Summary
אותות סידן משחקת תפקיד חשוב בתהליכים תאיים רבים, כולל הישרדות ביטוי גנים בידול. כאן אנו מדגימים כיצד לבצע הדמיה סידן באמצעות Fura, 02:00. הדמיה סידן הוא כלי רב ערך כדי ללמוד את ויסות סידן תוך תאי בזמן אמת ורגולציה של מפלי איתות.
Abstract
הדמיה סידן היא טכניקה נפוצה שימושי למדידת אותות סידן בתאים בתרבית. טכניקות ההדמיה סידן לנצל אינדיקטור צבעים סידן, שהם BAPTA מבוססי מולקולות אורגניות, כי לשנות את מאפייני הספקטרום שלהם בתגובה לקשירה של יוני Ca2 +. אינדיקטור צבעים סידן מתחלקים לשתי קטגוריות, יחס מטרי צבעים כמו Fura-2 ו ההודו-1 ו יחיד הגל צבעים כמו Fluo-4. יחס-מטרי לשנות צבעים או עירור שלהם או ספקטרום הפליטה שלהם בתגובה סידן, המאפשר ריכוז סידן תוך תאי שייקבע על פי היחס של פליטת הקרינה או עירור באורכי גל שונים. היתרון העיקרי של שימוש יחס מטרי צבעים על בדיקות אורך גל יחיד היא אות יחס אינו תלוי בריכוז צבע, עוצמת תאורה, אורך מסלול אופטי המאפשר ריכוז סידן תוך תאי שייקבע בנפרד ממצאים אלה. אחד המדדים הסידן הנפוץ ביותר הוא Fura-2, אשר יש שיא פליטה ב 505 ננומטר שינויים שיא עירור שלה ננומטר 340-380 ננומטר בתגובה סידן מחייב. כאן אנו מתארים את השימוש Fura-2 כדי למדוד את הגבהים של סידן תוך תאי נוירונים ותאי להתרגש אחרים.
Protocol
תא תרבות
ניתן לגדל תאים באמצעות טכניקות הוקמה אבל חייב להיות מצופה על # 1 coverslips זכוכית מצופה דבק סלולרית (כמו polylysine, polyornithine או laminin) כדי למנוע את התאים מפני ניתוק או העברת במהלך הניסויים הדמיה.
פתרונות
הדמיה ניסויים סידן יכול להתבצע באמצעות מגוון של פתרונות מדיה הפיזיולוגי כולל תרבית תאים. חשוב, עם זאת, על מנת לוודא כי הפתרונות הם חינם של פנול אדום, אשר מגדיל מאוד את הרקע ניאון. אנו משתמשים Tyrodes פתרון, אשר מורכב בקלות מחקה הנוזל השדרתי, ואנחנו משלימים את זה בסרום שור 0.1% אלבומין. אנו משתמשים עם שלילת קוטביות mM אשלגן כלוריד 60-90 להפעיל מתח ערוצי סידן מגודרת ו Thapsigargin 1μM (1 מניות מ"מ DMSO) או 2μM Ionomycin (1 מניות מ"מ DMSO) כדי להפעיל את החנות פעלה ערוצי CRAC. לעיתים קרובות נוח להסיר סידן מן הפתרון תאיים להראות כי הגבהים סידן הן בשל זרם סידן. בעת הסרת הסידן הכרחי כדי לשמור על ריכוז כולל של קטיונים divalent (Mg 2 + ו - Ca 2 +) קבוע. כאשר מחליפים עבור אשלגן נתרן יש צורך לשמור על איזון אוסמוטי.
Tyrodes פתרונות:
| אשלגן נמוכה 2mm Ca 2 + Tyrodes (מ"מ) | נמוכה אשלגן 0 Ca 2 + Tyrodes (מ"מ) | אשלגן גבוהה 2mm Ca 2 + Tyrodes (מ"מ) | אשלגן גבוהה 0 Ca 2 + Tyrodes (מ"מ) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| גלוקוז | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
התאם ל-pH 7.4 עם NaOH
טוען של צבע Fura-2 סידן
אנו לטעון תאים עם acetoxy-methyl-אסתר Fura-2 (Fura, 02:00), אשר מפזרת על פני קרום התא הוא דה esterified ידי esterases הסלולר להניב Fura-2 חומצה חופשית. הפרמטרים המדויקים לטעינת Fura-2 משתנים במידה רבה על פני סוגי תאים. אנו ממליצים על בדיקות בתנאים שונים על ידי הכנת מספר פתרונות טעינה המכילים ריכוזים שונים של Fura-2 משתוללת 1-4 מיקרומטר, דוגרים תאים פתרון הטעינה עבור מגוון רחב של פעמים מ 15 דקות עד 2 שעות בדיקת טעינה בטמפרטורת החדר ב 37 מעלות. פרוטוקול פשוטה עבור נוירונים בקליפת המוח היא כדלקמן:
- ראשית, להכין את mM 1 Fura-2:00 המניות על ידי הוספת 50μl של DMSO על בקבוקון 50μg זמינים Invitrogen. חשוב להשתמש DMSO יבש ארוז תחת חנקן יש צורך להסיר את DMSO עם מחט על ידי ניקוב מחצה למנוע הידרציה של DMSO. לאחר הכנת הפתרון Fura, 02:00 לשמור אותו במקום חשוך ויבש. Fura 02:00 ב-DMSO הוא יציב RT במשך 24 שעות והוא יציב ב - 20 מעלות במיכל יבש במשך כמה חודשים.
