Summary
Photo-induit de réticulation des protéines non modifiées (PICUP) permet de caractériser la distribution de taille oligomère de mélanges de protéines métastable. Nous démontrons l'application de PICUP à trois peptides représentatifs amyloïdogéniques les 40 - et 42-résidus formes d'amyloïde β-protéine, et la calcitonine, et un peptide contrôle l'hormone de croissance facteur de libération.
Abstract
L'assemblage des protéines amyloïdogéniques en oligomères toxiques est un événement majeur dans la pathogenèse des maladies repliement des protéines, y compris la maladie d'Alzheimer, de Parkinson et les maladies de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique héréditaire, et diabète de type 2. En raison de la nature métastable de ces assemblages de protéines, il est difficile d'évaluer leur distribution en taille oligomère quantitativement en utilisant les méthodes classiques, telles que l'électrophorèse, la chromatographie diffusion de la lumière, la fluorescence, ou dynamique. Les oligomères de protéines amyloïdogéniques existent sous forme de mélanges métastable, dans lequel les oligomères se dissocient en monomères et d'associer en grandes assemblées simultanément. PICUP stabilise les populations oligomère par reticulation covalente et lorsqu'il est combiné avec des méthodes de fractionnement, tels que le sulfate de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodecyl (SDS-PAGE) ou chromatographie d'exclusion stérique (SEC), offre des instantanés de PICUP les distributions de taille oligomère qui existaient avant la Croix -lier. Ainsi, PICUP permet la visualisation et l'analyse quantitative des populations en protéines métastable et peut être utilisé pour surveiller les relations d'assemblage et décrypter entre les modifications de séquence et d'oligomérisation
Protocol
1. La préparation de peptides
- Peser ~ 100-200 ug de peptide lyophilisé en utilisant une microbalance et transférer dans étiquetés, siliconé, microtubes de faible adsorbant. Ici, nous utilisons les séquences humaines de l'Aß40, Aß42, la calcitonine, et GRF.
- Ici, nous utilisons des peptides pré-traitées avec 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) pour obtenir homogène, sans agrégat préparatifs. Cette étape est nécessaire car pré-formé des agrégats induire l'agrégation rapide des protéines amyloïdogénique, qui aboutissent à une mauvaise reproductibilité des expériences 5. D'autres méthodes telles que la filtration et de la SEC peuvent également être utilisées pour obtenir sans agrégat préparatifs pour PICUP 6.
- Pour traiter les peptides avec HFIP, pré-refroidir le conteneur de HFIP sur glace à l'intérieur d'une hotte porter une protection adéquate (HFIP est volatile et toxique). Refroidissement d'une bouteille de 250 ml nécessite généralement 10-15 min. Ajouter HFIP de pré-réfrigérée tubes contenant lyophilisats peptide pour obtenir une concentration de peptide nominale de 0,5 mM.
- Soniquer les solutions de peptide dans un sonicateur bain-marie pendant 5 min à température ambiante.
- Vortex doucement et incuber les tubes pendant 30 min à température ambiante.
- Réfrigérer les tubes sur la glace (pendant 1 min), et de diviser les solutions en 10-50-ul aliquotes de 0,6 ml, étiqueté faible adsorbant tubes.
- Retirer HFIP par évaporation sous un léger courant d'azote, ou laisser les tubes ouverts dans la hotte du jour au lendemain. Pour l'évaporation pendant la nuit, placer les tubes ouverts dans un rack et les couvrir avec une grande feuille de Kimwipes pour empêcher la poussière et la contamination particulaire.
- Exsiccate l'HFIP restent sous vide dans un lyophilisateur, ou un concentrateur centrifuge pendant 30 min, ou dans un dessicateur attaché à une entrée vide pendant 2 h. Le produit final sera un film de peptide dans le bas des tubes de microcentrifugation. Si elle est correctement exsiccated, les tubes peuvent être stockés pendant de longues périodes étanches (mois) à -20 ou -80 ° C.
