Summary
Kalcium signaler spelar en viktig roll i många cellulära processer, inklusive genuttryck, överlevnad och differentiering. Här visar vi hur du utför kalcium avbildning med Fura-2 AM. Kalcium avbildning är ett värdefullt verktyg för att studera regleringen av intracellulära kalcium i realtid och dess reglering av signalering kaskader.
Abstract
Kalcium avbildning är en vanlig teknik som är användbar för att mäta kalcium signaler i odlade celler. Kalcium avbildningstekniker dra nytta av färgämnen kalcium indikator, som är BAPTA-baserad organiska molekyler som ändrar deras spektrala egenskaper som svar på bindningen av Ca2 + joner. Kalcium indikator färgämnen indelas i två kategorier, ratio-metriska färgämnen som Fura-2 och Indo-1 och enda våglängd färgämnen som Fluo-4. Ratio-metriska färgämnen antingen ändra sina excitation eller emissionsspektra som svar på kalcium, vilket gör att koncentrationen av intracellulärt kalcium som skall fastställas av förhållandet fluorescens utsläpp eller excitation vid olika våglängder. Den främsta fördelen med att använda kvoten-metriska färgämnen över enda våglängd sonder är att kvoten signalen är oberoende av färg koncentration, belysning intensitet och optisk våglängd gör att koncentrationen av intracellulärt kalcium som skall fastställas oberoende av dessa artefakter. En av de vanligaste kalcium indikatorer är Fura-2, som har ett utsläpp topp vid 505 nm och byter excitation topp från 340 nm till 380 nm som svar på kalcium bindande. Här beskriver vi användandet av Fura-2 för att mäta intracellulära kalcium stegringar av nervceller och andra retbara celler.
Protocol
Cell Culture
Celler kan odlas med hjälp av etablerade metoder utan måste pläterade på # 1 glas täckglas belagd med ett cellulärt lim (som polylysine, polyornithine eller laminin) för att förhindra att celler från lossnar eller rör sig under avbildning experiment.
Lösningar
Kalcium imaging experiment kan utföras med hjälp av olika fysiologiska lösningar inklusive media cellkultur. Det är dock viktigt att se till att lösningarna är fria från fenolrött, vilket kraftigt ökar fluorescerande bakgrunden. Vi använder Tyrodes lösning som enkelt görs och härmar cerebrospinalvätska, och vi komplettera med 0,1% bovint serumalbumin. Vi använder depolarisation med 60-90 mM kaliumklorid för att aktivera spänningsstyrda kalciumkanaler och 1μM Thapsigargin (1 mm lager i DMSO) eller 2μM Ionomycin (1 mm lager i DMSO) för att aktivera lagra drivs CRAC kanaler. Det är ofta praktiskt att ta bort kalcium från extracellulära lösning för att visa att kalcium höjder beror på kalciuminflödet. När du tar bort kalcium är det nödvändigt att behålla den totala koncentrationen av tvåvärda katjoner (Mg 2 + och Ca 2 +) konstant. När ersätta kalium för natrium är det nödvändigt att upprätthålla den osmotiska balansen.
Tyrodes lösningar:
| Låga kaliumnivåer 2mm Ca 2 + Tyrodes (mm) | Låga kaliumnivåer 0 Ca 2 + Tyrodes (mm) | Hög Kalium 2mm Ca 2 + Tyrodes (mm) | Hög Kalium 0 Ca 2 + Tyrodes (mm) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| Glukos | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
Justera pH till 7,4 med NaOH
Lastning av Fura-2 kalcium färgämne
Vi lastceller med Acetoxy-metylester Fura-2 (Fura-2 AM), som diffunderar genom cellmembranet och är de-förestrade av cellulära esteraser ge Fura-2 fri syra. Den exakta parametrar för Fura-2 lastning varierar kraftigt mellan celltyper. Vi rekommenderar att du provar olika förhållanden genom att förbereda flera lastning lösningar som innehåller en multipel koncentrationer av Fura-2 rasar 1 till 4 mikroM, inkubera celler i lastning lösningen för en mängd olika tider från 15 minuter till 2 timmar och testning lastning vid rumstemperatur och vid 37 grader. En förenklad protokoll för kortikala neuroner ges nedan:
- Först förbereder en mM Fura-2:00 lager genom att lägga 50μl av DMSO till 50 mikrogram injektionsflaska tillgängliga från Invitrogen. Det är viktigt att använda torr DMSO packade under kväve och det är nödvändigt att ta bort DMSO med en nål genom att punktera membranet för att förhindra fukt i DMSO. Efter beredning av Fura-2:00-lösning förvara den på ett mörkt och torrt. Fura-2 AM i DMSO är stabil vid RT i 24 timmar och är stabil vid - 20 grader i en torr behållare i flera månader.
