Summary
Кальций сигналы играют ключевую роль во многих клеточных процессах, включая экспрессию генов, выживание и дифференцирование. Здесь показано, как выполнить кальция визуализации с использованием Фура-2 AM. Кальций изображений является ценным инструментом для изучения регуляции внутриклеточного кальция в режиме реального времени и его регуляции сигнальных каскадов.
Abstract
Кальций визуализации распространенный прием, который используется для измерения кальция сигналов в культуре клеток. Кальций методы визуализации воспользоваться кальция индикатор красители, которые BAPTA основе органических молекул, которые изменяют их спектральные свойства в ответ на связывание ионов Са2 +. Красителей кальция индикатор делятся на две категории, отношение-метрики красители, как Фура-2 и индо-1 и одной длины волны красители, как Fluo-4. Отношение-метрики красителей изменить либо их возбуждения или их спектров излучения в ответ на кальций, позволяя концентрации внутриклеточного кальция, чтобы быть определена из соотношения флуоресценции выбросов или возбуждения при различных длинах волн. Главным преимуществом использования соотношение метрике красителей по одной длине волны зондов является то, что отношение сигнал не зависит от концентрации красителя, интенсивности освещения, а длина оптического пути позволяющий концентрации внутриклеточного кальция, которые будут определены независимо от этих артефактов. Одним из наиболее общих показателей кальция Fura-2, который имеет выбросов пик при 505 нм и изменения ее возбуждения пик от 340 нм до 380 нм в ответ на кальций обязательными. Здесь мы опишем использование Фура-2 для измерения внутриклеточного кальция высот в нейронах и других возбудимых клеток.
Protocol
Культуре клеток
Клетки могут быть выращены с использованием установленных методов, но должны быть покрыты на # 1 стакан покровные покрыта сотовой клея (как полилизином, polyornithine или ламинин), чтобы предотвратить клетки от отключения или перемещения во время съемки экспериментов.
Решения
Эксперименты Кальций изображений можно выполнить с помощью различных физиологических растворов, включая средства массовой информации культуре клеток. Важно, однако, чтобы убедиться, что решение не содержит фенол красный, что значительно увеличивает флуоресцентного фона. Мы используем Tyrodes решение, которое легко сделать и имитирует спинномозговой жидкости, и мы дополним его с 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Мы используем деполяризации с 60-90 мМ хлористого калия для активации напряжения закрытого кальциевых каналов и 1 мкм Thapsigargin (1 мМ акции в ДМСО) или 2 мкм иономицина (1 мМ акции в ДМСО), чтобы активировать магазине работает CRAC каналов. Часто бывает удобно для удаления кальция из внеклеточного решение, чтобы показать, что кальций высоте связаны с притоком кальция. При удалении кальция необходимо для поддержания полной концентрации двухвалентных катионов (Mg 2 + и Са 2 +) постоянной. При замене калия для натрия необходимо для поддержания осмотического равновесия.
Tyrodes решения:
| Низкий Калий 2 мМ Са 2 + Tyrodes (мМ) | Низкий Калий 0 Са 2 + Tyrodes (мМ) | Высокая Калий 2 мМ Са 2 + Tyrodes (мМ) | Высокая Калий 0 Са 2 + Tyrodes (мМ) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| Глюкоза | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
Отрегулируйте рН до 7,4 с NaOH
Загрузка Фура-2 кальция красителя
Мы загружаем клеток с ацетокси-метил-эфиром Фура-2 (Фура-2 AM), который диффундирует через клеточную мембрану и де-этерифицированные сотовой эстераз уступить Фура-2 свободной кислоты. Точные параметры для Фура-2 загрузки отличаются друг от друга через клеточные типы. Мы рекомендуем проверить различные условия, подготовив несколько решений, содержащих загрузки нескольких концентрациях Фура-2 бушует от 1 - 4 мкм, инкубации клеток в загрузке решение для различных времен от 15 минут до 2 часов и тестирование нагрузки при комнатной температуре и при 37 град. Упрощенный протокол для нейронов коры, приведен ниже:
- Во-первых, подготовить 1 мМ Фура-2 утра акции путем добавления 50 мкл ДМСО в 50 мкг флакон можно получить Invitrogen. Важно использовать сухие ДМСО упакован в атмосфере азота и его необходимо удалить ДМСО с иглы прокола перегородки для предотвращения гидратации ДМСО. После подготовки Фура-2 утра решение держать его в темном сухом месте. Фура-2 утра в ДМСО стабилен при комнатной температуре в течение 24 часов и стабилен при - 20 градусов в сухом контейнере в течение нескольких месяцев.
