Summary
Sinais de cálcio desempenham um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a sobrevivência de expressão gênica e diferenciação. Aqui demonstramos como realizar imagens de cálcio usando Fura-2 AM. Imagem de cálcio é uma ferramenta valiosa para estudar a regulação do cálcio intracelular em tempo real e de sua regulamentação de cascatas de sinalização.
Abstract
Imagem de cálcio é uma técnica comum, que é útil para medir sinais de cálcio em células em cultura. Técnicas de imagem de cálcio tirar proveito de corantes de cálcio indicador, que são baseados em BAPTA moléculas orgânicas que alterar as suas propriedades espectrais, em resposta à ligação de íons Ca2 +. Corantes indicador de cálcio caem em duas categorias, relação de métricas corantes como Fura-2 e Indo-1 e um único comprimento de onda corantes como Fluo-4. Relação de métricas corantes mudar tanto sua excitação ou seus espectros de emissão em resposta ao cálcio, permitindo a concentração de cálcio intracelular para ser determinada a partir da proporção de emissão de fluorescência ou excitação em comprimentos de onda distintos. A principal vantagem do uso de relação de métricas corantes mais sondas único comprimento de onda é que o sinal relação é independente da concentração de corante, a intensidade da iluminação, e comprimento do percurso óptico permitindo que a concentração de cálcio intracelular a ser determinada independentemente de esses artefatos. Um dos indicadores de cálcio mais comum é o Fura-2, que tem um pico de emissão em 505 nm e muda o seu pico de excitação de 340 nm até 380 nm, em resposta ao cálcio vinculativo. Aqui nós descrevemos o uso de Fura-2 para medir a elevação de cálcio intracelular em neurônios e outras células excitáveis.
Protocol
Cultura de células
As células podem ser cultivadas usando técnicas estabelecidas, mas devem ser semeadas em # 1 lamínulas de vidro revestidas com uma cola celulares (como polilisina, polyornithine ou laminina) para evitar que as células de separar ou em movimento durante as experiências de imagem.
Soluções
Experimentos com imagens de cálcio pode ser realizada utilizando uma variedade de soluções fisiológicas, incluindo meios de cultura celular. É importante, no entanto, para se certificar de que as soluções estão livres de vermelho de fenol, o que aumenta o fundo fluorescente. Usamos Tyrodes solução, que é feito facilmente e imita líquido cefalorraquidiano, e completá-la com 0,1% de soro albumina bovina. Usamos despolarização com 60-90 cloreto de potássio mM para ativar os canais de cálcio voltagem gated e tapsigargina 1 Hm (1 mM em DMSO estoque) ou 2μM Ionomicina (1 estoque mM em DMSO) para ativar loja operado canais CRAC. Muitas vezes é conveniente para remover o cálcio da solução extracelular para mostrar que elevações de cálcio são devido ao influxo de cálcio. Ao remover o cálcio é necessário para manter a concentração total de cátions divalentes (Mg 2 + e Ca 2 +) constante. Em caso de substituição de potássio de sódio é necessário para manter o equilíbrio osmótico.
Tyrodes soluções:
| Baixa de potássio 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Baixa de potássio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | Alta de potássio 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Alta de potássio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| Glicose | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
Ajustar o pH para 7,4 com NaOH
Carregamento de Fura-2 corante de cálcio
Nós carregamos células com acetoxi-metil-éster Fura-2 (Fura-2 AM), que se difunde através da membrana celular e é de-esterificados por esterases celulares para produzir Fura-2 ácido livre. Os parâmetros exatos para Fura-2 carga variam amplamente entre tipos de células. É aconselhável testar várias condições, preparando soluções de carregamento várias concentrações contendo um múltiplo de Fura-2 raging 1-4 M, incubando as células na solução de carga para uma variedade de tempos de 15 minutos a 2 horas e testar a carga à temperatura ambiente e a 37 graus. Um protocolo simplificado para neurônios corticais é dada abaixo:
- Primeiro, prepare a 1 mM Fura-02:00 estoque, adicionando 50μl de DMSO para um frasco de 50μg disponível a partir de Invitrogen. É importante o uso de DMSO secos embalados sob nitrogênio e é necessário remover o DMSO com uma agulha por punção do septo para impedir a hidratação do DMSO. Depois de preparar a solução de Fura-2 AM mantê-lo em um lugar escuro e seco. Fura-02:00 em DMSO é estável à temperatura ambiente por 24 horas e é estável a - 20 graus em um recipiente seco por vários meses.