- 2 Aliquot MLS של התקשורת בתרבות לתוך שפופרת 15 מ"ל חרוטי, חם 37 מעלות. ולהוסיף 2μl של Fura, 02:00 המניה כדי ליצור 1μM Fura, 02:00 פתרון. הפתרון וורטקס במרץ למשך דקה 1.
- מעבירים את הפתרון טעינת אל צלחת 35 מ"מ רקמת התרבות ולהעביר את coverslip עם תאים לתוך המנה.
- דגירה הנוירונים ב 37 מעלות למשך 30 דקות חממה כהה. זמן הדגירה בדיוק.
- הכינו צלחת 35 מ"מ המכיל 2 MLS של התקשורת בתרבות רקמה ללא Fura, 02:00. הסר את coverslip מפתרון העמסה מקום בצלחת החדש.
- הר coverslip על החדר הדמיה. הסר את coverslip מצלחת 35 מ"מ במהירות לעלות על החדר ולוודא כדי למנוע התייבשות של התאים. אנו משתמשים תא הדמיה שיוצרו על ידי וורנר מכשירים המאפשר coverslip 10mm המכיל את התאים להיות מותקן על הקרקעית coverslip השנייה להיות מותקן על החלק העליון ויוצרים כריך. שני coverslips מובטחות עם גריז ואקום לחדר ושני צינורות בכל צד של החדר לאפשר זלוף של פתרונות דרך החדר. שורת הקלט מחובר מזרק ואת קו פלט מחובר היטב כי הוא רוקן על ידי קו יניקה מחובר מלכודת ואקום.
המיקרוסקופ
אנו משתמשים הפוכה Nikon Eclipse TE2000-U מיקרוסקופ המצויד קשת קסנון מנורה (סאטר מכשירים), שלב אוטומטית (Ludl), גלגל עירור לסנן (Ludl), וכן מכשיר מקורר תשלום הזוג (CCD) המצלמה (Hamamatsu Orka II). המיקרוסקופ נשלטת על ידי com מקינטושputer מפעיל תוכנה מעבדת פתוח (אימפרוביזציה). מספר חבילות תוכנה אחרים זמינים הדמיה ratiometric. עבור הדמיה נשתמש 40, 60 או 100x Nikon טבילה פלואוריד שמן עם מטרות NA העולה על 1.2.
הדמיה פרוטוקול
- כייל את הבמה מיקרוסקופ.
- טען Tyrodes פתרון לתוך שורת הקלט לטפל כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר.
- חבר את תא לקווי זלוף ו Tyrodes פתרון perfuse דרך חדר שוב, מקפיד למנוע היווצרות של בועות בתא
- מניחים טיפת שמן על המטרה, במקום חדר על הבמה מיקרוסקופ ולהתמקד התאים באמצעות האור המועבר.
- בדוק את הקרינה של תאים באמצעות הארה על 340 ועל 380 ננומטר באמצעות מהעיניות. תאים מנוחה צריך להיות עמום ב 340 ובהיר ב 380. באופן כללי, התאים לא צריך להיות מואר באור UV במשך יותר מ -10 או 15 שניות את עוצמת האור עירור יש לצמצם את צפיפות ניטרלי מסנן כדי למנוע phototoxicity.
- בחנו את התאים באמצעות המצלמה ולהגדיר את רווח החשיפה של המצלמה כדי לייצר דימוי קרוב רוויה (אך לא רווי) כאשר מואר ב 380 ננומטר הרבה מתחת הרוויה כאשר מואר ב 340 ננומטר. שמור את החשיפה מתחת 200ms אם זה אפשרי. לאחר ההגדרה, אינם משנים את לזכות במצלמה או חשיפה אלא אם כן אתה מתכוון גם לשנות את הרקע, RMin ו RMax (ראה להלן).
- איסוף תמונה באורך גל אחד ולהשתמש באזור של כלי עניין (ROI) כדי למדוד את העוצמה של הרקע במגוון רחב של מקומות את התמונות עבור כל אורך גל.
- ממוצע הערכים רקע הזן את הערכים לתוך הרקע במיקומים המתאימים בתוכנית הדמיה. ערך הרקע יהיה מופחת כל פיקסל בתחום.
- איסוף תמונה יחס בפועל ולהתאים את ערכי הסף עבור אורך גל אחד כדי ליצור תמונה היחס הכולל רק את התאים ולא את הרקע וזה לא רועש באזור לסגור את הקצוות של התאים.
