Summary
Segnali di calcio giocano un ruolo chiave in molti processi cellulari tra cui l'espressione genica, la sopravvivenza e la differenziazione. Qui mostriamo come eseguire l'imaging di calcio con Fura-2 AM. Immagini di calcio è uno strumento prezioso per studiare la regolazione del calcio intracellulare in tempo reale e la sua regolamentazione delle cascate di segnalazione.
Abstract
Immagini di calcio è una tecnica comune che è utile per misurare i segnali di calcio in cellule in coltura. Tecniche di imaging del calcio usufruire di coloranti indicatore di calcio, che sono molecole organiche a base di Bapta che cambiano le loro proprietà spettrali in risposta al legame di ioni Ca2 +. Coloranti indicatore di calcio si dividono in due categorie, rapporto-metrica coloranti come il Fura-2 e Indo-1 e singola lunghezza d'onda coloranti come Fluo-4. Rapporto-metrica coloranti cambiare sia la loro eccitazione o il loro spettri di emissione, in risposta al calcio, permettendo la concentrazione di calcio intracellulare da determinare in base al rapporto di emissione di fluorescenza o eccitazione a lunghezze d'onda diverse. Il principale vantaggio di utilizzare il rapporto-metrico coloranti oltre sonde singola lunghezza d'onda è che il segnale rapporto è indipendente dalla concentrazione di colorante, l'intensità di illuminazione, e la lunghezza del percorso ottico che permette la concentrazione di calcio intracellulare da determinare in modo indipendente di questi manufatti. Uno degli indicatori di calcio più comune è Fura-2, che ha un picco di emissione a 505 nm e cambia il suo picco di eccitazione da 340 nm a 380 nm in risposta al calcio vincolanti. Qui si descrive l'uso di Fura-2 per misurare altezze calcio intracellulare nei neuroni e altre cellule eccitabili.
Protocol
Colture Cellulari
Le cellule possono essere coltivate utilizzando tecniche consolidate, ma deve essere placcato sulla # 1 coprioggetto di vetro spalmato con un adesivo cellulare (come polilisina, polyornithine o laminina) per impedire alle cellule di distacco o in movimento durante gli esperimenti di imaging.
Soluzioni
Esperimenti di imaging del calcio può essere eseguito utilizzando una varietà di soluzioni fisiologiche tra cui terreni di coltura delle cellule. E 'importante, tuttavia, per assicurarsi che le soluzioni sono liberi di rosso fenolo, che aumenta notevolmente lo sfondo fluorescente. Noi usiamo soluzione Tyrodes, che è fatto facilmente e mima liquido cerebrospinale, e lo integrano con il 0,1% di BSA. Noi utilizziamo depolarizzazione con 60-90 mM cloruro di potassio per attivare canali del calcio voltaggio gated e Thapsigargin 1μM (1 magazzino mM in DMSO) o 2μM ionomicina (1 magazzino mM in DMSO) per attivare memorizzare canali delle unità CRAC. Spesso è conveniente togliere il calcio dalla soluzione extracellulare per dimostrare che il calcio elevazioni sono dovuti a influsso di calcio. Quando si rimuove il calcio è necessario mantenere la concentrazione totale dei cationi bivalenti (Mg 2 + e Ca 2 +) costante. Quando si sostituisce potassio per il sodio è necessario per mantenere l'equilibrio osmotico.
Tyrodes soluzioni:
| Basso di potassio 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Basso di potassio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | Alto di potassio 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Alto di potassio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| Glucosio | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
Regolare il pH a 7,4 con NaOH
Caricamento della Fura-2 colorante calcio
Noi celle di carico con acetossi-metil-estere Fura-2 (Fura-2 AM), che diffonde attraverso la membrana cellulare ed è de-esterificato dalle esterasi cellulari per produrre Fura-2 acido libero. I parametri esatti per la Fura-2 carico variano molto tra i tipi di cellule. Si consiglia di provare varie condizioni di carico attraverso la preparazione di soluzioni diverse che contiene una concentrazione più di Fura-2 infuria 1-4 micron, incubando cellule nella soluzione di carico per una serie di tempi da 15 minuti a 2 ore e il carico di prova a temperatura ambiente e a 37 gradi. Un protocollo semplificato per i neuroni corticali è il seguente:
- In primo luogo, preparare il 1 mM Fura-2:00 magazzino con l'aggiunta di 50μl di DMSO ad una fiala 50μg disponibile da Invitrogen. E 'importante utilizzare DMSO secco confezionato sotto azoto ed è necessario rimuovere il DMSO con un ago da puntura del setto per evitare l'idratazione del DMSO. Dopo aver preparato la Fura-2 AM soluzione di conservarlo in un luogo buio e asciutto. Fura-2 AM in DMSO è stabile a temperatura ambiente per 24 ore ed è stabile a - 20 gradi in un contenitore asciutto per diversi mesi.
