Summary
カルシウムの信号は、遺伝子発現、生存と分化を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。ここでは、フラ-2回答を使用して、カルシウムのイメージングを実行する方法を示します。カルシウムイメージングでは、リアルタイムとシグナル伝達カスケードの調節における細胞内カルシウムの調節を研究する貴重なツールです。
Abstract
カルシウムイメージングでは、培養細胞でのカルシウム信号を測定するための有用な一般的な手法です。カルシウムイメージング技術は、Ca2 +イオンの結合に応答してそれらのスペクトル特性を変更するBAPTA系有機分子であるカルシウム指示薬染料、を活用する。カルシウム指示薬染料は、二つのカテゴリーにレシオメトリックフラ-2のような染料とインド- 1とみたFluo - 4のような単一波長の色素を落ちる。レシオメトリック色素は、細胞内カルシウムの濃度が異なる波長で蛍光発光または励起の比から決定できるように、カルシウムに反応して励起またはそれらの発光スペクトルのいずれかを変更する。単一波長のプローブを介してレシオメトリック染料を使用する主な利点は、比の信号が色素濃度、照度、および独立してこれらのアーティファクトの決定する細胞内カルシウムの濃度を可能にする光路長に依存しないということです。最も一般的なカルシウムの指標の一つは、結合カルシウムに反応して発光505 nmにピークと380nmへの変更は340 nmからの励起ピークを有するフラ-2、です。ここでは、ニューロンや他の興奮性細胞の細胞内カルシウムの上昇を測定するためのフラ-2の使用について説明します。
Protocol
細胞の文化
細胞は、確立された技術を用いて成長させることができるが、画像の実験中に分離または移動から細胞を防止するために、細胞接着剤（ポリリジン、ポリオルニチンまたはラミニンのような）でコーティングされた第1ガラス製カバースリップ上に播種する必要があります。
ソリューション
カルシウムイメージング実験は、細胞培養培地を含む生理学的な様々なソリューションを使用して実行できます。それは、ソリューションが大幅に蛍光バックグラウンドを増加させるフェノールレッド、のないことを確認するために、しかし、重要です。我々は簡単に作られ、脳脊髄液を模倣し、我々はアルブミン0.1％ウシ血清でそれを補完さTyrodesのソリューションを、使用してください。私たちは、店舗運営CRACチャネルをアクティブにするには電位依存性カルシウムチャネルと1μMタプシガルギン（DMSO中の1mMストック）または2μmのイオノマイシン（DMSO中の1mMストック）を有効にするには60〜90 mMの塩化カリウムを脱分極を使用してください。それはカルシウムの上昇がカルシウムの流入が原因であることを示すため、細胞外液からカルシウムを除去すると便利です。カルシウムを除去する際には、二価陽イオンの総濃度は、（Mg 2 +及びCa 2 +）の定数を維持するために必要です。ナトリウムに対してカリウムを置換する場合には、浸透圧の平衡を維持するために必要です。
Tyrodesソリューション：
| 低カリウム2mMのCa 2 +のTyrodes（MM） | 低カリウム0のCa 2 + Tyrodes（MM） | 高カリウム2mMのCa 2 +のTyrodes（MM） | 高カリウム0のCa 2 + Tyrodes（MM） | |
| NaClの | 129 | 129 | 5 | 5 |
| 塩化カリウム | 5 | 5 | 129 | 129 |
| 塩化カルシウム | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2を | 1 | 3 | 1 | 3 |
| グルコース | 30 | 30 | 30 | 30 |
| HEPES | 25 | 25 | 25 | 25 |
NaOHで7.4にpHを調整する
フラ-2カルシウム色素のロード
我々は、細胞膜を横切って拡散し、フラ-2遊離酸を得るために、細胞エステラーゼにより脱エステル化されているアセトキシ-メチル-エステルフラ-2（フラ-2 AM）、細胞をロードする。フラ-2荷重の正確なパラメータは、細胞の種類によって大きく異なります。 15分から2時間まで時間の様々なローディング溶液中で4μM、インキュベート細胞を、室温で負荷をテストし、 - 私達は1から荒れ狂うフラ-2の複数の濃度を含むいくつかのローディング溶液を調製することにより、様々な条件をテストすることをお勧めします37℃で。皮質ニューロンの簡略化したプロトコルを以下に示します。