- Alíquota de 2 mls de meios de cultura para um tubo cônico de 15 ml, quente a 37 graus. e adicionar 2μl de Fura-02:00 ações para gerar um 1 Hm Fura-2:00 solução. Solução a Vortex vigorosamente durante 1 minuto.
- Transferir a solução de carregamento para uma placa de cultura 35 milímetros de tecido e transferir a lamela com as células no prato.
- Incubar os neurônios a 37 graus por 30 minutos em uma incubadora escuro. O tempo de incubação com precisão.
- Prepare um prato de 35 mm contendo 2 ml de meio de cultura de tecido sem Fura-2 AM. Retirar as lamelas da solução de carga e coloque no prato novo.
- Montar a lamínula na câmara de imagem. Retirar as lamelas do prato de 35 mm e rápida montagem para a câmara certificando-se de evitar o ressecamento das células. Nós usamos uma câmara de imagem fabricados pela Warner Instruments que permite uma lamela 10 milímetros contendo as células a ser montado na parte inferior e uma lamela segundo a ser montado na parte superior formando um sanduíche. As duas lamelas são garantidos com graxa de vácuo para a câmara e dois tubos em cada extremidade da câmara de permitir a perfusão de soluções através da câmara. A linha de entrada é conectado a uma seringa ea linha de saída é conectado a um bem que é esvaziado por uma linha de sucção conectado a uma armadilha de vácuo.
O microscópio
Nós usamos um microscópio invertido Nikon Eclipse TE2000-U equipada com um arco de xenon da lâmpada (Sutter Instruments), uma etapa automatizada (Ludl), uma roda de excitação do filtro (Ludl), e um dispositivo de carga par-cooled (CCD) da câmera (Hamamatsu Orka II). O microscópio é controlado por um com Macintoshputer executando o software Lab Open (Improvisação). Vários outros pacotes de software estão disponíveis para imagens raciométrica. Para geração de imagens que usamos 40, 60 ou 100x Nikon Fluor objetivos óleo de imersão com um NA superior a 1,2.
Protocolo de imagem
- Calibrar o estágio do microscópio.
- Carga Tyrodes solução para a linha de entrada tendo o cuidado de evitar a formação de bolhas de ar.
- Ligue a câmara para as linhas de perfusão e solução Tyrodes perfundir através da câmara, mais uma vez, tomando o cuidado para evitar a formação de bolhas na câmara
- Coloque uma gota de óleo sobre o objectivo, colocar a câmara sobre o estágio do microscópio e focar as células usando luz transmitida.
- Examinar a fluorescência das células com uma iluminação a 340 e em 380 nm usando as oculares. Células em repouso deve ser fraca a 340 e brilhante a 380. Em geral, as células não deve ser iluminado com luz UV por mais de 10 ou 15 segundos ea intensidade da luz de excitação deve ser reduzida com um filtro de densidade neutra para evitar fototoxicidade.
- Examine as células usando a câmera e definir o ganho ea exposição da câmera para gerar uma imagem que está próximo da saturação (mas não saturada) quando iluminados a 380 nm e bem abaixo da saturação quando iluminado a 340 nm. Manter a exposição abaixo de 200ms, se possível. Uma vez definida, não alteram o ganho da câmera ou a exposição a menos que você planeje também alterar o fundo, Rmin e Rmax (veja abaixo).
- Coletar uma imagem em cada comprimento de onda e utilizar a ferramenta de região de interesse (ROI) para medir a intensidade do fundo em uma variedade de locais nas imagens para cada comprimento de onda.
- A média dos valores de fundo e insira os valores de fundo para os locais apropriados no programa de imagem. O valor do fundo será subtraído de cada pixel no campo.
- Coletar uma imagem de relação prática e ajustar os valores limite para cada comprimento de onda para gerar uma imagem de relação que inclui apenas as células e não o fundo e que não é ruidoso na região próxima às bordas das células.
