Summary
Burada, bir koku, manyetik halata (OMT) cihazı bir sinek nasıl halata açıklar. Biz, nadir toprak mıknatıslar ve koku bağlantı noktalarını ve nasıl en iyi koku izleme ulaşmak için uyaran teslim ve suction için kütle akış oranını ayarlamak için hizalamak nasıl açıklar.
Abstract
Bu böcekler, bir rüzgar akışı başlığı stabilize etmek için görsel ipuçları kullandıkları uzun yıllar boyunca açık olmuştur. Birçok hayvan, rüzgarla taşınan kokuları takip edin. Upwind gibi, görsel istikrar koku izleme doğrudan yardımları izleme. Ama koku alma sinyalleri doğrudan rüzgar ipuçları bağımsız görsel izleme davranışlarını etkiler mi? Ayrıca, nörofizyoloji ve Drosophilia'daki koku duyusunun nörodavranışsal genetik araştırma son tufan, her zamankinden daha teknik olarak karmaşık ve nicel davranış testleri motive vardır. Burada, aslında arena dar laminer akış koku tüyleri ile donatılması görme deneyleri için geliştirilen bir manyetik halata sistemi değiştirilmiş. Bir sinek küçük bir çelik pim yapıştırılmış ve serbestçe yaw sağlayan bir manyetik alan asılı. Küçük çaplı gıda koku tüyleri, aç bir sinek tarafından istikrarlı izleme eliciting, sinek s başının üzerinde aşağıya doğru yönlendirilir. Burada, mıknatıslar hizalayarak koku bulutunun tasarlayarak ve istikrarlı bir koku izleme teyit tethering kritik mekaniği odaklanmak.
Protocol
Giriş
OMT bir "sanal tüy simülatörü" dahil etmek için tasarlanmış bir manyetik halata sistemi [1] bir adaptasyon. Aşağıdaki protokolleri nasıl düzgün bir halata sinekler (Bölüm 1) ve mıknatıslar (Part 2) ve kütle akış düzenlenmiş koku dağıtım sistemi (Part3) kurmak için stratejiler sağlayacaktır. Burada açıklanan bilgiler, bu özel sistem için optimize edilmiş ve bileşenler için diğer teknik özellikleri ile farklılık gösterebilir.
Bölüm 1: tethering sinekler
Burada açıklanan tethering adımları çok önceki çalışmalarda benzer [2] ancak bir OMT kullanım için adapte [3]. Uygun tethering sağlam ve tekrarlanabilir deneysel çalışmalarda sağlamak için çok önemlidir. Dikkatli tethering önemi göz ardı edilemez.
- 4-6 gün eclosion sinekleri toplayın ve 4-6 saat açlıktan. Kimwipe foodless flakon kuruma önlemek için su ile ıslatılmış yerleştirin.
- Bir şişe sinek toplu küçük bir flakon transferi ve santigrat yaklaşık 4 derece Peltier soğutma sahnede pirinç blok yerleştirin. Uygun sıcaklık yaklaşık 30 saniye içinde sinekleri anesthetizes.
- Soğuma evresi, soğuk yüzey üzerinde sinekler sıralayın. Nemli bir Kimwipe manikür sürekli soğutma ve nem esneklik sağlar. Tethering için en büyük kadın seçin.
- Ince bir fırça kullanarak, tek bir sinek özel olarak inşa edilen bir lahit, tek bir vahşi tip kadın meyve sineği uyum şekillenmiştir pozisyona itin.
Şekil 1.
Rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. - Biz bir micromanipulator üzerine monte edilmiş bir manyetik çubuk ile minutien pin (Cezalar Bilim Araçları) yerleştirin. Pin, künt sonunda sadece iki kanadı arasındaki başın arkasında dorsal toraks dokunur gibi uyumlu hale getirilmesi. Kafa gözleri doğru bakıldığında pin mükemmel dikey olmalıdır. , Sinek ve pin arasındaki 'roll' bile küçük bir miktar tolere edilemez. Pin ve vücudun uzun ekseni arasındaki yan görüş açısı, burun-ufuk (Şekil 1) göre 30 derecelik bir açıda olması gerekir. Not: mıknatıs halata optimum işletimi için, pimleri kısa uzunluklarda kesilmiş gerekebilir. Bu süspansiyon mıknatıslar arasındaki mesafeyi tamamen bağlıdır.
- Minutien pin uyumlu sonra, UV-aktive tutkal (elektrolit Corp) minutien pin künt sonuna kadar küçük bir damla uygulamak için bir ince çelik tel kullanın.
