Summary
Aqui nós descrevemos como amarrar uma mosca em um aparelho olfativo tether-magnética (OMT). Descrevemos como alinhar os ímãs de terras raras e portos odor, e como definir as taxas de fluxo de massa, tanto para o estímulo de entrega e sucção a vácuo para alcançar rastreamento odor ideal.
Abstract
Ficou claro por muitos anos que os insetos usam pistas visuais para estabilizar a sua posição em um fluxo de vento. Muitos animais faixa odores transportados pelo vento. Como tal estabilização, visual de rastreamento diretamente contra o vento auxilia no acompanhamento odor. Mas sinais olfativos influenciam diretamente o comportamento acompanhamento visual de forma independente a partir de pistas de vento? Além disso, a recente avalanche de pesquisas sobre a neurofisiologia e genética neurocomportamental de olfato em Drosophila tem motivado cada vez mais tecnicamente sofisticados e quantitativa ensaios comportamentais. Aqui, nós modificamos um sistema de corda magnética originalmente concebido para experimentos visão, equipando a arena com estreitas laminar plumas odor de fluxo. Uma mosca está colado um pino de aço pequenas e suspensas em um campo magnético que lhe permite yaw livremente. Pequeno diâmetro plumas odor de alimentos são direcionados para baixo sobre a cabeça da mosca s, provocando rastreamento estável por uma mosca com fome. Aqui vamos nos concentrar na mecânica crítica de tethering, alinhando os ímãs, a elaboração da pluma de odor, e confirmando rastreamento odor estável.
Protocol
Introdução
A OMT é uma adaptação de um sistema de corda magnética [1] projetado para incorporar um "simulador de plume virtual". Os seguintes protocolos irá explicar como moscas corretamente amarrar (Parte 1) e fornecer estratégias para a criação dos ímãs (Parte 2) e de fluxo de massa do sistema de entrega regulada odor (Part3). As informações aqui descrito é otimizado para este sistema em particular e pode variar para componentes com outras especificações técnicas.
Parte 1: moscas Tethering
Os passos para amarrar aqui descritas são semelhantes a muitos estudos anteriores [2], mas adaptado para uso em um OMT [3]. Tethering adequada é fundamental para garantir robusta e reproduzível ensaios experimentais. A importância de tethering cuidado não pode ser exagerada.
- Coletar moscas 4-6 dias após a eclosão e privá-los por 4-6 horas. Coloque um kimwipe umedecido com água no frasco desnutridos para evitar desidratação.
- Transferência de um lote de moscas de uma garrafa para um pequeno frasco e inseri-lo em um bloco de bronze em um estágio de resfriamento Peltier fixado em cerca de 4 graus Celsius. A temperatura adequada anestesia as moscas dentro de aproximadamente 30 segundos.
- Classificar as moscas sobre a superfície fria da fase de resfriamento. A Kimwipe úmido garante refrigeração constante e que a absorção de umidade a partir da cutícula. Selecione o maior fêmeas para amarrar.
- Usando um pincel fino, empurre uma única mosca na posição no sarcófago custom-built forma a acomodar um único tipo selvagem mosca da fruta feminina.
Figura 1.
Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura do. - Nós posição um pino minutien (Ferramentas Multas Science) com uma haste magnética montada em um micromanipulador. O pino deve ser alinhado de modo que o fim brusco toca o tórax dorsal logo atrás da cabeça entre as duas alas. O pino deve ser perfeitamente vertical quando visto de frente em direção aos olhos. Mesmo uma pequena quantidade de 'roll' entre o pino de voar e não pode ser tolerada. O ângulo de visão lateral entre o pino eo eixo longitudinal do corpo deve estar em um ângulo do nariz para cima de 30 graus em relação ao horizonte (Fig. 1). Nota: Para um funcionamento óptimo no tether ímã, os pinos podem precisar de ser cortado para comprimentos mais curtos. Isso vai depender inteiramente da distância entre os ímãs suspensão.
- Uma vez que o pino minutien está alinhado, use um fio de aço fino para aplicar uma pequena gota de cola UV-ativado (Electrolite Corp) até o fim brusco do pino minutien.