- Алиготе 2 мл культуральной среды в 15 мл коническую трубку, теплую до 37 град. и добавить 2μl из Фура-2 утра акции для получения 1 мкм Фура-2 утра решение. Вихревые решения энергично в течение 1 минуты.
- Передача загрузки решение 35 блюдо культуры тканей мм и передачи с покровным клеток в блюдо.
- Инкубируйте нейронов при температуре 37 градусов в течение 30 минут в темном инкубаторе. Время инкубации точно.
- Подготовка 35 мм блюдо, содержащий 2 мл среды культуры ткани без Фура-2 AM. Удалить покровное от загрузки раствором и поместите в новое блюдо.
- Горы покровное на изображение камеры. Удалить покровное от 35 мм блюдо и быстро монтировать на камеру убедившись, что для предотвращения высыхания клеток. Мы используем изображения камеры производства Warner инструмент, который позволяет 10мм покровное содержащей ячейки, которые будут установлены на дне и вторым покровным для установки на верхней формирования бутерброд. Два покровных обеспечены вакуумной смазкой для камеры и две трубки с обоих концов камеры позволяют перфузии растворов через камеру. Вход линии подключается к шприц и линейный выход подключен к хорошо, что опорожняется путем всасывания линии, подключенной к вакуумной ловушке.
Микроскопом
Мы используем перевернутой Nikon Eclipse TE2000-U Микроскоп оснащен ксеноновой дуговой лампы (Саттер Instruments), автоматизированных этапе (Ludl), фильтра возбуждения колесо (Ludl) и охлаждением заряда пару (ПЗС) камеры (Хамамацу Orka II). Микроскопа контролируется Macintosh комкомпьютеру под управлением программного обеспечения с открытым Lab (импровизация). Несколько других программных пакетов, которые доступны для логометрических изображений. Для визуализации мы используем 40, 60 или 100 раз Nikon Fluor нефти погружения целей с NA превышает 1,2.
Протокол изображений
- Калибровка столик микроскопа.
- Нагрузка Tyrodes решение в строку ввода заботясь, чтобы предотвратить образование воздушных пузырьков.
- Подключение камеры к перфузии линий и решение заливать Tyrodes через камеру еще раз, заботясь, чтобы предотвратить образование пузырьков в камере
- Место падения нефти на цели, месту камеры на столике микроскопа и сосредоточиться на клетки с использованием проходящего света.
- Изучение флуоресценции клеток с использованием освещения на 340 и на 380 нм, используя окуляры. Отдых клетки должны быть тусклый при 340 и яркие на 380. В общем, клетки не должны быть освещены с УФ-света более чем на 10 или 15 секунд, а интенсивность возбуждающего света должна быть снижена с нейтральной плотности фильтра для предотвращения фототоксичности.
- Изучение клетки с помощью камеры и установить коэффициент усиления и воздействия на камеру для получения изображения, близкое к насыщению (но не насыщенный) при освещении при 380 нм и значительно ниже насыщения при освещении при 340 нм. Держите воздействия, ниже 200 мс, если это возможно. После установки не меняются получить камеру или воздействие, если вы планируете также изменить фон, Rmin и Rmax (см. ниже).
- Сбор изображение для каждой длины волны и использовать области интереса (ROI), инструмент для измерения интенсивности фона в различных местах в изображения для каждой длины волны.
- Средняя фоновых значений и введите фоновые значения в соответствующих местах, изображений программы. Фоновое значение будет вычитаться из каждого пикселя в поле.
- Сбор изображение практике отношения и регулировать Пороговые значения для каждой длины волны для получения изображения коэффициент, который включает только клетки, а не фон, а это не шумно в области, близкой к краям клетки.
