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Biology

AM Fura - 2 का उपयोग cortical न्यूरॉन्स की कैल्शियम इमेजिंग

doi: 10.3791/1067 Published: January 19, 2009

Summary

कैल्शियम संकेतों जीन अभिव्यक्ति, अस्तित्व, और भेदभाव सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. यहाँ हम प्रदर्शन कैसे कैल्शियम AM Fura - 2 का उपयोग इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए. कैल्शियम इमेजिंग एक मूल्यवान उपकरण के लिए वास्तविक समय और संकेत cascades की अपनी विनियमन में intracellular कैल्शियम के नियमन का अध्ययन है.

Abstract

कैल्शियम इमेजिंग एक आम तकनीक है कि सभ्य कोशिकाओं में कैल्शियम संकेतों को मापने के लिए उपयोगी है. कैल्शियम इमेजिंग तकनीक कैल्शियम सूचक रंजक, जो BAPTA आधारित जैविक अणुओं है कि सीए 2 + आयनों के बंधन के जवाब में उनके वर्णक्रमीय गुणों में परिवर्तन कर रहे हैं का लाभ ले लो. कैल्शियम सूचक रंगों को दो श्रेणियों, Fura-2 और भारत - 1 और Fluo-4 की तरह एकल तरंगदैर्ध्य रंगों की तरह अनुपात मीट्रिक रंगों में गिर जाते हैं. अनुपात - मीट्रिक रंजक कैल्शियम के जवाब में या तो उनकी उत्तेजना या उनके उत्सर्जन स्पेक्ट्रा बदलने के लिए, अनुमति intracellular कैल्शियम की एकाग्रता प्रतिदीप्ति अलग तरंगदैर्य पर उत्सर्जन या उत्तेजना के अनुपात से निर्धारित किया है. एकल तरंगदैर्ध्य जांच पर अनुपात - मीट्रिक रंगों का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि डाई एकाग्रता, रोशनी की तीव्रता, और अनुमति intracellular कैल्शियम की एकाग्रता इन कलाकृतियों की स्वतंत्र रूप से निर्धारित करने के लिए ऑप्टिकल पथ लंबाई के अनुपात संकेत स्वतंत्र है. सबसे आम कैल्शियम संकेतकों के एक 2-Fura है, जो बाध्यकारी कैल्शियम के जवाब में 505 एनएम उत्सर्जन शिखर और 380 एनएम के लिए 340 एनएम से अपनी उत्तेजना शिखर परिवर्तन है. यहाँ हम Fura-2 का उपयोग करने के लिए न्यूरॉन्स और अन्य उत्तेजनीय कोशिकाओं में intracellular कैल्शियम उन्नयन को मापने का वर्णन.

Protocol

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सेल संस्कृति

कक्ष स्थापित तकनीकों का उपयोग कर उगाया जा सकता है है, लेकिन # 1 गिलास detaching या इमेजिंग प्रयोगों के दौरान बढ़ने से कोशिकाओं को रोकने के लिए एक सेलुलर (polylysine polyornithine, या laminin) की तरह चिपकने वाला के साथ लेपित coverslips पर चढ़ाया होना चाहिए.

समाधान

कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों सेल संस्कृति मीडिया सहित शारीरिक समाधान की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है है. यह महत्वपूर्ण है, तथापि, को यकीन है कि समाधान phenol लाल है, जो बहुत फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि बढ़ जाती है के लिए स्वतंत्र हैं. हम Tyrodes समाधान है जो आसानी से और बना है मस्तिष्कमेरु द्रव mimics, और हम इसे 0.1% गोजातीय albumin सीरम के साथ पूरक का उपयोग करें. हम 60-90 मिमी पोटेशियम क्लोराइड के साथ विध्रुवण का उपयोग करने के लिए वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल और 1μM Thapsigargin (DMSO में 1 मिमी शेयर) या 2μM Ionomycin (DMSO में 1 मिमी शेयर) को सक्रिय करने के लिए दुकान संचालित CRAC चैनलों को सक्रिय. यह अक्सर कोशिकी समाधान को दिखाने के लिए है कि कैल्शियम उन्नयन कैल्शियम बाढ़ की वजह से कर रहे हैं से कैल्शियम हटाने के लिए सुविधाजनक है. जब कैल्शियम हटाने द्विसंयोजक फैटायनों की कुल एकाग्रता (2 मिलीग्राम + और ​​2 Ca +) लगातार. बनाए रखने के लिए आवश्यक है जब सोडियम के लिए पोटेशियम प्रतिस्थापन यह आवश्यक है आसमाटिक संतुलन बनाए रखने के लिए.

