Summary
Photo-geïnduceerde verknoping van niet-gemodificeerde eiwitten (PICUP) maakt karakterisering van oligomeer grootte van de distributie in metastabiele eiwitmengsels. Tonen we de toepassing van PICUP aan drie representatieve amyloidogenic peptiden van de 40 - en 42-residu vormen van amyloid β-eiwit, en calcitonine, en een controle peptide groei-hormoon releasing factor.
Abstract
De assemblage van amyloidogenic eiwitten in toxische oligomeren is een rudimentaire gebeurtenis in de pathogenese van eiwit misfolding ziekten, waaronder Alzheimer, Parkinson en Huntington ziekten, erfelijke amyotrofe laterale sclerose, en type 2 diabetes. Vanwege de metastabiele aard van deze verzamelingen van eiwitten, is het moeilijk om hun oligomeer grootte-verdeling kwantitatief te beoordelen met behulp van klassieke methoden, zoals elektroforese, chromatografie, fluorescentie, of dynamische lichtverstrooiing. Oligomeren van amyloidogenic eiwitten bestaan als metastabiele mengsels, waarin de oligomeren dissociëren in monomeren en tegelijkertijd associate in grotere assemblages. PICUP stabiliseert oligomeer populaties door covalente cross-linking en in combinatie met fractionering methoden, zoals natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) of size-exclusion chromatografie (SEC), PICUP biedt snapshots van het oligomeer grootte distributies die bestond voordat kruis -linking. Vandaar dat PICUP maakt visualisatie en kwantitatieve analyse van metastabiele eiwit bevolking en kan gebruikt worden om de montage en ontcijferen relaties tussen volgorde wijzigingen en oligomerisatie te controleren
Protocol
1. Peptide voorbereiding
- Weeg ~ 100 tot 200 ug van gevriesdroogde peptide met behulp van een microbalans en overdracht in gelabelde, silicium-coating, low-adsorbens microcentrifuge buizen. Hier gebruiken we de menselijke sequenties van Aβ40, Aβ42, calcitonine, en GRF.
- Hier maken we gebruik van peptiden die voorbehandeld zijn met 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) tot homogene, aggregaat-vrije bereidingen te verkrijgen. Deze stap is nodig omdat vooraf gevormde aggregaten induceren snelle aggregatie van amyloidogenic eiwitten, die leiden tot een slechte reproduceerbaarheid onder de experimenten 5. Andere methoden zoals filtratie en SEC kunnen ook worden gebruikt voor het verzamelen zonder de voorbereidingen voor PICUP 6 te verkrijgen.
- De behandeling van de peptiden met HFIP, pre-chill de HFIP container op het ijs in een zuurkast het dragen van adequate bescherming (HFIP is vluchtig en giftig). Koelen van een 250 ml fles vereist normaliter 10-15 minuten. Voeg HFIP vooraf gekoelde buisjes met peptide lyofilisaten tot een nominaal peptide concentratie van 0,5 mM te verkrijgen.
- Ultrasone trillingen het peptide oplossingen in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Vortex en incubeer voorzichtig de buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Chill de buizen op ijs (voor 1 min), en verdeel de oplossingen in 10-50-ul monsters in het label 0.6-ml low-adsorbens buizen.
- Verwijder HFIP door verdamping onder een zachte stikstofstroom, of 's nachts laat de buizen te openen in de zuurkast. Voor 's nachts verdamping, plaats de open buizen in een rek en bedek ze met een groot vel Kimwipes om stof en deeltjes contaminatie te voorkomen.
- Exsiccate de resterende HFIP in vacuüm in een vriesdroger, of een centrifugale compressor voor 30 min, of in een exsiccator bevestigd aan een vacuüm inlaat gedurende 2 uur Het uiteindelijke product zal een peptide film op de bodem van de microcentrifuge buizen worden. Als dit goed wordt exsiccated, kunnen de buizen luchtdicht worden opgeslagen voor langere tijd (maanden) bij -20 of -80 ° C.