- Manipular o pino para que a gota de cola toca tórax da mosca logo acima da cabeça. Com o tamanho da gota adequada, a cola deve anneal e fluxo do pino sobre o tórax. Tenha cuidado para não usar cola demais.
- Curar a cola com dois de 20 rajadas segundo de luz UV.
- Coloque o fly fixa de lado e repita. Slice pequenos quadrados de Kimwipe e com uma pinça dê um a cada voar amarrado para restringir o vôo.
- Após uma hora de recuperação, as moscas presos estão prontos para experimentos.
- Colagem inadequada pode prejudicar a capacidade de uma mosca para realizar na arena ímã. Cada mosca deve ser verificado para rotação suave no início de cada experimento para garantir as moscas estão devidamente colados. Isso pode ser feito por rotação de um padrão listrado com um período suficientemente grande espacial para obter respostas optomotor forte [4]. Se a mosca é colado no ângulo de passo errado ou inclinado sobre o pino em relação ao eixo de rotação, a mosca não pode (i) giram em tudo, (ii) têm uma gama restrita de movimento, ou (iii) giram em inconsistentes velocidade. Nos casos acima da mosca deve ser descartado e substituído por um novo. Se isso resolver o problema era mais provável um caso de colagem impróprio. (Se substituindo a mosca não resolve o problema, consulte a Parte 2.4)
Parte 2: Alinhamento dos ímãs
Alinhar os ímãs (Rare-earth-magnets.com) corretamente é necessário que a mosca para alcançar um leque grau suave 360 de movimento. Siga estes passos para alinhar corretamente os ímãs.
- Os ímãs anel inferior são mantidas horizontalmente por uma luva de plástico e colocado diretamente em cima de uma câmara de vácuo clara (Fig. 1; descrito adiante na parte 3). O imã da haste superior é fixada verticalmente aproximadamente 3 / 4 "acima da ímãs menores.
- Cerca de alinhar os ímãs superiores e inferiores visualmente, colocando o imã da haste superior diretamente acima do ponto central dos magnetos anel inferior. É útil para prender o ímã superior a um micromanipulador (Siskiyou Inc.) para ajuste de escala fina.
- Epóxi tendo uma V-jóia (peças pequenas) sobre a superfície inferior do imã superior para minimizar o atrito rotacional e padronizar o posicionamento voar.
- Coloque uma mosca na arena e ajustar a posição horizontal e vertical posição do imã superior até a mosca pode facilmente e de forma constante girar 360 graus no eixo de guinada. Cada mosca deve ser verificado para rotação suave no início de cada experimento para garantir os ímãs estão devidamente alinhados e que os pinos individuais minutien não estão danificados (ver Parte 1.11). Se os ímãs não estão devidamente alinhados a mosca não pode (i) giram em todas as (ii) têm uma gama restrita de movimento (iii) giram em velocidades inconsistentes. Se o problema for resolvido substituindo a voar com um novo, era mais provável devido a um problema de colagem (veja Parte 1). Se estes problemas existem para todos os voar, é provável que um problema com o alinhamento dos ímãs e ajuste adicional será necessária.
- Atenção: ao jogar com ímãs de terras raras podem ser divertidos, eles são muito perigosos. Uso indevido resulta em equipamentos danificados e / ou danos corporais de menor importância. Agir com extrema cautela com estes ímãs tentadora mas facilmente subestimada.
Parte 3: Entrega de Odor
- O sistema de entrega de odor é baseado em uma descritos anteriormente [5] e é a parte mais difícil para otimizar (Fig. 1). Ela exige muita paciência e de tentativa e erro. Siga estes passos para conseguir rastreamento odor estável.
- O set-up inicial do sistema odor requer a execução do calibre estreito tubo de Teflon (peças pequenas) a partir do gás multiplexador (Sable Systems International) o costume construído água / odor frascos. A saída destes frascos se conecta diretamente aos tubos hipodérmica porta usando o tubo de Teflon mesmo.