- Aliquota di 2 ml di terreni di coltura in un tubo da 15 ml, calda a 37 gradi. e aggiungere 2μl di Fura-2:00 magazzino per generare un 1μM Fura-2:00 soluzione. Vortex la soluzione vigorosamente per 1 minuto.
- Trasferire la soluzione di carico per un 35 piatto di coltura di tessuti mm e trasferire il vetrino con le cellule nel piatto.
- Incubare i neuroni a 37 gradi per 30 minuti in un incubatore scuro. Il tempo di incubazione con precisione.
- Preparare un piatto 35 millimetri contenente 2 ml di terreni di coltura tissutale senza Fura-2 AM. Rimuovere il vetrino dalla soluzione di carico e posto nel nuovo piatto.
- Montare il coprioggetto sulla camera di imaging. Rimuovere il vetrino dal piatto 35 mm e rapido montaggio sulla camera avendo cura di evitare l'essiccazione delle cellule. Noi usiamo una camera di imaging prodotto da Warner strumenti che permette ad un coprioggetto 10 millimetri che contiene le cellule da montare sul fondo e un coprioggetto secondo per essere montato sulla parte superiore formando un panino. I due coprioggetto sono assicurate con grasso vuoto alla camera e due tubi alle due estremità della camera consentono di perfusione di soluzioni attraverso la camera. La linea di ingresso è collegato ad una siringa e la linea di uscita è collegato ad un bene che viene svuotato da una linea di aspirazione collegato ad una trappola vuoto.
Il microscopio
Usiamo un invertito Nikon Eclipse TE2000-U microscopio dotato di una lampada ad arco allo xeno (Sutter Instruments), una fase automatica (Ludl), una ruota di eccitazione filtro (Ludl), e un raffreddamento carica paio dispositivo (CCD) della fotocamera (Hamamatsu Orka II). Il microscopio è controllato da un com Macintoshcomputer con software Open Lab (improvvisazione). Diversi altri pacchetti software sono disponibili per l'imaging raziometrico. Per l'imaging che usiamo 40, 60 o 100x Nikon Fluor obiettivi olio da immersione con un NA superiore a 1,2.
Imaging Protocol
- Calibrare la fase microscopio.
- Carico Tyrodes soluzione nella linea di ingresso avendo cura di evitare la formazione di bolle d'aria.
- Collegare la camera alle linee di perfusione e profumato soluzione Tyrodes attraverso la camera, ancora una volta, avendo cura di evitare la formazione di bolle nella camera
- Mettere una goccia di olio sull'obiettivo, posizionare la camera sul palco microscopio e mettere a fuoco le cellule a luce trasmessa.
- Esaminare la fluorescenza delle cellule con illuminazione a 340 ed a 380 nm usando gli oculari. Cellule a riposo dovrebbe essere debole a 340 e luminoso a 380. In generale, le cellule non devono essere illuminati con luce UV per più di 10 o 15 secondi e l'intensità della luce di eccitazione deve essere ridotto con un filtro a densità neutra per evitare fototossicità.
- Esaminare le cellule con la fotocamera e impostare il guadagno e di esposizione della fotocamera per generare un'immagine che è vicino alla saturazione (ma non saturi) quando è illuminato a 380 nm e ben al di sotto saturazione quando è illuminato a 340 nm. Mantenere l'esposizione al di sotto 200ms, se possibile. Una volta impostato, non modificare il guadagno della telecamera o l'esposizione a meno che non si ha intenzione di modificare anche lo sfondo, Rmin e Rmax (vedi sotto).
- Raccogliere un'immagine ad ogni lunghezza d'onda e utilizzare la regione di interesse (ROI), strumento per misurare l'intensità dello sfondo in una varietà di posizioni nelle immagini per ogni lunghezza d'onda.
- Media i valori di fondo e inserire i valori di fondo nelle sedi appropriate nel programma di imaging. Il valore del fondo verrà sottratto da ogni pixel in campo.
- Raccogliere un'immagine rapporto pratica e regolare i valori di soglia per ogni lunghezza d'onda per generare un'immagine rapporto che include solo le cellule e non lo sfondo e che non è rumoroso nella regione vicino ai bordi delle celle.