2. Solubilisation des peptides HFIP-traitée et la photo de réticulation
- Avant de solubiliser les peptides HFIP-traités pour la réticulation des réactions, on a besoin pour préparer la réticulation et des réactifs de trempe.
- Peser le persulfate d'ammonium (APS, M. 228,2 g / mol) et de préparer une solution à 20 mM dans phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire.
- Préparer une solution mM de Tris (2,2-bipyridyle) dichlororuthénium (II) hexahydraté (RuBpy, M. 748,63 g / mol) dans 10 mM phosphate de sodium, pH 7,4. Mélanger à l'aide d'un vortex et de vérifier la dissolution complète. Protéger le tube de la lumière en utilisant du papier d'aluminium.
- Pour analyse SDS-PAGE après réticulation, un réactif trempe commode est de 5% β-mercaptoéthanol dans le tampon d'échantillon 2 × SDS-PAGE. Alternativement, 1 M dithiothréitol (DTT, M. 154,5 g / mol) dans de l'eau déminéralisée ou un tampon approprié peut être utilisé.
- Films peptide HFIP-traitées sont dissous dans NaOH dilué d'abord, puis un tampon phosphate de sodium est ajouté pour obtenir la concentration de peptide ~ 30 pM. Ajouter 60 mM de NaOH suivie d'eau déminéralisée dans le tube contenant le film peptide tel que NaOH et l'eau représentent 10 et 45% du volume final, respectivement. Racler le film peptide hors les murs à l'intérieur du tube de centrifugeuse à l'aide de la pointe, mélanger par pipetage de haut en bas, et soniquer pendant 5 min dans un sonicateur bain-marie.
- Ajouter 45% phosphate de sodium 20 mM, pH 7,4, mélanger par pipetage, et centrifuger à 16000 g pendant 10 min. Mettez de côté des aliquotes de peptides non réticulés mélangé avec le réactif de trempe pour les contrôles négatifs.
- Réglez la caméra obturateur de retard à 1 s. Au temps d'irradiation plus élevés, de vastes réactions radicalaires peuvent provoquer la dégradation des protéines. Chargez l'obturateur. Temps d'irradiation peut avoir besoin d'être optimisé en utilisant la méthode avec une nouvelle protéine.
- Une réaction typique est PICUP effectuée dans un volume de 20 ul de réaction. Transfert 18 ul de la solution de peptide dans une paroi mince, claire, 0,2 ml, tube de PCR.
- Pour la solution de peptide, ajoutez 1 RuBpy ul suivie par une APS ul et mélanger les réactifs par pipettage (la concentration finale de RuBpy et APS dans le mélange réactionnel sera de 0,05 et 1 mM, respectivement).
- Placer rapidement le tube de réaction dans un flacon en verre de 1,8 ml. Placer le flacon à l'intérieur du soufflet attaché à l'avant du boîtier de l'appareil. Fixez le protecteur d'objectif et appuyez sur le déclencheur afin que l'échantillon est irradié pendant 1 s à l'intérieur du soufflet.
- Après irradiation des échantillons, prendre rapidement le flacon hors du soufflet et le tube de PCR de la fiole. Vite arrêter la réaction en ajoutant 1 TNT ul ou 10 ul de tampon réduisant l'échantillon PAGE. Répétez la réaction de chaque aliquote de peptide.
- Les mélanges réactionnels peuvent maintenant être congelés à -20 ° C pour le stockage pour une durée maximale de 7 jours ou conservés sur la glace avant l'analyse par SDS-PAGE et coloration argentée.
3. SDS-PAGE et coloration ruban-des produits de peptide réticulé
- Routine SDS-PAGE et coloration argentée sont effectuées pour visualiser réticulé peptides.
- Charge 5 ul du mélange réactionnel par voie d'obtenir ~ 130 pmol de peptide par voie.
