Summary
칼슘 신호는 유전자 발현, 생존과 분화 등 많은 세포 과정에 중요한 역할을한다. 여기 Fura - 2 오전 사용하여 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 이미징은 실시간 신호 폭포 자사의 규제에 세포 내 칼슘의 규정을 연구하기위한 귀중한 도구입니다.
Abstract
칼슘 이미징은 교양 세포의 칼슘 신호를 측정하는 데 유용합니다 일반적인 기법입니다. 칼슘 이미징 기술은 Ca2 + 이온의 바인딩에 대한 응답으로 자신의 분광 특성을 변경 BAPTA 기반 유기 분자 칼슘 지표 염료의 활용. 칼슘 표시기 염료는 두 가지 범주, Fura - 2 및 인도 1 Fluo - 4와 같은 단일 파장 염료와 같은 비율 - 통계 염료에 빠지다. 비율 - 통계 염료는 세포 내 칼슘의 농도가 서로 다른 파장의 형광 방출이나 여기의 비율에서 결정 수 있도록, 칼슘에 대한 응답으로 자신의 여기 또는 발광 스펙트럼 중 하나를 변경합니다. 단일 파장 프로브를 통해 비율 - 통계 염료를 사용하여의 주요 장점은 비율 신호가 염료 농도, 조도, 그리고 세포 내 칼슘의 농도가 독립적으로 이러한 유물을 결정 수 있도록 광학 경로 길이의 독립적이다. 가장 일반적인 칼슘 지표 중 하나는 바인딩 칼슘에 대한 응답으로 방출 505 NM에서 피크와 380 nm의 변경 사항 340 nm의 여기에서 그 피크가 Fura - 2입니다. 여기 우리는 뉴런과 다른 고르기 세포의 세포내 칼슘 고도를 측정하는 Fura - 2의 사용을 설명합니다.
Protocol
세포 배양
전지는 기존 기술을 사용하여 성장 수 있지만 이미징 실험을하는 동안 분리 또는 이동에서 세포를 방지하기 위해 세포 접착제 (polylysine, polyornithine 또는 laminin과 같은)과 코팅 # 1 유리 coverslips에 도금해야합니다.
솔루션
칼슘 이미징 실험은 세포 배양 매체를 포함하여 생리 솔루션의 다양한 사용하여 수행할 수 있습니다. 이것은 솔루션이 크게 형광 배경을 증가 페놀 레드, 무료되었는지 확인하기 위해, 그러나, 중요합니다. 우리가 쉽게 만들어 뇌척수를 모방하고, 우리가 알부민 0.1 % 소 혈청 그것을 보충합니다 Tyrodes 솔루션을 사용합니다. 우리는 가게 운영 CRAC 채널을 활성화하기 위해 전압 게이 티드 칼슘 채널과 1μM Thapsigargin (DMSO 1 MM 재고) 또는 2μM Ionomycin (DMSO 1 MM 주식)을 활성화 60-90 MM 염화칼륨과 탈분극을 사용합니다. 그것은 칼슘 고도는 칼슘 유입에 의한 것을 표시하는 세포외 용액에서 칼슘을 제거하는 것이 편리합니다. 칼슘을 제거하면 그것은 이가의 양이온의 총 농도 (MG 2 + 및 CA 2 +) 상수.을 유지하기 위해 필요합니다 나트륨에 대한 칼륨을 대체하면 그것은 삼투 균형을 유지하기 위해 필요합니다.
Tyrodes 솔루션 :
| 낮은 칼륨 2mM 칼슘 2 + Tyrodes (㎜) | 낮은 칼륨 0 칼슘 2 + Tyrodes (㎜) | 높은 칼륨 2mM 칼슘 2 + Tyrodes (㎜) | 높은 칼륨 0 칼슘 2 + Tyrodes (㎜) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| 포도당 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
NaOH와 7.4으로 산도를 조정
Fura - 2 칼슘 염료의 로딩
우리와 함께 세포를로드 acetoxy - 메틸 에스테르 Fura - 2 세포막에 걸쳐 diffuses 및 Fura - 2 무료 산성을 나타낼 세포 esterases로 드 esterified입니다 (Fura - 2 AM). Fura - 2 로딩에 대한 정확한 매개 변수는 세포 종류에 걸쳐 광범위하게 다릅니다. 4 μm의 15 2 시간 분 실온에서로드 테스트에서 시대의 다양한 로딩 솔루션 세포를 잠복기하고 - 우리는 1에서 성난 Fura - 2의 여러 농도를 포함하는 여러 로딩 솔루션을 준비하여 다양한 조건을 테스트하는 것이 좋습니다 37 데그에서. 대뇌 피질의 뉴런에 단순 프로토콜은 아래 주어집니다 :
- 첫째, Invitrogen에서 사용할 수 50μg 유리병에 DMSO의 50μl를 추가하여 Fura - 2 AM 재고가 1 ㎜를 준비합니다. 그것을 질소하에 포장 건조 DMSO를 사용하는 것이 중요하고 그것은 DMSO의 수화을 방지하기 위해 심장을 펑쳐링하여 바늘로 DMSO를 제거하는 것이 필요합니다. 준비 후 Fura - 2 오전 솔루션은 어두운 건조한 장소에 보관하십시오. Fura - 2는 24 시간 동안 RT에서 DMSO에 안정 오전에 안정 - 몇 개월 동안 건조한 용기에 20도.