- Установить минимальное значение отношения (Rmin), которые будут примерно на 10% ниже самого низкого отношения любую ячейку в этой области.
- Установить Rmax, примерно в 12 раз Rmin. Не изменяйте Rmin или Rmax между эксперименты, которые планируется сравнить, как он будет делать сравнения. Мы редко меняют Rmin и Rmax значения на наших изображений буровой установки.
- Использование автоматизированных этапе найти поля, которые вы планируете изображения и записывать местоположение каждого поля с помощью программного обеспечения. Как правило, мы собираем пять полей зрения во время эксперимента. Автоматизированные движется этапе к полю, собирает соотношение изображения и переходит к следующему полю.
- Настройка покадровой интервал для сбора изображений от 0,1 до 10 секунд друг от друга в зависимости от типа сигналов, которые вы ожидаете увидеть.
- Начать эксперимент.
- При тестировании системы кальция изображения часто бывает полезно использовать стимулы, как высокая tyrodes калия (65 мМ KCl) или иономицина (2 мкм), что вызовет повышение внутриклеточного кальция и кальция свободный внеклеточный решение, которое будет (содержащие кальций буферов как EGTA и BAPTA ), что приведет к сокращению концентрации кальция.
Анализ
После завершения эксперимента вы хотите конвертировать набор соотношение изображения в замедленной измерения кальция для отдельных клеток или регионах, представляющих интерес в клетках. Для этого:
- Используйте область интереса инструмент (ROI) для определения области изображения, в которой вы хотите измерить кальция. Как правило, полезно иметь хотя бы одного ROI, которая покрывает тело клетки в клетку. При определении трансформирования, полезно играть в кино образы проверить, что клетки не двигаются в ходе эксперимента.
- Использование программного обеспечения для сбора покадровой измерений соотношение для каждого ROI в каждом изображении.
- Импорт соотношение измерений в анализе программы. Вам понадобится, чтобы посмотреть следы кальция для конкретных клеток или трансформирования, средний нескольких ячеек или трансформирования и конвертировать соотношение измерения внутриклеточного кальция ценностей. Мы используем набор макросов, написанных на Игоря Pro, которые позволяют нам делать все эти общие задачи анализа, но и других программ, как Excel, хотя и менее удобны также может быть использован.
- Уравнение [Са] = (RR мин) / (R макс-R) Sf * Kd могут быть использованы для преобразования Фура-2 значения отношение к концентрации внутриклеточного кальция. [Са] является концентрация кальция, R является Фура-2 340/380 отношение, Rmin и Rmax являются 340/380 отношения в отсутствие кальция или в присутствии насыщающей концентрации кальция соответственно; и Sf * Kd является продукт Kd из Фура-2 (около 120 нм при комнатной температуре) и масштабирование значения. Для измерения R Мин, Макс и R Sf * Kd необходимо выполнять либо в естественных условиях или в калибровке пробирке. В естественных условиях требует калибровкиСочетание патч зажима и кальция с изображениями, которые могут быть сложными, но и очень точным. В пробирке калибровки можно сделать с помощью самодельных калибровки камеры, которая состоит из двух покровных разделенных тонким Spacer покровное для создания тонкого слоя раствора, в котором для выполнения калибровки. Наиболее удобным способом измерения Фура-2 значения отношения в зависимости от концентрации кальция является использование калибровочный комплект, которые содержат несколько буфер кальция решений и Фура-2 свободной кислоты. Они могут быть получены из Invitrogen (Molecular Probes) и содержат точные инструкции по применению.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой презентации мы прошли через все шаги для выполнения кальция визуализации с использованием Фура-2 AM. Мы использовали нейроны коры, как модель, но кальция визуализации может быть использован для измерения внутриклеточного кальция в реальном времени в различных клетках. При выполнении этой процедуры важно использовать стекла покровные, а не из пластика, так как пластик часто флуоресцентными в ультрафиолетовом длин волн, что делает изображение трудно. Кроме того, важно предварительного нанесения покровных с polyornithine и ламинин, чтобы предотвратить клетки от отключения. Наконец, важно помнить, чтобы избежать создания пузырьков воздуха при перфузии растворов через камеру изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