2. Oplossen van de HFIP behandeld met peptiden en foto's cross-linking
- Voor oplossen van de HFIP behandelde peptiden voor cross-linking reacties, moet men de cross-linking en quenching reagentia te bereiden.
- Weeg ammoniumpersulfaat (APS, de heer 228,2 g / mol) en bereiden een 20 mM oplossing in 10 mM natriumfosfaat, pH 7,4. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing helder is.
- Bereid 1 mM oplossing van Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydraat (RuBpy, de heer 748,63 g / mol) in 10 mM natriumfosfaat, pH 7,4. Meng met behulp van een vortex en controleer volledig is opgelost. Bescherm de buis van licht met behulp van aluminiumfolie.
- Voor de SDS-PAGE analyse na de cross-linking, een handige quenching reagens is 5% β-mercapto-ethanol in 2 × SDS-PAGE sample buffer. U kunt ook een M dithiothreitol (DTT, de heer 154,5 g / mol) in gedeïoniseerd water of een geschikte buffer kan worden gebruikt.
- HFIP behandelde peptide films zijn opgelost in verdund NaOH en vervolgens natriumfosfaatbuffer wordt toegevoegd aan ~ 30 uM peptide concentratie te krijgen. Voeg 60 mM NaOH gevolgd door gedeïoniseerd water in de buis met het peptide film zodanig dat NaOH en water 10 en 45% van het uiteindelijke volume, respectievelijk vormen. Schraap het peptide film uit de binnenwanden van microfugebuis het gebruik van de tip, meng door en neer te pipetteren, en ultrasone trillingen gedurende 5 minuten in een waterbad ultrasoonapparaat.
- Voeg 45% 20 mM natriumfosfaat, pH 7,4, meng door pipetteren, en centrifugeer bij 16.000 g gedurende 10 minuten. Gereserveerd fracties van uncross gekoppelde peptiden gemengd met de quenching reagens voor negatieve controles.
- Stel de camera ontspanknop vertraging van 1 s. Bij hogere bestraling Soms kan een uitgebreide radicale reacties kan veroorzaken afbraak van eiwitten. Laad de sluiter van de camera. Bestraling tijd moet mogelijk worden geoptimaliseerd bij gebruik van de methode met een nieuw eiwit.
- Een typische PICUP reactie wordt uitgevoerd in een 20 ul reactie volume. Overdracht 18 ul van de peptide-oplossing in een dunwandige, helder, 0,2 ml PCR-buis.
- Om de peptide-oplossing, voeg 1 pl RuBpy gevolgd door een ui APS en meng de reagentia door pipetteren (de uiteindelijke concentratie van RuBpy en APS in het reactiemengsel wordt 0,05 en 1 mM, respectievelijk).
- Plaats snel de reageerbuis in een 1.8-ml glazen flacon. Plaats de flacon in de balg bevestigd voor de camera body. Bevestig de lens beschermer en druk de ontspanknop, zodat het monster wordt bestraald voor een s in de balg.
- Na het monster bestraling, snel de flacon uit de balg en de PCR-buis uit de flacon. Snel blussen de reactie door het toevoegen van een ui DTT of 10 ul verminderen PAGINA sample buffer. Herhaal de reactie voor elke peptide aliquot deel.
- De reactie mengsels kan nu worden ingevroren bij -20 ° C voor de opslag niet langer dan 7 dagen of op ijs bewaard voor analyse door SDS-PAGE en zilver-kleuring.
3. SDS-PAGE en sliver-kleuringvan cross-linked producten peptide
- Routine SDS-PAGE en zilver-kleuring worden uitgevoerd om cross-linked peptiden te visualiseren.
- Belasting 5 ul van het reactiemengsel per rijstrook tot ~ 130 pmol van peptide per baan te verkrijgen.
- Onder vergelijkbare hoeveelheden van uncross-linked peptiden voor vergelijking. Eveneens een standaard eiwit ladder voor visuele aanpassing van de moleculair gewicht van peptide bands.