- Definir o valor de índice mínimo (Rmin) a ser cerca de 10% abaixo do menor proporção de qualquer célula no campo.
- Definir o Rmax em cerca de 12 vezes a Rmin. Não altere a Rmin ou Rmax entre experimentos que pretende comparar como ele vai fazer a comparação difícil. Nós raramente mudar o Rmin e valores Rmax em nosso equipamento de imagem.
- Use o palco automatizado para encontrar os campos que você planeja para a imagem, e registrar a localização de cada campo de utilização do software. Em geral, coletar cinco campos de visão durante um experimento. Os movimentos de palco automatizado para um campo, coleta uma imagem de relação e se move para o próximo campo.
- Configure o intervalo de lapso de tempo para coletar imagens entre 0,1 e 10 segundos de diferença, dependendo do tipo de sinais que você espera ver.
- Iniciar o experimento.
- Ao testar o sistema de imagem de cálcio é frequentemente útil para usar estímulos como tyrodes elevado de potássio (65 mM KCl) ou ionomicina (2μM) que irá causar um aumento de cálcio intracelular e solução de cálcio livre extracelular que (contendo o buffers de cálcio como EGTA e BAPTA ) que irá reduzir a concentração de cálcio.
Análise
Uma vez que a experiência é completa você vai querer converter o conjunto de imagens de formato em medições de lapso de tempo de cálcio para as células individuais ou regiões de interesse dentro das células. Para fazer isso:
- Use a ferramenta região de interesse (ROI) para definir as áreas da imagem em que você quer medir cálcio. Em geral, é útil ter pelo menos um ROI que cobre o corpo da célula. Ao definir o ROI, é útil para reproduzir o filme das imagens para verificar se as células não se movem durante o curso do experimento.
- Usar o software para coletar medições de lapso de tempo para cada relação de ROI em cada imagem.
- Importar as medições relação em um programa de análise. Você vai precisar para ver os traços de cálcio para as células específicas ou ROIs, média ou várias células ROIs e converter as medidas relação a valores de cálcio intracelular. Nós usamos um conjunto de macros escritos em Igor Pro que nos permitem fazer todas essas tarefas de análise comum, mas outros programas como Excel, embora menos conveniente também pode ser usado.
- A equação [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd pode ser usado para converter os valores Fura-2 a relação de concentrações de cálcio intracelular. [Ca] é a concentração de cálcio, R é o Fura-2 340/380 ratio, Rmin e Rmax estão as relações 340/380, na ausência de cálcio ou na presença de uma concentração de saturação de cálcio, respectivamente, e Sf * Kd é o produto do Kd de Fura-2 (aproximadamente 120 nm a RT) e um valor de escala. Para medir a R Min, Max e R Sf * Kd é necessário executar qualquer uma in vivo ou um na calibração in vitro. Na calibração vivo exige umcombinação de patch clamping e imagem de cálcio, que pode ser complicado, mas é também muito preciso. Na calibração in vitro pode ser feito usando um home-made câmara de calibração que consiste em duas lamelas separadas por um espaçador lamela fina para gerar uma fina camada de solução na qual para realizar a calibração. A maneira mais conveniente de medir valores Fura-2 proporção em função da concentração de cálcio é a utilização de um kit de calibração que contêm várias soluções de cálcio tamponado e Fura-2 ácido livre. Estes podem ser obtidos a partir Invitrogen (Molecular Probes) e contêm instruções precisas para o uso.
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Discussion
Nesta apresentação nós passamos por todas as etapas para a realização de imagens de cálcio usando Fura-2 AM. Usamos neurônios corticais como um modelo, mas imagens de cálcio pode ser usado para medir a concentração de cálcio intracelular em tempo real em uma variedade de células. Ao fazer este procedimento é importante o uso de lamínulas de vidro em vez de plástico, uma vez que o plástico é muitas vezes fluorescentes em comprimentos de onda ultravioleta, o que torna difícil de imagem. Além disso, é importante para o revestimento de pré-as lamelas com polyornithine e laminina, a fim de evitar que as células de separar. Finalmente, é importante lembrar de evitar a criação de bolhas de ar quando a perfusão de soluções através da câmara de imagem.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