- Alikvotera 2 ml av kulturen media i en 15 ml konisk tub, varmt till 37 grader. och lägga 2μl av Fura-2:00 lager för att skapa en 1μM Fura-2:00 lösning. Vortex lösningen kraftigt i 1 minut.
- Överför lastning lösning till en 35 mm vävnadsodling skålen och överför täckglas med cellerna i skålen.
- Inkubera nervceller vid 37 grader i 30 minuter i ett mörkt kuvös. Tid inkuberingen exakt.
- Förbered en 35 mm maträtt innehållande 2 ml av medier vävnadsodling utan Fura-2 AM. Ta bort täckglaset från lastning lösningen och häll i den nya formen.
- Montera täckglas på avbildning kammaren. Ta bort täckglaset från 35 mm skålen och snabbt montera på kammaren och se till att förhindra uttorkning av cellerna. Vi använder en avbildning kammare tillverkad av Warner instrument som tillåter en 10mm täckglas som innehåller celler som skall monteras på botten och en andra täckglas att monteras på toppen bilda en smörgås. De två täckglas är säkrade med vakuum fett på kammaren och två tuber i vardera änden av kammaren tillåter perfusion av lösningar genom kammaren. Ingången är ansluten till en spruta och utgången är ansluten till en brunn som töms genom en sugledning ansluten till ett vakuum fälla.
Mikroskopet
Vi använder en inverterad Nikon Eclipse TE2000-U mikroskop utrustat med en xenon båge lampa (Sutter Instrument), en automatiserad stadium (Ludl), en excitation filter hjul (Ludl), och en kyld Charge-Couple Device (CCD) kamera (Hamamatsu Orka II). Mikroskopet styrs av en Macintosh-comdator som kör Open Lab programvara (improvisation). Flera andra programvarupaket finns tillgängliga för ratiometrisk avbildning. För bildbehandling använder vi 40, 60 eller 100x Nikon Fluor olja mål nedsänkning med en NA överstiger 1,2.
Bildprotokoll
- Kalibrera mikroskop scenen.
- Ladda Tyrodes lösning i inmatningsraden noga med att förhindra uppkomsten av luftbubblor.
- Anslut kammaren till perfusion linjer och Tyrodes BEGJUTA lösning genom kammaren igen, var noga med att förhindra uppkomsten av bubblor i kammaren
- Placera en droppe olja på målet, placera kammare på mikroskop scenen och fokusera på cellerna med hjälp av ljus.
- Undersök fluorescensen hos celler genom att använda belysning vid 340 och 380 nm med okularen. Vilande celler bör dunkelt vid 340 och ljusa vid 380. I allmänhet bör cellerna inte belysas med UV-ljus i mer än 10 eller 15 sekunder och intensiteten i excitation ljus bör minskas med en neutral densitet filter för att förhindra fototoxicitet.
- Undersök cellerna med hjälp av kameran och ställa in förstärkning och exponering av kameran för att skapa en bild som är nära mättnad (men inte mättad) vid belysning vid 380 nm och en bra bit under mättnad vid belysning vid 340 nm. Håll exponeringen under 200ms om möjligt. En gång in, inte ändra kamerans vinsten eller exponering om du inte tänker också ändra bakgrund, Rmin och Rmax (se nedan).
- Samla en bild på varje våglängd och använda regionen av intresse (ROI) verktyg för att mäta intensiteten på bakgrunden i en mängd olika platser i bilder för varje våglängd.
- Genomsnittlig bakgrunden värden och ange bakgrunden värden i lämpliga platser i bildprogrammet. Bakgrunden värdet kommer att subtraheras från varje pixel i fält.
- Samla en bild praktiken ratio och justera tröskelvärden för varje våglängd för att skapa ett förhållande bild som bara innehåller de celler och inte bakgrunden och som inte är högljudd i regionen nära kanterna av cellerna.