- Tutkal damlacık sadece başının üstünde sinek toraks dokunur, böylece pin işleyin. Uygun damla boyutu ile, tutkal tavlama ve toraks üzerine pin akış. Çok yapıştırıcı kullanmak için dikkatli olun.
- UV ışık iki adet 20 saniyelik atışlarla Cure tutkal.
- Sabit bir sinek bir kenara koyun ve tekrarlayın. Kimwipe küçük kareler şeklinde dilimleyin ve forseps ile uçuş dizginlemek için her gergin uçmak için tek vermek.
- Bir saat sonra kurtarma, gergin sinekler deneyler için hazır.
- Yanlış yapıştırma mıknatıs arenada gerçekleştirmek için bir sinek yeteneğini engelleyebilir. Her sinek sinekler düzgün yapıştırılmış sağlamak için her türlü deney başında düz rotasyon için kontrol edilmelidir. Bu yeterince büyük bir mekansal süre ile güçlü optomotor tepkiler çizgili desen dönen yapılabilir [4]. Sinek yanlış eğim açısı yapıştırılmış veya rulo eksenine göre pin eğik ise, uçabilirsiniz: (i) hiç dönmeye, (ii) sınırlı bir hareket var, ya da (iii) tutarsız döndürmek hız. Yukarıdaki durumlarda anında atılır ve yenisi ile değiştirilir. Bu sorunu çözerse, büyük olasılıkla yanlış yapıştırma bir durumda idi. (Sinek değiştirilmesi sorunu çözmezse, Bölüm 2.4 'e bakınız)
Bölüm 2: mıknatıslar hizalama
Mıknatıslar (Nadir-toprak-magnets.com) hizalama, düzgün, pürüzsüz bir 360 derece aralığında hareket ulaşmak için sinek için gerekli. Mıknatıslar düzgün hizalamak için şu adımları izleyin.
- Düşük halka mıknatıslar yatay plastik bir kol tarafından düzenlenen ve doğrudan açık bir vakum odasının üstüne yerleştirilir (Şekil 1, bölüm 3) daha sonra açıklanacaktır. Üst çubuk mıknatıs alt mıknatısın üzerine dikey olarak yaklaşık 3 / 4 "sabittir.
- Kabaca, doğrudan alt halka mıknatıslar merkez noktası üzerinde üst çubuk mıknatıs yerleştirerek görsel olarak alt ve üst mıknatıslar hizalamak. Bu ince ölçekli ayarı için üst mıknatıs mikromanipülatör (Siskiyou A.Ş.) eklemek yararlı olacaktır.
- Epoksi üst mıknatısın alt yüzeyinde bir V-mücevher rulman (Küçük Parça) dönme sürtünme en aza indirmek ve sinek konumlandırma standardize etmek.
- Arenada bir sinek yerleştirin ve yatay ve vsinek kadar üst mıknatısın ertical pozisyonu sorunsuz ve sürekli yaw ekseninde 360 derece dönebilir. Her sinek mıknatıslar doğru hizalanır ve bireysel minutien pimleri (bkz. Bölüm 1.11) zarar görmediğinden emin olmak için her deneyde başında düz rotasyon için kontrol edilmelidir. Mıknatıslar düzgün uçabilirsiniz (i) tüm dönmeye uyumlu değildir (ii) Eğer sınırlı bir hareket aralığı (iii) tutarsız hızlarda dönmesini var. Yeni bir sinek değiştirerek sorunu çözüldü ise, (bkz. Bölüm 1) büyük olasılıkla bir yapıştırma sorunu nedeniyle oldu. Bu sorunları her sinek için varsa, büyük olasılıkla, mıknatıslar ve daha fazla uyum gerekli olacaktır hizalama ile bir konudur.
- Uyarı: eğlenceli olabilir nadir toprak mıknatıslar ile oynarken, onlar çok tehlikelidir. Hasarlı ekipman ve / veya küçük yaralama sonuçları Kötüye Kullanımı. Bu cazip henüz kolaylıkla hafife mıknatıslar çok dikkatli olun.
Bölüm 3: Koku Teslimat
- Koku dağıtım sistemi daha önce açıklanan bir dayanmaktadır [5] ve optimize etmek için en zor kısmı (Şekil 1). Bu bir çok sabır ve deneme-yanılma gerektirir. Istikrarlı bir koku izleme ulaşmak için şu adımları izleyin.
- Koku sisteminin ilk set-up, özel yapılı su / koku şişeleri, gaz çoklayıcı (Sable Systems International) dar göstergesi teflon tüp (Küçük Parça) çalıştıran gerektirir. Bu şişeleri çıkış aynı teflon tüp kullanarak derialtı liman tüplerine doğrudan bağlanır.