Tyrodes समाधान:

कम पोटेशियम 2mm 2 Ca + Tyrodes (मिमी) कम पोटेशियम 0 2 Ca + Tyrodes (मिमी) उच्च पोटेशियम 2mm 2 Ca + Tyrodes (मिमी) उच्च पोटेशियम 0 2 Ca + Tyrodes (मिमी)
NaCl 129 129 5 5
KCl 5 5 129 129
CaCl2 2 0 2 0
MgCl2 1 3 1 3
ग्लूकोज़ 30 30 30 30
Hepes 25 25 25 25

7.4 करने के लिए NaOH साथ पीएच समायोजित

Fura-2 कैल्शियम डाई की लोडिंग

हम साथ कोशिकाओं लोड acetoxy - मिथाइल एस्टर Fura 2 (AM Fura-2), जो कोशिका झिल्ली भर diffuses और सेलुलर esterases द्वारा डी esterified Fura-2 मुक्त एसिड उपज है. Fura-2 लोड करने के लिए सटीक मापदंडों सेल प्रकार भर में व्यापक रूप से भिन्न हैं. 4 सुक्ष्ममापी, 2 घंटे 15 मिनट और कमरे के तापमान पर लोड परीक्षण के समय की एक किस्म के लिए लोडिंग समाधान में incubating कोशिकाओं और हम कई लोडिंग Fura-2 के एक से अधिक सांद्रता 1 से उग्र युक्त समाधान की तैयारी के द्वारा विभिन्न स्थितियों का परीक्षण करने की अनुशंसा 37 डिग्री पर. Cortical न्यूरॉन्स के लिए एक सरल प्रोटोकॉल नीचे दिया जाता है:

  1. सबसे पहले, एक 50μg Invitrogen से उपलब्ध शीशी DMSO के 50μl जोड़कर 1 मिमी Fura-2 शेयर AM तैयार करते हैं. यह सूखी नाइट्रोजन के तहत पैक DMSO का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह आवश्यक है एक सुई के साथ पट puncturing DMSO के जलयोजन को रोकने के द्वारा DMSO के हटाने है. Fura-2 AM समाधान की तैयारी के बाद यह एक अंधेरे सूखी जगह में रखें. Fura-2 DMSO में आरटी पर स्थिर है और 24 घंटे के लिए स्थिर है - कई महीनों के लिए एक सूखी कंटेनर में 20 डिग्री.
  2. विभाज्य 2 एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, 37 डिग्री करने के लिए गर्म में संस्कृति मीडिया के mls. और Fura-2 के 2μl जोड़ने के शेयर AM 1μM Fura-2 AM समाधान उत्पन्न. भंवर 1 मिनट के लिए सख्ती समाधान.
  3. लोड हो रहा है एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान समाधान स्थानांतरण और कोशिकाओं के साथ पकवान में coverslip हस्तांतरण.
  4. एक अंधेरे इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री पर न्यूरॉन्स को सेते हैं. ऊष्मायन ठीक समय है.
  5. Fura-2 AM बिना एक 35 मिमी 2 टिशू कल्चर मीडिया के mls युक्त पकवान तैयार है. लोड हो रहा है और नई डिश में समाधान जगह से coverslip निकालें.
  6. इमेजिंग कक्ष पर coverslip माउंट. 35 मिमी पकवान से coverslip निकालें और तेजी से करने के लिए कक्षों की सुखाने को रोकने के सुनिश्चित करने के चैम्बर पर माउंट. हम एक इमेजिंग वार्नर उपकरण द्वारा निर्मित कक्ष है कि अनुमति देता है एक 10mm नीचे और एक दूसरे के लिए एक सैंडविच बनाने के शीर्ष पर रखा जा coverslip पर रखा जा कोशिकाओं से युक्त coverslip का उपयोग करें. दो coverslips निर्वात चैम्बर के लिए तेल और दो नलियों के साथ कक्ष के दोनों छोर पर सुरक्षित कर रहे हैं कक्ष के माध्यम से समाधान के छिड़काव के लिए अनुमति देते हैं. इनपुट रेखा एक सिरिंज से जुड़ा है और उत्पादन लाइन में एक अच्छी तरह से है कि एक चूषण एक वैक्यूम जाल से जुड़े लाइन द्वारा खाली कर दिया है जुड़ा हुआ है.