- Ställ in min kvotvärde (Rmin) till ca 10% lägre än det lägsta värdet för en cell i området.
- Ställ Rmax vara ungefär 12 gånger Rmin. Ändra inte Rmin eller Rmax mellan experiment som du planerar att jämföra eftersom det kommer att göra jämförelsen svår. Vi byter sällan Rmin och Rmax värderingar på vår avbildning riggen.
- Använd det automatiserade steg för att hitta de fält som du planerar att bilden och spela in placeringen av varje fält med hjälp av programvaran. Vi samlar i allmänhet fem synfält under ett experiment. Den automatiserade skede flyttar till ett fält, samlar en kvot bild och går vidare till nästa fält.
- Ställ in tidsförlopp intervall för att samla in bilder mellan 0,1 och 10 sekunder från varandra beroende på vilken typ av signaler som du förväntar dig att se.
- Starta experimentet.
- Vid testning av systemet kalcium avbildning är det ofta lämpligt att använda stimuli som högt kalium tyrodes (65 mM KCl) eller ionomycin (2μM) som kommer att orsaka en intracellulär kalcium ökar och kalcium gratis extracellulära lösning som kommer (som innehåller kalcium buffertar som EGTA och BAPTA ) som kommer att minska kalcium koncentration.
Analys
När experimentet är klart du kommer att vilja konvertera uppsättning av förhållandet bilder till tidsförlopp kalcium mätningar för enskilda celler eller områden av intresse i celler. För att göra detta:
- Använd den regionen av intresse verktyg (ROI) för att definiera de områden av bilden som du vill mäta kalcium. Det är i allmänhet bra att ha minst en avkastning som täcker cellkroppen av cellen. När man definierar Rois, är det bra att spela upp filmen av bilderna för att kontrollera att cellerna inte rör sig under försöket.
- Använd programvaran för att samla in tidsförlopp förhållandet mätningar för varje ROI i varje bild.
- Importera förhållandet mätningarna i ett analysprogram. Du måste visa kalcium spår för specifika celler eller Rois, genomsnittlig flera celler eller ROI och omvandla förhållandet mätningar till intracellulär kalcium värden. Vi använder en uppsättning makron skrivna i Igor Pro, som tillåter oss att göra alla dessa gemensam analys uppgifter, men andra program som Excel, men mindre bekvämt kan också användas.
- Ekvationen [CA] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd kan användas för att konvertera Fura-2 förhållandet värden till intracellulära kalcium koncentrationer. [Ca] är kalciumkoncentrationen, R är den Fura-2 340/380 förhållandet, Rmin och Rmax är 340/380 nyckeltal i avsaknad av kalcium eller i närvaro av en mättar koncentration av kalcium respektive, och Sf * Kd är produkten av Kd Fura-2 (ca 120 Nm vid RT) och en skalning värde. För att mäta R Min, R Max och Sf * Kd är det nödvändigt att utföra antingen en in vivo eller en in vitro-kalibrering. In vivo-kalibrering kräver enkombination av plåster fastspänning och kalcium bildhantering, vilket kan vara komplicerat men är också mycket exakt. In vitro-kalibrering kan göras med en hemmagjord kalibrering kammare som består av två täckglas åtskilda av ett tunt täckglas spacer för att generera ett tunt lager av lösning på sig att utföra kalibreringen. Det mest bekväma sättet att mäta Fura-2 förhållandet värden som en funktion av kalcium koncentrationer är att använda en kalibrering kit som innehåller flera buffrade kalcium och Fura-2 fri syra. Dessa kan erhållas från Invitrogen (molekylära sonder) och innehåller exakta instruktioner för användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna presentation har vi gått igenom alla steg för att utföra kalcium avbildning med Fura-2 AM. Vi använde kortikala neuroner som modell, men kalcium avbildning kan användas för att mäta intracellulär kalcium i realtid i olika celler. När du gör detta förfarande är det viktigt att använda glas täckglas istället för plast, eftersom plast är ofta fluorescerande i ultraviolett våglängder, vilket gör bildbehandling svårt. Dessutom är det viktigt att i förväg belägga täckglas med polyornithine och laminin för att förhindra att celler från att lossna. Slutligen är det viktigt att komma ihåg att undvika att skapa luftbubblor när perfusing lösningar genom avbildning kammaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