- Voer de gel met behulp van een standaard-gelelektroforese apparaat. We gebruiken de XCell SureLock Mini-Cell systeem van Invitrogen en uitvoeren van zilver-kleuring volgens Invitrogen publicatie IM-1002, Novex Pre-Cast gelelektroforese Guide.
Deel 4: representatieve resultaten (figuur 1)
Figuur 1: Silver-gekleurde polyacrylamide gels zien uncross-linked (-) en foto-cross-linked (+) GRF, calcitonine, Aβ40 en Aβ42
SDS-PAGE en zilver-kleuring analyses van PICUP gegenereerde Aβ40 oligomeren tonen ongeveer dezelfde band intensiteiten monomeer door tetrameer, gevolgd door een scherpe daling in de overvloed van hogere oligomeren 7. Uncross-linked Aβ40 migreert met een heer in overeenstemming is met dat van monomeer 7. Aβ42 toont een duidelijke oligomeer grootteverdeling. Aβ42 oligomeren omvatten 2-3 groepen 8. De eerste groep, monomere door trimeer, displays afnemende intensiteit met toenemende oligomeer bestelling. In de tweede groep, is een Gaussiaanse-achtige verdeling waargenomen tussen tetrameer en heptamer, met een maximum op pentameer en hexameer. De derde groep, die hier niet wordt weergegeven, bevat oligomeren van de heer ~ 30,000-60,000 Da 8. Deze hogere heer oligomeren meestal worden waargenomen met behulp van SEC-geïsoleerde LMW Aβ42 maar niet peptide bereid door filtratie of HFIP behandeling 6. Uncross-linked Aβ42 produceert voornamelijk twee bands, een monomeer band en een brede trimeer / tetrameer band, dat is een artefact veroorzaakt door SDS 5,9. Calcitonine levert een oligomeer grootte-verdeling die sterk afwijkt van een monotone exponentiële daling in de regio monomer via tetrameer, wat suggereert pre-existentie van dimeren, trimeren en tetrameren 7. De controle polypeptide, GRF, produceert een monotone oligomeer distributie, variërend van dimeer via hexameer zodanig dat de schijnbare relatieve hoeveelheden van oligomeren exponentieel afnemen met toenemende moleculaire massa. In andere experimenten, hogere oligomeren ook zou kunnen worden gevisualiseerd 7. Het exacte aantal en de relatieve intensiteiten van oligomeer bands kunnen enigszins variëren tussen de experimenten afhankelijk van de werkelijke eiwitconcentratie, de hoeveelheid proteïne geladen op de gel, en de tijd gebruikt voor de ontwikkeling stap in de zilver-kleuringsprotocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PICUP is oorspronkelijk ontwikkeld om een stabiele eiwitcomplexen 2-studie. De methode werd later toegepast op de kwantitatieve studie van metastabiele amyloïde eiwit assemblages, waaronder Aß 10, prion en ziekte-geassocieerde PrP Sc 11, en α-synucleïne 12. De belangrijkste factoren die moeten worden genomen bij het ontwerpen van een PICUP experiment zijn de reagens stoichiometrie, bestraling tijd, en monstervoorbereiding procedure. De eerste twee punten kan verlangen empirische optimalisatie, terwijl de laatste probleem grotendeels van invloed op de interpretatie van de experimentele data. Voor amyloidogenic eiwitten in het bijzonder, de bepaling van de grootte verdeling van metastabiele oligomeren vereist het gebruik van geaggregeerde-vrije starten de voorbereidingen. De achtergrond, mechanisme, werden instrumentatie, protocol, optimalisatie, scope, aanpassingen, toepassingen en beperkingen van PICUP bedekt met eerdere publicaties 1,2,13. PICUP kan worden gebruikt om een stabiele, oplosbare proteïne oligomeren te genereren dat het volgen van fractionering en zuivering, kan worden gebruikt voor structurele studies, cytotoxiciteit testen, oligomerisatie-inhibitie studies, en als doelwit voor de ontwikkeling van moleculaire-erkenning tools.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies AG027818 en AG030709 van NIH / NIA, 2005/2E uit de Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 van de Alzheimer Association, en 07-65798 uit California Department of Public Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