- Açık bir akrilik vakum odasına mıknatıslar desteklemek için arenada altında konumlandırılmış. Biz sinek yakın açılış vakum getirmek ve açılış çapı azaltmak için vakum odasına bağlı sinek altına monte 4mm cam tüp kullanın.
- Forseps kullanarak arenaya gergin bir sinek yerleştirin.
- (Elma sirkesi iyi çalışıyor), çekici bir koku ve görsel sinek, koku izler doğrulamak açın. Sinek koku için bir tercih var gibi görünüyorsa, önümüzdeki üç adımları izleyin. Bu birkaç sinek ve çeşitli çalışmalar gerekebilir.
- Sinek, koku izlemek için görünene kadar koku liman konumunu ayarlayın. Biz sinek kafası koku mikromanipülatörler port (Siskiyou A.Ş.) ve konumlandırılmış 4mm ve 3mm dorsal anterior monte edilebilir.
- Sinek, koku izlemek için görünene kadar kütle akış hızını ayarlayın. Bizim ayarları 7ml/min Sable Systems International (MFC-4).
- Sinek, koku izlemek için görünene kadar vakum akış hızını ayarlayın. Biz, bir akış regülatörü (Cole Parmer) kullanarak 13l/min vakum debisi ayarlayın. Not: Bina vakum besleme hatları, tüy yapısı dalgalanmalara neden zaman içinde değişkenlik gösterebilir. Akış regülatörü sabit vakum akış koşulları için harici bir vakum pompası bağlamak için yararlı olabilir.
- Liman ve akış hızları konumunu ayarlamak sonra, periyodik olarak bir gaz çoklayıcı kullanılarak değiştirilebilir kullanarak teslim su buharı ve kokusu buharı arasındaki geçiş ve görsel sinek, koku açıkken sadece koku izler olduğunu doğrulamak. Bazen, koku portu içinde kalan koku koku kapalı koku izleme temin edebilirsiniz. Bu, düzgün bir şekilde yerleştirilmiş bir koku port etanol ile derialtı tüpleri dolum ve Kimwipe ile teslim ucunda toplama çıkarmadan ortadan kaldırılabilir. Basınçlı hava kullanarak, kalan etanol darbe ve deneyler devam.
Temsilcisi Sonuçlar:
Bu adımları doğru takip edildiğinde iki şeye dikkat edilmelidir. İlk olarak, sürekli dönen görsel uyaranlara altında gergin bir sinek OMT yerleştirilen sorunsuz yaw ekseninde 360 derece dönmelidir. "Aptal" tur (sakkadlar denir) sabit görsel uyaranların yokluğunda spontan dönüm davranış özelliğidir. Sinekler görünüşte sorunsuz döndürmek yapamıyorsanız, yanlış yapıştırma (Part 1) ve hizalanmamıs mıknatıslar (bkz. Bölüm 2) suçlu olabilir. İkincisi, koku açıldığında, sinek, koku yönde başkanı olmalıdır. Koku kapatıldığında, sinek arenada herhangi bir tek pozisyon için hiçbir tercih kendiliğinden sakkaddan gerekir. Sineklerin koku bulutunun, koku liman konumunu, hava akış hızı ve / veya vakum debisi aktif takip etmiyorsanız ayarlanması gerekebilir (bkz. Bölüm 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinekler tethering ve bu alanda istikrarlı bir koku izleme eliciting oldukça basittir. Bu uygulama, sabır ve deneme ve yanılma gerektirir. Bu alanda birçok yerinde daha deneysel potansiyel farklılıklar verim için optimize edilmiş ya da değiştirilmiş olabilir. Örneğin, vakum odasının yeni sürümleri çok daha küçük ve arenada altında daha fazla yer sağlar. Ayrıca, nadir toprak mıknatıslar gücü ve tipi biraz değişik olabilir ve ek koku koku türleri ve / veya konsantrasyonları, deneylerde kullanılan sayısını artırmak için port eklenebilir. Biz, herhangi bir ekipman varyasyonları size özel optimizasyon gerektirdiğini unutmayın. Burada açıklandığı gibi OMTA, kullanıcıların koku lokalizasyonuna görsel ipuçları etkisini test etmek için izin verir. Çok yönlülük ve genişleme sistemi, pek çok düzeyde görsel-koku alma entegrasyonu keşfetmek için bir potansiyel sunmaktadır koku dağıtım sistemi ile birleştiğinde çok çeşitli görsel uyaranlara LED panel sistemi ile sunulan ve olabilir. Bu sistem aynı zamanda, Drosophila kantitatif davranış testleri sayısının artması için özellikle uçan yetişkinlerin davranışlarını tanımlamak için ekler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansman Ulusal Bilim Vakfı (MF) tarafından sağlanmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