- 最初に、Invitrogen社から入手可能な50μgバイアルにDMSO50μlのを追加することによって、フラ-2は在庫午前1 mMのを準備。それは、窒素下でパックされた乾燥DMSOを使用することが重要であり、それはDMSOの水和を防ぐため、隔壁に穴を開けることによって針でDMSOを除去する必要がある。フラ-2 AM溶液を調製した後、暗い乾燥した場所に保管してください。フラ-2は、DMSOで午前24時間室温で安定であり、で安定している - 数ヶ月間乾燥した容器に20度。
- 37℃の暖かい15 mlコニカルチューブ、内培養液のアリコートを2 MLS。とフラ-2の2μlのを追加するには、フラ-2は、ソリューションの午前1μMを生成するために株式思います。 1分間激しくボルテックスするソリューション。
- 35mmの組織培養皿にローディング溶液を移し、皿に細胞をカバースリップを転送する。
- 暗いインキュベーター内で30分間37℃で神経細胞をインキュベートする。正確に時間インキュベーションを。
- フラ-2午前なく、組織培養培地の2 MLSを含む、35 mmディッシュを準備します。新しい料理のロードソリューションと位置からカバーを取り外します。
- イメージングチャンバー上にカバースリップをマウントします。 35mmの皿からカバーを取り外して、急速に細胞の乾燥を防ぐために、確実にチャンバーに取り付けます。我々は、底とサンドイッチを形成する上にマウントされる2番目のカバースリップ上にマウントされる細胞を含む10ミリメートルカバースリップを許可するワーナーインスツルメンツ製イメージングチャンバーを使用してください。 twoカバースリップは、チャンバを介してソリューションの灌流を可能にするチャンバーの両端に真空チャンバーへのグリースと2つのチューブで固定されています。入力行は、注射器に接続され、出力ラインは、真空トラップに接続されている吸引ラインで空にウェルに接続されている。
顕微鏡
我々は、キセノンアークランプ（サッタインスツルメンツ）、自動化された段階（Ludl）、励起フィルターホイール（Ludl）、および冷却電荷結合素子（CCD）カメラ（浜松Orkaを装備した倒立ニコンエクリプスTE2000 - U顕微鏡を使用してII）。顕微鏡は、MacintoshのCOMによって制御されます。オープンラボのソフトウェア（即興）を実行しているコンピューター。いくつかの他のソフトウェアパッケージは、レシオメトリックイメージング可能です。イメージングのために我々は1.2を超えるNAで40、60または100倍ニコンフルーアの油浸の目標を使用してください。
イメージングプロトコル
- 顕微鏡ステージのキャリブレーションを行います。
- 気泡の形成を防ぐために注意して入力ラインにTyrodesソリューションを読み込みます。
- チャンバー内の気泡の形成を防ぐために注意しながら、再びチャンバーを介して灌流ラインと浸み込ませるのTyrodesソリューションにチャンバーを接続する
- 客観的に油の滴を置き、顕微鏡のステージ上のチャンバーを配置し、透過光を用いて細胞に焦点を当てる。
- 340と接眼レンズを使用して380nmでの照明を用いて細胞の蛍光を調べる。休止細胞は380で340で薄暗いと明るいはずです。一般的に、細胞は10以上または15秒間UV光を照射してはならないと励起光の強度は、光毒性を防止するためのフィルタ中立密度を減らす必要があります。
- カメラを用いて細胞を調べますし、340nmで照射したときに380nmで、よく飽和の下に照射したときに（ただし飽和ではない）飽和状態に近い画像を生成するためにカメラのゲインと露出を設定します。可能であれば200msの下に露出してください。また、背景を変更する予定がない限り一度設定、カメラのゲインや露出を変更しない、RMINとrmaxは（下記参照）。
- 各波長での画像を収集し、各波長の画像にさまざまな場所でバックグラウンドの強度を測定するために関心領域（ROIの）ツールを使用してください。
- 平均バックグラウンド値を、イメージングプログラムの適切な場所にバックグラウンドの値を入力します。バックグラウンドの値は、フィールド内の各画素から減算されます。
- 練習の比率の画像を収集し、細胞のみではなく、background、それがセルの端に近い領域でノイズはないが含まれている比率の画像を生成するために、各波長のしきい値を調整します。
- フィールド内の任意のセルの最小の比より10％程度と最小の比の値（RMIN）を設定します。