- A câmara de vácuo acrílico é posicionado sob a arena para apoiar os ímãs. Nós usamos um tubo de vidro 4 milímetros montado abaixo a mosca ligado à câmara de vácuo para trazer o vácuo de abertura mais perto do fly e reduzir o diâmetro da abertura.
- Coloque uma mosca amarrada na arena com a pinça.
- Ativar um odor atraente (vinagre de maçã funciona bem), e verificar visualmente que a mosca acompanha o odor. Se a mosca parece não ter preferência pelo odor, siga as próximas três etapas. Isso pode exigir várias moscas e vários ensaios.
- Ajustar a posição da porta até que o odor fly parece acompanhar o odor. Montamos as portas odor em micromanipuladores (Siskiyou Inc.) e posicionada dorsal anterior 4 milímetros e 3mm para a cabeça da mosca.
- Ajustar a taxa de fluxo de massa até a mosca parece acompanhar o odor. Nosso meio, são 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).
- Ajustar o fluxo do vácuo até que o fly parece acompanhar o odor. Nós definir a taxa de fluxo de vácuo em 13l/min usando um regulador de fluxo (Cole Parmer). Nota: As linhas de construção da entrada de vácuo pode flutuar ao longo do tempo provocando flutuações na estrutura pluma. Pode ser útil para ligar uma bomba de vácuo externo para o regulador de fluxo para as condições de fluxo constante de vácuo.
- Uma vez que a posição da porta e as taxas de fluxo são definidas, periodicamente alternar entre vapor de água e fornecimento de vapor usando um odor comutável usando um multiplexador de gás e verificar visualmente que a mosca só acompanha o odor quando o odor estiver ligado. Ocasionalmente, odor residual no interior do porta odor pode provocar odor de rastreamento quando o odor é desligado. Isso pode ser eliminado sem a remoção da porta odor posicionada corretamente preenchendo os tubos hipodérmica com etanol e coletando-o no final de entrega com um Kimwipe. Uso de ar comprimido, qualquer golpe de etanol restantes para fora e retomar experiências.
Resultados representativos:
Quando essas etapas forem seguidas corretamente duas coisas devem ser observadas. Primeiro, sob constante rotação estímulos visuais de uma mosca presa colocado na OMT deve girar suavemente 360 graus no eixo de guinada. "Jerky" voltas (chamado sacadas) são características do comportamento de viragem espontânea na ausência de constantes estímulos visuais. Se as moscas não podem rodar sem problemas, aparentemente, colagem impróprio (ver parte 1) e ímãs desalinhado pode ser o culpado (ver Parte 2). Segundo, quando o odor é ligado, a mosca deve cabeça na direção do odor. Quando o odor é desligado, a mosca deve saccade espontaneamente, sem preferência por qualquer posição única na arena. Se as moscas não acompanhar activamente a pluma de odor, a posição da porta de odor, a taxa de fluxo de ar e / ou a taxa de fluxo de vácuo podem precisar de ajustes (ver Parte 3).
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Discussion
Amarrar moscas e provocando odor rastreamento estável nesta área é relativamente simples. Requer paciência, prática e tentativa e erro. Muitas partes desta arena poderiam ser optimizadas ou substituído para produzir variações no potencial experimental. Por exemplo, versões mais recentes da câmara de vácuo são muito menores e permitir mais espaço abaixo da arena. Além disso, a força eo tipo de terras raras ímãs podem ser variados ligeiramente e portos odor adicionais poderiam ser acrescentados para aumentar o número de tipos de odor e / ou concentrações utilizadas nos experimentos. Tomamos nota de que qualquer variação em equipamentos exigirá otimização personalizadas. Como descrito aqui, o OMTA permite aos usuários para testar o efeito de pistas visuais na localização odor. Uma grande variedade de estímulos visuais podem ser apresentados com o sistema do painel de LED e quando combinada com a versatilidade e capacidade de expansão do sistema de entrega de odor o sistema oferece o potencial para explorar visuo-olfativa integração em vários níveis. Este sistema também contribui para o crescente número de ensaios comportamentais quantitativas para Drosophila, especialmente para caracterizar o comportamento dos adultos voando.
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Acknowledgments
Financiamento concedido pela National Science Foundation (MF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
