Summary
Kalsiyum sinyalleri gen ekspresyonu, hayatta kalma ve farklılaşma dahil olmak üzere pek çok hücresel süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada Fura-02:00 kullanarak kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl göstermektedir. Kalsiyum görüntüleme, gerçek zamanlı ve sinyalizasyon kaskadlar düzenlenmesi hücre içi kalsiyum düzenlemeyi incelemek için değerli bir araçtır.
Abstract
Kalsiyum görüntüleme kültürlü hücrelerde kalsiyum sinyalleri ölçmek için kullanılan yaygın bir tekniktir. Kalsiyum görüntüleme teknikleri, Ca2 + iyonları bağlama yanıt spektral özelliklerini değiştirmek BAPTA-temelli organik molekülleri kalsiyum göstergesi boyalar, yararlanmak. Kalsiyum göstergesi boyalar, iki kategoriye Fura-2 ve Hint-1 ve Fluo-4 gibi tek bir dalga boyu boyalar gibi oran-metrik boyalar ayrılır. Oranı-metrik boyalar, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu farklı dalga boylarında floresans emisyon veya uyarma oranının belirlenmesine olanak sağlamıştır, kalsiyum yanıt uyarma ya da kendi emisyon spektrumları değişir. Tek bir dalga boyu probları üzerinden oran-metrik boyalar kullanarak ana avantajı oranı sinyal boya konsantrasyonu, aydınlatma yoğunluğu ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonu bu eserler bağımsız belirlenecek sağlayan optik yol uzunluğu bağımsız olmasıdır. En sık görülen kalsiyum göstergelerin biri bağlayıcı kalsiyum yanıt olarak bir emisyon 505 nM ve 380 nm 340 nm eksitasyon tepe tepe Fura-2,. İşte biz, nöronlar ve diğer Uyarılabilir hücreler hücre içi kalsiyum yükselmeler ölçmek için Fura-2 kullanımı açıklanmaktadır.
Protocol
Hücre Kültürü
Hücreler kurulan teknikleri kullanılarak yetiştirilen olabilir ama görüntüleme deneyler sırasında ayrılmakta veya hareketli hücreler önlemek için (polylysine polyornithine ya da laminin gibi) hücresel bir yapıştırıcı ile kaplanmış # 1 bardak lamelleri kaplama olmalıdır.
Çözümler
Kalsiyum görüntüleme deneyleri, hücre kültürü medya da dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik çözümleri kullanılarak yapılabilir. Bu çözümler floresan arka plan büyük ölçüde artırır fenol kırmızısı, emin olun, ancak önemlidir. Biz Tyrodes çözümü, kolay yapılan ve beyin omurilik sıvısı taklit ve Albumin% 0.1 Bovine Serum ile takviye kullanın. Biz mağaza çalışan Kerek kanalları etkinleştirmek için voltaj bağımlı kalsiyum kanalları ve 1 mikrona kadar Thapsigargin (1 mM stok DMSO içinde) veya 2μM Ionomycin (DMSO içinde 1 mM stok) etkinleştirmek için 60-90 mM potasyum klorür ile depolarizasyon kullanın. Ekstraselüler kalsiyum yükselmeler kalsiyum akını nedeniyle olduğunu göstermek için bir çözüm kalsiyum kaldırmak için çok uygundur. Kalsiyum çıkarırken bu iki değerli katyonların toplam konsantrasyonu (Mg 2 + ve Ca 2 +) sabit. Korumak için gerekli olan Sodyum potasyum yerine zaman ozmotik dengesini korumak için gereklidir.
Tyrodes çözümleri:
| Düşük potasyum 2mm Ca 2 + Tyrodes (mM) | Düşük potasyum 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | Yüksek Potasyum 2mm Ca 2 + Tyrodes (mM) | Yüksek Potasyum 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| Glikoz | 30 | 30 | 30 | 30 |
| HEPES | 25 | 25 | 25 | 25 |
NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın.
Fura-2 kalsiyum boya yükleme
Biz hücreleri yük asetoksi-metil ester Fura-2 hücre zarı boyunca yayılır ve hücresel esterazlar Fura-2 serbest asit verim de esterleşmiş (Fura 02:00). Fura-2 yükleme için tam parametreleri hücre tipleri arasında büyük ölçüde değişmektedir. , 4 mcM, 15 dakika ve 2 saat oda sıcaklığında yükleme test bir çok kez yükleme çözüm hücreleri kuluçka ve Fura-2 1 - azgın bir çok konsantrasyonları içeren çeşitli yükleme çözümleri hazırlayarak çeşitli koşullarda test tavsiye 37 derece. Kortikal nöronlar için basitleştirilmiş bir protokol aşağıda verilmiştir:
- Birincisi, DMSO, 50μl Invitrogen edinilebilir 50μg flakon ekleyerek Fura-2 stok 1 mM hazırlar. Azot gazı altında paketlenmiş kuru DMSO kullanmak için çok önemlidir ve septum batırılarak DMSO hidrasyon önlemek için bir iğne ile DMSO kaldırmak için gereklidir. Hazırladıktan sonra Fura 02:00 çözümü, karanlık ve kuru bir yerde saklayın. Fura-2, 24 saat boyunca oda sıcaklığında DMSO istikrarlı AM ve istikrarlı birkaç ay boyunca kuru bir kapta 20 derece.