- 37 데그에 따뜻한 15 ML 원뿔 튜브로 문화 미디어 나누어지는 두 MLS. 및 Fura - 2의 2μl을 추가 Fura - 2 AM 솔루션 1μM를 생성 재고입니다. 1 분 적극적으로 소용돌이 솔루션입니다.
- 35mm 조직 문화 요리에 로딩 솔루션을 전송하고 접시에 세포로 coverslip을 전송.
- 어두운 인큐베이터에서 30 분 동안 37도에서 뉴런을 품어. 부화 정확하게 시간.
- Fura - 2 AM없이 조직 문화 미디어 2 MLS를 포함하는 35mm 요리를 준비합니다. 새 접시에 로딩 솔루션과 장소에서 coverslip을 제거합니다.
- 이미징 챔버에 coverslip를 탑재합니다. 35mm 요리에서 coverslip을 제거하고 빠르게 세포의 건조를 방지해야하는 챔버에 탑재합니다. 우리는 아래와 샌드위치를 형성 상단에 장착하는 두 번째 coverslip에 장착할 수있는 세포를 포함하는 10mm coverslip을 허용 워너 계측기 제조 이미징 챔버를 사용합니다. 두 coverslips은 챔버를 통해 솔루션의 재관류를 허용 챔버의 양쪽 끝에 진공 챔버에 기름 두 튜브를 확보하고 있습니다. 입력 라인은 주사기에 연결하고 출력 라인은 진공 트랩에 연결된 흡입 라인에 의해납니다 잘 연결되어 있습니다.
현미경
우리는 크세논 아크 램프 (셔터 인 스트 루먼트), 자동 무대 (Ludl), 여기 필터 휠 (Ludl) 및 냉각 비용 - 부부 장치 (CCD) 카메라 (하마 마츠 Orka 갖춘 거꾸로 니콘 이클립스 TE2000 - U 현미경을 사용하여 II). 현미경은 매킨토시 COM에 의해 제어됩니다퓨터 열기 랩 소프트웨어 (순발력)를 실행. 여러 다른 소프트웨어 패키지 ratiometric 이미징 사용할 수 있습니다. 영상을 위해 40, 60 또는 NA가 1.2를 초과와 100x 니콘 플루어 오일 침지 목표를 사용합니다.
이미징 프로토콜
- 현미경의 무대를 보정합니다.
- 부하는 공기 거품의 형성을 방지하기 위해 돌보는 입력 라인에 솔루션을 Tyrodes.
- 챔버에있는 거품의 형성을 방지하기 위해 간병, 다시 한 번 챔버를 통해 재관류 라인과 perfuse의 Tyrodes 솔루션에 챔버를 연결
- 목적에 기름 한 방울 장소 현미경 단계에 챔버를 배치하고 전달 빛을 사용하여 세포에 중점을두고 있습니다.
- 340에서와 eyepieces를 사용하여 380 nm의에서 조명을 사용하여 세포의 형광을 검사합니다. 휴식 세포는 380에서 340에 희미 밝은해야합니다. 일반적으로 세포는 10 개 이상 또는 15 초 동안 자외선과 켜지지하지 않아야하며 여기 빛의 강도는 phototoxicity을 방지하기 위해 필터 중립적인 밀도 감소한다.
- 카메라를 사용하여 세포를 검사하고 잘 340 nm의에서 조명 채도 아래 380 nm의에서 조명 및 채도 (하지만 포화되지 않음)에 가까운 이미지를 생성하는 카메라의 이득과 노출을 설정합니다. 가능하면 200ms 아래의 노출을 유지. 당신은 또한 배경을 변경하지 않는 한 번만 설정할 계획, 카메라 게인이나 노출을 변경하지 마십시오, RMin 및 RMax (아래 참조).
- 각 파장에서 이미지를 수집하고 각 파장에 대한 이미지에 위치 다양한 배경의 강도를 측정하기 관심 (ROI) 도구의 영역을 사용합니다.
- 평균 배경 값과 이미징 프로그램의 적절한 위치에 배경 값을 입력합니다. 배경 값이 분야에서 각 픽셀에서 빼는 것입니다.
- 연습 비율 이미지를 수집하고 오직 세포 아니라 배경과 그 세포의 가장자리에 가까운 지역에 소음되지 않습니다을 포함하는 비율 이미지를 생성하여 각 파장에 대한 경계 값을 조정합니다.
- 10 % 현장의 모든 세포의 가장 낮은 비율 아래로 최소 비율 값 (RMin)을 설정합니다.
