpump till flödet regulator för konstant råder vakuum flöde.
- När läget för hamnen och flöden är inställda, periodvis växla mellan att leverera vattenånga och lukt ånga med hjälp av en omkopplingsbar med gas multiplexer och visuellt kontrollera att flyga bara spårar lukt när lukten är på. Ibland kan rester av lukt inne i lukten hamnen framkalla lukt spåra när lukten är avstängd. Detta kan elimineras utan att ta bort rätt placerad lukt porten genom att fylla Engångssprutor rören med etanol och samla den på leverans sluta med en Kimwipe. Med tryckluft, blås kvarvarande etanol och återuppta experiment.
Representativa resultat:
När dessa steg följs korrekt två saker bör observeras. Först under ständig rotation visuella stimuli en tjudrad fluga placeras i OMT ska rotera jämnt 360 grader i gir axeln. "Jerky" varv (kallas saccades) är karakteristiska för spontana vrida beteende i avsaknad av ständiga visuella stimuli. Om flugor kan uppenbarligen inte rotera jämnt, kan felaktig limning (se del 1) och dåligt magneter vara att skylla (se del 2). För det andra, när lukten är påslagen, ska flyga huvudet i riktning mot lukt. När lukten är avstängd ska flyga saccade spontant utan företräde för någon enskild plats i arenan. Om flugor inte aktivt spåra lukten plym, placeringen av lukt hamnen, luftflöde och / eller vakuum flöde kan behöva justeras (se del 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Internetdelning flugor och få fram stabila lukt spårning i denna arena är relativt enkelt. Det kräver övning, tålamod och trial and error. Många delar av denna arena skulle kunna optimeras ytterligare eller ersättas för att ge variationer i experimentell potential. Till exempel nyare versioner av vakuumkammare är mycket mindre och ge mer utrymme under arenan. Dessutom kan styrkan och typen av sällsynta jordartsmetaller magneter ändras en aning och ytterligare lukt portar kan läggas att öka antalet lukt typer och / eller koncentrationer som används i experiment. Vi noterar att eventuella variationer i utrustning kommer att kräva skräddarsydda optimering. Som beskrivs här tillåter OMTA användare att testa effekten av visuella referenser på lukt lokalisering. Ett brett utbud av visuella stimuli kan presenteras med LED-panelen systemet och när den kombineras med den mångsidighet och utbyggbarhet av lukt leveranssystem systemet ger möjlighet att utforska visuo-lukt integrationen på många nivåer. Detta system bidrar också till det ökande antalet kvantitativa beteendemässiga analyser för Drosophila, särskilt för att karakterisera beteendet hos flygande vuxna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansiering från National Science Foundation (MF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