- Impostare il valore minimo di rapporto (Rmin) da circa il 10% sotto del più basso rapporto tra una cella nel campo.
- Impostare il Rmax a circa 12 volte il Rmin. Non modificare la Rmin o Rmax tra gli esperimenti che si prevede di confrontare quanto renderà il confronto difficile. Noi raramente cambiano i valori e Rmin Rmax sul nostro rig imaging.
- Utilizzare il palco automatizzati per trovare i campi che si prevede di immagine, e registrare la posizione di ogni campo usando il software. In genere raccogliere cinque campi di vista durante un esperimento. Le mosse fase automatizzato a un campo, raccoglie un rapporto immagine e passa al campo successivo.
- Impostare il time-lapse intervallo di raccogliere immagini tra 0,1 e 10 secondi di distanza a seconda del tipo di segnali che si aspetta di vedere.
- Avviare l'esperimento.
- Durante il test di sistema di imaging del calcio è spesso utile usare stimoli come tyrodes potassio alto (65 mM KCl) o ionomicina (2μM) che causerà un aumento intracellulare di calcio e calcio soluzione gratuita extracellulare che (contenente i buffer di calcio come EGTA e Bapta ) che riduce la concentrazione di calcio.
Analisi
Una volta che l'esperimento è completo si desidera convertire l'insieme di immagini in rapporto time-lapse misure di calcio per le singole celle o zone di interesse all'interno delle cellule. Per fare questo:
- Utilizzare la regione di strumento di interesse (ROI) per definire le aree dell'immagine in cui si vuole misurare calcio. In genere è utile avere almeno un ROI che copre il corpo cellulare della cellula. Nella definizione del ROI, è utile per riprodurre il filmato delle immagini per verificare che le cellule non si muovono durante il corso dell'esperimento.
- Utilizzare il software per raccogliere time-lapse misure di rapporto per ogni ROI in ogni immagine.
- Importare le misure rapporto in un programma di analisi. Avrete bisogno di vedere le tracce di calcio per cellule specifiche o ROI, mediamente più celle o ROI e convertire le misure rapporto di valori intracellulari di calcio. Noi utilizziamo un insieme di macro scritte in Igor Pro che ci permettono di fare tutte queste attività di analisi comune, ma altri programmi come Excel, anche se meno conveniente può anche essere usato.
- L'equazione [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd può essere utilizzato per convertire il Fura-2 valori del rapporto per le concentrazioni di calcio intracellulare. [Ca] è la concentrazione di calcio, R è la Fura-2 340/380 rapporto, Rmin e Rmax sono i rapporti di 340/380, in assenza di calcio o in presenza di una concentrazione saturante di calcio, rispettivamente, e Sf * Kd è il prodotto della Kd di Fura-2 (circa 120 nm a RT) e un valore di scala. Per misurare R Min, Max e R Sf * Kd che è necessario eseguire sia un in vivo o in vitro di calibrazione. Nella calibrazione in vivo richiede uncombinazione di patch di bloccaggio e di imaging di calcio, che può essere complicato, ma è anche molto preciso. Nella calibrazione in vitro può essere fatto utilizzando una fatta in casa camera di calibrazione che consiste di due lamelle separate da un distanziatore coprioggetto sottile per generare un sottile strato di soluzione in cui eseguire la calibrazione. Il modo più comodo per misurare Fura-2 valori del rapporto in funzione delle concentrazioni di calcio è quello di utilizzare un kit di calibrazione che contengono molteplici soluzioni di calcio tamponato e Fura-2 acido libero. Questi possono essere ottenuti da Invitrogen (Molecular Probes) e contengono precise istruzioni per l'uso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questa presentazione abbiamo superato tutti i passaggi per eseguire l'imaging di calcio con Fura-2 AM. Abbiamo utilizzato i neuroni corticali come modello, ma di imaging calcio può essere utilizzato per misurare intracellulari di calcio in tempo reale in una varietà di cellule. Nel fare questa procedura è importante utilizzare coprioggetto di vetro al posto della plastica, dal momento che la plastica è spesso fluorescente a lunghezze d'onda ultraviolette, il che rende difficile l'imaging. Inoltre, è importante pre-coat i coprioggetti con polyornithine e laminina al fine di impedire alle cellule di distacco. Infine, è importante ricordarsi di evitare la creazione di bolle d'aria quando perfusione soluzioni attraverso la camera di imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