खुर्दबीन

हम एक औंधा Nikon ग्रहण TE2000 यू के साथ एक क्सीनन चाप दीपक (Sutter उपकरण), एक स्वचालित मंच (Ludl), एक उत्तेजना फिल्टर पहिया (Ludl), और एक ठंडा प्रभारी जोड़े डिवाइस (सीसीडी) कैमरा (हमामात्सू Orka सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग करें II). खुर्दबीन एक Macintosh कॉम द्वारा नियंत्रित किया जाता हैकंप्यूटर खोलें लैब सॉफ्टवेयर कामचलाऊ व्यवस्था () चल रहा है. कई अन्य सॉफ्टवेयर संकुल ratiometric इमेजिंग के लिए उपलब्ध हैं. इमेजिंग के लिए हम 40, 60 या 100x Nikon एक एनए 1.2 से अधिक के साथ Fluor तेल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग करें.

इमेजिंग प्रोटोकॉल

  1. खुर्दबीन मंच जांचना.
  2. लोड इनपुट देखभाल लेने के लिए हवा के बुलबुले के गठन को रोकने लाइन में समाधान Tyrodes.
  3. छिड़काव और कक्ष के माध्यम से perfuse Tyrodes समाधान लाइनों के लिए चैम्बर एक बार फिर से कनेक्ट करें, देखभाल लेने के लिए कक्ष में बुलबुले के गठन को रोकने के
  4. उद्देश्य पर तेल की एक बूंद प्लेस, खुर्दबीन मंच पर चैम्बर जगह और संचारित प्रकाश का उपयोग कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित.
  5. 340 और 380 एनएम का उपयोग eyepieces पर रोशनी का उपयोग कर कक्षों की जांच प्रतिदीप्ति. आराम कर कोशिकाओं 340 पर मंद और चमकदार 380 पर होना चाहिए. सामान्य में, कोशिकाओं पराबैंगनी प्रकाश के साथ अधिक से अधिक 10 या 15 सेकंड के लिए नहीं प्रबुद्ध हो सकता है और उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता एक तटस्थ घनत्व फिल्टर phototoxicity रोकने के साथ कम किया जाना चाहिए.
  6. कैमरे का उपयोग कर कक्षों की जांच करने और और कैमरे के लाभ और जोखिम निर्धारित करने के लिए एक छवि है कि संतृप्ति (लेकिन नहीं संतृप्त) जब 380 एनएम संतृप्ति जब 340 एनएम प्रबुद्ध अच्छी तरह से नीचे और प्रबुद्ध के लिए करीब है उत्पन्न. यदि संभव हो तो 200ms नीचे जोखिम रखें. एक बार सेट, कैमरा लाभ या जोखिम नहीं बदल जब तक आप पृष्ठभूमि भी बदल करने की योजना है, RMin और rmax (नीचे देखें).