- הגדר את ערך יחס מינימלי (RMin) יהיה כ -10% מתחת להון הנמוכה ביותר של תא כלשהו בתחום.
- הגדר את RMax להיות כ 12 פעמים RMin. אל תשנה את RMin או RMax בין ניסויים שבכוונתך להשוות כמו זה יגרום ההשוואה קשה. לעתים רחוקות אנחנו השינוי RMin וערכים Rmax על אסדת ההדמיה שלנו.
- השתמש שלב אוטומטית כדי למצוא את שדות שבכוונתך תמונה, ולהקליט את המיקום של כל שדה באמצעות התוכנה. בדרך כלל אנחנו אוספים חמישה שדות של נוף במהלך ניסוי. עובר שלב אוטומטית לשדה, אוספת תמונה יחס ועובר על לשדה הבא.
- הגדרת מרווח זמן לשגות לאסוף תמונות בין 0.1 ו - 10 שניות זה מזה בהתאם לסוג של האותות שאתה מצפה לראות.
- התחל את הניסוי.
- כאשר בודקים את מערכת הדמיה סידן לעיתים קרובות כדאי להשתמש גירויים כמו tyrodes אשלגן גבוהה (65 mM KCl) או ionomycin (2μM) אשר יגרום לעלייה סידן תוך תאי פתרון חופשי סידן תאיים אשר (המכיל את מאגרי הסידן כמו EGTA ו BAPTA ) כי תפחית את ריכוז הסידן.
אנליזה
לאחר השלמת הניסוי אתה רוצה להמיר את ערכה של תמונות יחס לתוך זמן לשגות מדידות סידן עבור תאים בודדים או אזורים של עניין בתוך התאים. כדי לעשות זאת:
- השתמש באזור של כלי עניין (ROI) כדי להגדיר את האזורים של התמונה שבה אתה רוצה למדוד סידן. זה בדרך כלל מועיל אחד לפחות ROI המכסה את גוף התא של התא. כאשר הגדרת ROIs, כדאי להפעיל את הסרט של התמונות כדי לוודא שהתאים לא זז במהלך הניסוי.
- השתמש בתוכנה כדי לאסוף את זמן לשגות מדידות יחס ההחזר על ההשקעה עבור כל אחת מהתמונות.
- ייבוא מדידות יחס לתוכנית ניתוח. יהיה עליך להציג את עקבות סידן עבור תאים ספציפיים או ROIs, מספר תאים הממוצע או ROIs להמיר את המדידות היחס אל תאיים ערכי הסידן. אנו משתמשים סדרה של פקודות מאקרו כתוב איגור Pro אשר מאפשרים לנו לעשות את כל המשימות הללו ניתוח שכיח אך תוכניות אחרות כמו Excel, אם כי פחות נוח יכול לשמש גם.
- המשוואה [Ca] = (RR דקות) / (R max-R) SF * Kd ניתן להשתמש כדי להמיר את Fura-2 ערכים יחס אל תאיים ריכוזי הסידן. [Ca] הוא ריכוז הסידן, R הוא Fura-2 340/380 יחס, RMin ו RMax הם 340/380 יחס בהיעדר סידן או בנוכחות ריכוז להרוות של סידן בהתאמה, SF * Kd הוא המוצר של Kd של Fura-2 (כ 120 nM ב RT) וערך דרוג. כדי למדוד R מינימום, R מקס SF Kd * יש צורך לבצע גם in vivo או כיול חוץ גופית. בשנת vivo דורש כיולשילוב של תיקון clamping הדמיה סידן, אשר יכול להיות מסובך, אבל הוא גם מאוד מדויק. ב כיול במבחנה ניתן לעשות זאת באמצעות תוצרת בית קאמרית כיול זה מורכב משני coverslips מופרדות spacer coverslip דק ליצור שכבה דקה של פתרון שבו לבצע את הכיול. הדרך הנוחה ביותר למדידת Fura-2 ערכים יחס כפונקציה של ריכוז סידן היא להשתמש בערכת כיול המכילים מספר רב של פתרונות סידן שנאגרו ו Fura-2 חומצה חופשית. אלו ניתן להשיג Invitrogen (בדיקות מולקולריות) ומכילים הנחיות מדויקות לשימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במצגת זו שעברנו את כל השלבים לביצוע הדמיה סידן באמצעות Fura, 02:00. השתמשנו נוירונים בקליפת המוח כמודל אבל הדמיה סידן ניתן להשתמש כדי למדוד סידן תוך תאי בזמן אמת במגוון רחב של תאים. כאשר עושים את זה הליך חשוב להשתמש coverslips זכוכית במקום פלסטיק, שכן הפלסטיק הוא לעתים קרובות פלורסנט באורכי גל אולטרה סגול, מה שהופך הדמיה קשה. כמו כן, חשוב מעיל טרום coverslips עם polyornithine ו laminin כדי למנוע מתאי ניתוק. לבסוף, חשוב לזכור, כדי למנוע יצירת בועות אוויר כאשר המרוססת פתרונות דרך חדר הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