- 37 derece sıcak bir 15 ml konik tüp, kültür ortamı kısım 2 ml. Fura-2 2μl eklemek ve bir 1 mikrona kadar Fura-2 çözüm üretmek için stok AM. 1 dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin çözüm.
- Transfer yükleme çözümü ve 35 mm doku kültürü çanak çanak içine hücreleri ile lamel transfer.
- 37 derece 30 dakika boyunca karanlık bir inkübatör nöronlar inkübe edin. Inkübasyon tam zamanı.
- Fura-2 AM olmadan 2 ml doku kültürü ortamı içeren 35 mm çanak hazırlayın. Lamel yeni çanak yükleme çözüm ve yerden çıkarın.
- Görüntüleme odasının lamel monte edin. 35 mm çanak lamel çıkarın ve hızla hücrelerin kurumasını önlemek için emin olun odasının üzerine monte. Biz, alt ve bir sandviç oluşturan üstüne monte edilmek üzere ikinci bir lamel üzerine monte edilmek üzere hücreleri içeren bir 10mm lamel sağlayan Warner Instruments tarafından üretilmiş bir görüntüleme odası kullanın. Odanın iki ucunda iki lamelleri haznesinden çözümler perfüzyon için izin vakum odasına yağ ve iki tüp ile teminat altına alınmıştır. Bir şırınga giriş hattı bağlanır ve bir vakum tuzak bağlı bir emme hattı ile boşaltılır iyi çıkış hattı bağlı.
Mikroskop
Biz, xenon ark lambası (Sutter Aletleri), otomatik bir sahne (Ludl), eksitasyon (Ludl) filtre tekerleği ve soğutmalı, çift şarj cihazı (CCD) kamera (Hamamatsu Orka ile donatılmış bir ters Nikon Eclipse TE2000-U mikroskop II). Mikroskobu, bir Macintosh com tarafından kontrol edilirputer Open Lab yazılım (Doğaçlama) çalışıyor. Birçok diğer yazılım paketleri oranlı metrik görüntüleme için mevcuttur. Görüntüleme için 40, 60 veya NA 1.2 aşan 100x Nikon Fluor immersiyon yağı hedefleri kullanın.
Görüntüleme Protokolü
- Mikroskop aşamasında Kalibre.
- Yük giriş hattı içine hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için özen çözüm Tyrodes.
- Odasında kabarcıklarının oluşmasını önlemek için özen, bir kez daha haznesinden perfüzyon hatları ve serpmek Tyrodes çözüm odasına bağlayın
- Hedefi üzerine petrol bir damla koyun, mikroskop sahnede odasına yerleştirin ve iletilen ışık kullanarak hücrelere odaklanmak.
- 340 ve göz mercekleri kullanarak 380 nm dalga aydınlatma kullanarak hücrelerin floresans inceleyin. Dinlenme hücreleri 380 340 az loş ve parlak olmalıdır. Genel olarak, hücreler daha 10 ya da 15 saniye süreyle UV ışığı ile aydınlatılmış değildir ve uyarma ışık yoğunluğunu fototoksisite önlemek için nötr yoğunluk filtresi ile azaltılmalıdır.
- Kamerayı kullanarak hücrelerin inceleyin ve doygunluk 340 nm'de aydınlatılmış çok altında 380 nm'de aydınlatılmış ve doygunluk (ama doymuş) yakın bir görüntü oluşturmak için kamera kazanç ve pozu ayarlamak. Pozlama mümkünse 200ms altında tutun. Aynı zamanda arka plan değiştirmek için düşünmüyorsanız kez ayarlandıktan sonra, kamera kazanç veya pozlama değişmez, Rmin ve rmax (aşağıya bakın).
- Her bir dalga boyunda bir görüntü toplayın ve her dalga boyu için görüntüleri çeşitli yerlerde arka planda yoğunluğunu ölçmek için ilgi (ROI) aracı bölgesi kullanın.
- Ortalama arka plan değerleri ve görüntüleme programı uygun yerlerde içine arka plan değerleri girin. Arka plan değeri alanında her pikselin düşülecektir.
- Bir uygulama oranı resmi toplayın ve her dalga boyu için, sadece ve arka plan hücreleri ve bu hücrelerin kenarlarına yakın bölgede gürültülü değildir içeren bir oran görüntü oluşturmak için Eşik değerleri ayarlayın.
- Alanında herhangi bir hücrenin en düşük oran yaklaşık% 10 altında olması, asgari oran değeri (Rmin) ayarlayın.