- 12 회 RMin에 대해되도록 RMax을 설정합니다. 당신이 비교가 어렵게되므로 비교하는 실험 계획 간의 RMin 또는 RMax을 변경하지 마십시오. 우리는 거의 우리의 이미징 장비에 RMin 및 Rmax 값을 변경하지 않습니다.
- 이 이미지를하려는 필드를 찾기 위해 자동으로 단계를 사용하여 소프트웨어를 사용하여 각 필드의 위치를 기록합니다. 우리는 일반적으로 실험 도중 볼 다섯 분야를 수집합니다. 필드에 자동으로 무대의 움직임은 비율 이미지를 수집하고 다음 필드로 이동합니다.
- 떨어져 보는 기대되는 신호의 종류에 따라 0.1 10 초 사이에 이미지를 수집하기 위해 시간 경과 간격을 설정합니다.
- 실험을 시작합니다.
- 칼슘 이미징 시스템을 테스트를 할 때 그것은 세포내 칼슘 증가와 칼슘을 무료로 세포 솔루션을 일으킬 것입니다 높은 칼륨의 tyrodes (65 MM KCl) 또는 ionomycin (2μM)과 같은 자극을 사용하는 것이 유용입니다 (EGTA 및 BAPTA 같은 칼슘 버퍼를 포함하는 것입니다 ) 그것은 칼슘 농도를 줄일 수 있습니다.
분석
일단 실험은 세포 내의 개별 셀 또는 관심있는 지역에 대한 시간 저속 칼슘 측정에 비율 이미지의 집합을 변환하는 것이 좋습니다 완료됩니다. 이 작업을 수행하려면 :
- 당신은 칼슘을 측정하고자하는 이미지의 영역을 정의에 관심이 도구 (ROI)의 영역을 사용합니다. 그것은 세포의 세포 시체를 포함 적어도 한 투자 수익 (ROI)을 가지고 일반적으로 유용합니다. 로아을 정의할 때, 그것은 세포 실험의 과정 중에 이동하지 않도록 확인하는 이미지의 동영상을 재생하는 데 유용합니다.
- 각 이미지의 각 투자 수익 (ROI) 시간 - 저속 비율 측정을 수집하는 소프트웨어를 사용합니다.
- 분석 프로그램에 비율 측정을 가져옵니다. 당신은 특정 세포 또는 로아, 평균 다중 셀 또는 로아에 대한 칼슘 성분을 확인하고 칼슘 가치를 세포에 대한 비율 측정을 변환해야합니다. 이하 편리도 사용할 수 있지만 우리는, 우리 모두가 이러한 일반적인 분석 작업을하지만, Excel과 같은 다른 프로그램을 수행할 수 있습니다 이고르 프로로 작성된 매크로의 집합을 사용합니다.
- 방정식 [칼슘] = (RR 분) / (R 최대 - R) SF * KD는 칼슘 농도를 세포에 Fura - 2 비율로 값을 변환하는 데 사용할 수 있습니다. [칼슘] 칼슘 농도는, R은 Fura - 2 380분의 340의 비율이며, RMin 및 RMax는 각각 칼슘의 부재 또는 칼슘의 포화 농도의 존재에 380분의 340 비율되며 그리고 SF * KD입니다 Fura - 2의 KD (RT에서 약 120 nm의)과 스케일링 값의 제품입니다. R 분, R 맥스와 SF * KD을 측정하려면 체외 교정의 생체내 또는에서 중 수행하는 것이 필요합니다. 생체내 교정에 필요한복잡하지만 수있는 패치 클램핑 및 칼슘 이미징의 결합도 매우 정확합니다. 관내 교정에서 교정을 수행하기 위해있는 솔루션의 얇은 레이어를 생성하는 얇은 coverslip 스페이서로 구분이 coverslips 구성된 집에서 만든 교정 챔버를 사용하여 수행할 수 있습니다. 칼슘 농도의 함수로 Fura - 2 비율 값을 측정하는 가장 편리한 방법은 여러 개의 버퍼 칼슘 솔루션 및 Fura - 2 무료 산성을 포함 교정 키트를 사용하는 것입니다. 이들은 Invitrogen (분자 프로브)에서 얻은 및 사용에 대한 정확한 지침을 포함할 수 있습니다.
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Discussion
이 프레 젠 테이션에서 우리는 AM Fura - 2를 사용하여 칼슘 이미징을 수행하는 모든 단계를 통과했습니다. 우리는 모델로 대뇌 피질의 뉴런을 사용하지만, 칼슘 이미징은 세포의 다양한 실시간으로 세포 내 칼슘을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 플라스틱 종종 영상이 어려운하게 자외선 파장에서 형광 있기 때문에, 대신에 플라스틱 유리 coverslips를 사용하는 것이 중요합니다. 또한, polyornithine 및 laminin과 coverslips 분리로부터 세포를 방지하기 위해 사전에 코팅하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 이미징 챔버를 통해 솔루션을 perfusing 때 공기 방울을 만드는 피하기 위해 기억하는 것이 중요합니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