  7. प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में एक छवि ले लीजिए और ब्याज (आरओआई) के लिए स्थानों की एक किस्म में प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए छवियों में पृष्ठभूमि की तीव्रता को मापने के उपकरण के क्षेत्र का उपयोग करें.
  8. औसत पृष्ठभूमि मूल्यों और इमेजिंग प्रोग्राम में उपयुक्त स्थानों में पृष्ठभूमि मान दर्ज करें. पृष्ठभूमि मान क्षेत्र में प्रत्येक पिक्सेल से subtracted हो जाएगा.
  9. एक अभ्यास अनुपात छवि लीजिए और प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए थ्रेसहोल्ड मान को समायोजित करने के लिए अनुपात छवि है कि केवल कोशिकाओं और पृष्ठभूमि नहीं है और है कि कोशिकाओं के किनारों के करीब क्षेत्र में शोर नहीं है उत्पन्न.
  10. न्यूनतम अनुपात मूल्य (RMin) सेट के बारे में 10% क्षेत्र में किसी भी सेल के सबसे कम अनुपात के नीचे है.
  11. Rmax सेट करने के लिए 12 RMin बार के बारे में. RMin या प्रयोगों है कि आप तुलना के रूप में यह तुलना मुश्किल कर देगा की योजना के बीच rmax मत बदलो. हम शायद ही कभी और हमारे इमेजिंग रिग पर RMin rmax मूल्यों बदल जाते हैं.
  12. स्वचालित मंच का उपयोग करें क्षेत्रों है कि आप छवि के लिए योजना को खोजने, और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक फ़ील्ड के स्थान रिकॉर्ड. हम आम तौर पर एक प्रयोग के दौरान देखने के पांच क्षेत्रों इकट्ठा. एक क्षेत्र के लिए स्वचालित मंच चाल, अनुपात छवि इकट्ठा और अगले फ़ील्ड पर करने के लिए कदम.
  13. सेट अंतराल समय चूक 0.1 और 10 सेकंड के बीच छवियों के अलावा संकेत है कि आप देखने की उम्मीद के प्रकार पर निर्भर करता है इकट्ठा.
  14. प्रयोग प्रारंभ.
  15. जब कैल्शियम इमेजिंग प्रणाली का परीक्षण यह अक्सर करने के लिए उच्च पोटेशियम (65 मिमी KCl) tyrodes या ionomycin (2μM) की तरह है कि एक intracellular कैल्शियम वृद्धि और कैल्शियम मुक्त कोशिकी समाधान कारण होगा उत्तेजनाओं का उपयोग उपयोगी है कि (EGTA और BAPTA जैसे कैल्शियम बफ़र्स युक्त ) है कि कैल्शियम एकाग्रता कम हो जाएगा.

विश्लेषण

एक बार प्रयोग पूरा हो गया है आप समय चूक कैल्शियम माप में व्यक्ति या कोशिकाओं के भीतर कोशिकाओं हित के क्षेत्रों के लिए अनुपात छवियों के सेट में परिवर्तित करना चाहते हैं जाएगा. ऐसा करने के लिए:

  1. ब्याज उपकरण (आरओआई) के क्षेत्र का उपयोग करने के लिए छवि है जिसमें आप कैल्शियम को मापने चाहते हैं के क्षेत्रों को परिभाषित. यह आम तौर पर कम से कम एक रॉय है कि सेल का सेल शरीर को शामिल किया गया है के लिए उपयोगी है. जब ROIs परिभाषित, यह फिल्म छवियों की सत्यापित करने के लिए है कि कोशिकाओं के प्रयोग के दौरान कदम नहीं खेलने के लिए उपयोगी है.
  2. सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें प्रत्येक छवि में प्रत्येक रॉय के लिए समय चूक अनुपात माप लेने के लिए.
  3. अनुपात माप एक विश्लेषण प्रोग्राम में आयात करें. आप विशिष्ट कक्षों या ROIs औसत एकाधिक कक्षों या ROIs के लिए कैल्शियम निशान देखने और अनुपात माप कन्वर्ट करने के लिए कैल्शियम मूल्यों intracellular करने की आवश्यकता होगी. हम इगोर प्रो में लिखा मैक्रोज़ है जो हमें करने के लिए इन सभी आम विश्लेषण कार्यों लेकिन Excel जैसे अन्य कार्यक्रमों की अनुमति का एक सेट का उपयोग करें, हालांकि कम सुविधाजनक भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. समीकरण [सीए] = (आरआर मिनट) / (अधिकतम आर आर) एस एफ * केडी Fura-2 अनुपात मूल्यों कन्वर्ट करने के लिए कैल्शियम की सांद्रता intracellular करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. [सीए] कैल्शियम एकाग्रता है, अनुसंधान Fura-2 340/380 अनुपात है, RMin और rmax कैल्शियम के अभाव में या कैल्शियम की एक saturating एकाग्रता की उपस्थिति में 340/380 अनुपात क्रमशः रहे हैं, और एस एफ * केडी है Fura-2 केडी (आरटी पर लगभग 120 एनएम) और एक स्केलिंग मूल्य के उत्पाद. आर मिन, आर मैक्स और एस एफ * यह केडी को मापने के लिए vivo या इन विट्रो अंशांकन में एक में एक भी प्रदर्शन के लिए आवश्यक है. Vivo अंशांकन में की आवश्यकता है एकपैच clamping और कैल्शियम इमेजिंग, जो लेकिन जटिल हो सकता है के संयोजन भी बहुत सटीक है. इन विट्रो अंशांकन में एक घर बना अंशांकन कक्ष है कि दो एक पतली coverslip स्पेसर से अलग समाधान की एक पतली परत में जो अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए उत्पन्न coverslips के होते हैं का उपयोग किया जा सकता है. कैल्शियम की सांद्रता के एक समारोह के रूप में Fura 2 अनुपात मूल्यों को मापने का सबसे आसान तरीका के लिए एक अंशांकन किट का उपयोग करें कि कई कैल्शियम बफर समाधान और Fura 2 मुक्त एसिड होते हैं. ये Invitrogen (आण्विक जांच) से प्राप्त किया जा सकता है और उपयोग के लिए सटीक निर्देश होते हैं.

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Discussion

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इस प्रस्तुति में हम कैल्शियम इमेजिंग प्रदर्शन AM Fura - 2 का उपयोग करने के लिए सभी चरणों के माध्यम से चला गया है. हम एक मॉडल के रूप में cortical न्यूरॉन्स थे, लेकिन कैल्शियम इमेजिंग के लिए वास्तविक समय में कोशिकाओं की एक किस्म में intracellular कैल्शियम को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जब इस प्रक्रिया कर रही यह महत्वपूर्ण है के बजाय प्लास्टिक के गिलास coverslips उपयोग के बाद से प्लास्टिक अक्सर पराबैंगनी तरंगदैर्य, जो इमेजिंग कठिन बना देता है पर फ्लोरोसेंट. इसके अलावा, यह पूर्व कोट polyornithine और laminin के साथ क्रम में detaching से कोशिकाओं को रोकने coverslips के लिए महत्वपूर्ण है. अंत में, यह महत्वपूर्ण है याद करने के लिए हवाई बुलबुले बनाने जब इमेजिंग कक्ष के माध्यम से समाधान perfusing से बचने.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
New Item Fura-2 AM Invitrogen F1221 Protect from light
New Item DMSO Electron Microscopy Sciences MX1457-6 Keep in dry place to prevent hydration
New Item Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A8022-100G Store at 4°
New Item Imaging Chamber Warner Instruments Model RC-20H
New Item Microscope Nikon Instruments Eclipse TE2000-U
New Item Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333-500G
New Item Calibration Kit Molecular Probes, Life Technologies F6774 Protect from light

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References

  1. Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  2. Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
  3. Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
AM Fura - 2 का उपयोग cortical न्यूरॉन्स की कैल्शियम इमेजिंग
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Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067, doi:10.3791/1067 (2009).More

Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067, doi:10.3791/1067 (2009).

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