- 約12倍RMINにRmaxを設定します。あなたはそれが比較が困難になるように比較することを計画している実験の間にRMINまたはRmaxを変更しないでください。我々はほとんど私たちのイメージングリグ上RMINとRmaxの値を変更しません。
- あなたがイメージする予定のフィールドを見つけるために、自動ステージを使用して、ソフトウェアを使用して各フィールドの位置を記録。我々は一般的に実験時のビューの5つのフィールドを収集する。フィールドへの自動ステージの移動は、比率の画像を収集し、次のフィールドに移ります。
- 離れてあなたが見ることを期待している信号の種類に応じて0.1〜10秒間画像を収集するためにタイムラプス間隔を設定します。
- 実験を開始します。
- カルシウムイメージングシステムをテストする際にはなります（EGTAとBAPTAのようなカルシウムのバッファを含む細胞内カルシウムの上昇とカルシウム遊離細胞外溶液の原因となる高カリウムtyrodesのような刺激（65 mMの塩化カリウム）またはイオノマイシン（約2μm）を使用すると便利です。 ）それは、カルシウム濃度が低下します。
分析
一度の実験では、細胞内の個々のセルまたは関心の領域に対しては、時間経過のカルシウムの測定に比イメージのセットを変換したいと完了です。これを行うには：
- あなたがカルシウムを測定したい画像の領域を定義するために興味ツール（ROI）の領域を使用します。それは細胞の細胞体をカバーする少なくとも一つのROIを持つことが一般的に便利です。 ROIを定義するとき、それは細胞が実験の過程で移動していないことを確認するために画像のムービーを再生するのに便利です。
- 各画像の各ROIのためタイムラプス比の測定値を収集するソフトウェアを使用してください。
- 解析プログラムに比測定をインポートします。あなたは、特定の細胞やROIを、平均的な複数のセルまたはROIのためのカルシウムのトレースを表示し、カルシウム値を細胞内に比測定を変換する必要があります。あまり便利でも使用できるけれどもWeは、私たちはすべてのこれらの一般的な分析作業が、Excelなどの他のプログラムを実行できるようイゴールプロで記述されたマクロのセットを使用します。
- 方程式は、[CA] =（RR 分 ）/（R MAX - R）SF * Kdはカルシウム濃度を細胞内にフラ-2比の値を変換するために使用することができます。 [カルシウム]カルシウム濃度は、Rは、フラ-2 380分の340の比であり、RMINと面粗さはそれぞれ、カルシウムの存在下でまたはカルシウムの飽和濃度の存在下で380分の340の比率であり、そしてSfは* Kdはですフラ-2のKd（室温で約120 nM）およびスケーリング値の積。 R 最小 、R マックスとSF * Kdを測定するためには、in vitroでのキャリブレーションのin vivoまたはいずれかで行う必要がある。 in vivoでのキャリブレーションに必要です。複雑なことができますが、パッチクランプやカルシウムイメージング、の組み合わせも非常に正確です。 in vitroでのキャリブレーションではキャリブレーションを実行するためのソリューションの薄層を生成するために薄いカバーガラスのスペーサーで区切られた二つのカバーガラスで構成される自家製のキャリブレーションチャンバーを使用して行うことができます。カルシウム濃度の関数としてフラ-2の比の値を測定するのが最も便利な方法は、複数のバッファカルシウムソリューションとフラ-2遊離酸が含まれている校正キットを使用することです。これらは、Invitrogen（Molecular Probes社）から入手し、使用のための的確な指示を含めることができます。
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Discussion
このプレゼンテーションでは、AMフラ-2を使用してカルシウムのイメージングを行うためのすべてのステップを経てきました。我々はモデルとして皮質ニューロンを用い、カルシウムイメージングは、細胞の様々なリアルタイムで細胞内のカルシウムを測定するために使用することができます。この手順を行う際にはプラスチックが多くの場合、イメージングが困難に紫外波長、少なくとも蛍光灯なので、代わりにプラスチックのカバーガラスを使用することが重要です。また、それは切り離すことは、細胞を防止するために、ポリオルニチンとラミニンでプレコートカバースリップに重要です。最後に、画像処理チャンバーを通してソリューションを灌流するとき、気泡の発生を防ぐために、覚えておくことが重要です。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