- 12 kez Rmin hakkında Rmax ayarlayın. Rmin veya Rmax deneyler arasında karşılaştırma zor hale getirecek olarak karşılaştırmak için planladığınız bir değişiklik yapmayınız. Biz nadiren görüntüleme teçhizat Rmin ve Rmax değerleri değiştirin.
- Görüntü planı alanları bulmak için otomatik sahne kullanın ve yazılımı kullanarak her alanın yerini kaydedebilir. Biz bir deney sırasında genellikle beş alan görüş topluyoruz. Bir alana otomatik sahne hamle, bir oran görüntü toplar ve bir sonraki alana geçer.
- Dışında görmeyi beklediğiniz sinyallerin türüne göre 0.1 ile 10 saniye arasında görüntü toplamak için geçen zaman aralığı ayarlayın.
- Denemeyi başlat.
- Kalsiyum görüntüleme sistemi test ederken bir hücre içi kalsiyum artışı ve kalsiyum ücretsiz ekstrasellüler çözüm sebep olur, yüksek potasyum tyrodes (65 mM KCl) veya ionomycin (2μM) gibi uyaranlara kullanmak çok yararlı olur (EGTA ve BAPTA gibi kalsiyum tamponlar içeren ) kalsiyum konsantrasyonunu azaltmak olacaktır.
Analiz
Bir kez deney, tek tek hücrelerin veya hücre içinde ilgi bölgelerde zaman atlamalı kalsiyum ölçümleri oranı görüntüleri dönüştürmek isteyecektir. Bunu yapmak için:
- Faiz aracı (ROI) bölgede kalsiyum ölçmek için istediğiniz resmin alanları tanımlamak için kullanın. Bu hücre hücre gövdesi kapsayan en az bir yatırım getirisi genellikle yararlıdır. ROI'ler tanımlarken, bu hücreleri deney seyri sırasında hareket etmez doğrulamak için görüntülerin film oynatmak için yararlıdır.
- Her görüntünün her bir yatırım getirisi için zaman atlamalı oranı ölçümleri toplamak için yazılımı kullanın.
- Bir analiz programı içine İthalat oranı ölçümleri. Belirli hücreler veya ROI'ler, ortalama birden fazla hücreleri veya ROI'ler için kalsiyum izlerini görmek ve kalsiyum değerleri intrasellüler oranı ölçümleri dönüştürmek için ihtiyacınız olacak. Daha az elverişli da kullanılabilmesine rağmen, bize bütün bu ortak analiz görevleri ancak Excel gibi diğer programlar yapmak için izin İgor Pro yazılmış makroları bir dizi kullanın.
- Denklemi [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd kalsiyum konsantrasyonları hücre içi Fura-2 oranı değerleri dönüştürmek için kullanılabilir. [Ca] Rmin ve rmax kalsiyum konsantrasyonu, R Fura-2 340 / 380 oranı, sırasıyla kalsiyum veya kalsiyum doyurarak konsantrasyon varlığında yokluğunda 340/380 oranları; Sf * Kd. Fura-2 Kd (RT yaklaşık 120 nM) ve bir ölçeklendirme değeri ürünü. R Min, R Max ve Sf * Kd bunu ölçmek için bir in vivo veya in vitro kalibrasyon birini gerçekleştirmek için gerekli. In vivo kalibrasyon gerektiren birkarmaşık olabilir ama yama sıkma ve kalsiyum görüntüleme kombinasyonu da çok hassas. In vitro kalibrasyon kalibrasyon gerçekleştirmek için hangi çözüm ince bir tabaka oluşturmak için ince bir lamel ayırıcı ile ayrılmış iki lamelleri oluşan bir ev yapımı Kalibrasyon odası kullanılarak yapılabilir. Bir fonksiyonu olarak kalsiyum konsantrasyonlarının Fura-2 oranı değerleri ölçmek için en uygun yol, birden fazla tamponlu kalsiyum çözümleri ve Fura-2 serbest asit içeren bir kalibrasyon kiti kullanmaktır. Bu Invitrogen (Moleküler Problar) elde edilen ve kullanım için kesin talimatlar içeriyor olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sunumda PM Fura-2 kullanılarak kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için tüm adımları geçtiniz. Biz bir model olarak kortikal nöronların kullanılan ancak kalsiyum görüntüleme, gerçek zamanlı olarak çeşitli hücrelerden oluşan bir hücre içi kalsiyum ölçmek için kullanılan olabilir. Bu işlemi yaparken plastik görüntüleme zor kılan morötesi dalga boyunda, genellikle floresan olduğundan, plastik yerine cam lamelleri kullanmak önemlidir. Ayrıca, polyornithine ve laminin lamelleri ayrılmakta hücreleri önlemek amacıyla ön kat önemlidir. Son olarak, görüntüleme odasının üzerinden çözümler perfüze zaman hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için hatırlamak önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