- Inclure des quantités similaires de non réticulé peptides pour la comparaison. Inclure également une échelle de protéines standards de rapprochement visuel de poids moléculaire des bandes peptidiques.
- Exécutez le gel en utilisant un appareil d'électrophorèse sur gel de la norme. Nous utilisons le XCell SureLock mini-cellule du système d'Invitrogen et effectuer argent coloration en fonction de la publication Invitrogen IM-1002, Novex Pre-Cast Guide électrophorèse sur gel.
Partie 4: Résultats Représentant (figure 1)
Figure 1: gels de polyacrylamide coloré à l'argent montrant non réticulé (-) et photo-réticulé (+) GRF, la calcitonine, Aß40 et Aß42
SDS-PAGE et coloration argentée analyses de PICUP généré Aß40 oligomères montrent intensités des bandes à peu près similaire de monomère travers tétramère, suivie par une forte diminution de l'abondance des oligomères supérieurs 7. Non réticulé Aß40 migre avec un compatible avec celui du monomère 7 M.. Aß42 montre une distribution oligomère distinctes taille. Aß42 oligomères comprennent 2-3 groupes 8. Le premier groupe, monomère par trimère, affiche intensité décroissante avec l'ordre oligomère croissante. Dans le second groupe, une distribution gaussienne-like est observée entre tétramère et heptamère, avec un maximum à pentamère et hexamère. Le troisième groupe, qui n'est pas représenté ici, contient des oligomères de M. ~ Da 30,000-60,000 8. Ces oligomères supérieurs de M. sont généralement observés à l'aide SEC isolé LMW Aß42 mais pas peptide préparé par filtration ou 6 traitements HFIP. Non réticulé Aß42 produit principalement deux bandes, une bande de monomère et un large trimère / tétramère de bande, qui est un artefact induit par SDS 5,9. La calcitonine donne une distribution de taille oligomère qui diverge fortement d'une diminution exponentielle monotone dans le monomère région par tétramère, suggérant la pré-existence de dimères, trimères, tétramères et 7. Le contrôle polypeptide, GRF, produit une distribution d'oligomères monotone allant de dimères grâce hexamère tels que les montants relative apparente des oligomères baisse de façon exponentielle avec la masse moléculaire augmente. Dans d'autres expériences, des oligomères supérieurs pourraient également être visualisés 7. Le nombre exact et les intensités relatives des bandes oligomère peut varier quelque peu entre les expériences en fonction de la concentration en protéines, la quantité de protéines chargées sur le gel et le temps utilisé pour l'étape de développement dans le protocole de coloration argentée.
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Discussion
PICUP a été développé à l'origine pour étudier les complexes protéiques stables 2. La méthode a été appliquée plus tard à l'étude quantitative de la protéine amyloïde métastable assemblées, y compris Aßi 10, prions et les maladies associées à la PrP Sc 11, et α-synucléine 12. Les facteurs les plus importants qui doivent être considérés lors de la conception d'une expérience PICUP sont la stoechiométrie des réactifs, temps d'irradiation, et la procédure de préparation d'échantillons. Les deux premiers problèmes peuvent nécessiter l'optimisation empirique, tandis que la dernière question concerne essentiellement l'interprétation des données expérimentales. Pour les protéines amyloïdogéniques en particulier, la détermination des distributions de taille des oligomères requiert l'utilisation d'agrégats métastables préparations sans compter. L'arrière-plan, le mécanisme, l'instrumentation, le protocole, l'optimisation, la portée, les modifications, les applications et les limites de PICUP ont été couverts dans les publications précédentes 1,2,13. PICUP peut être utilisé pour générer stables, les oligomères de protéines solubles que le fractionnement et de purification suivante, pourrait être utilisée pour des études structurales, tests de cytotoxicité, oligomérisation d'inhibition des études, et en tant que cibles pour le développement de la biologie moléculaire de reconnaissance des outils.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions et des AG027818 AG030709 du NIH / NIA, 2005/2E de la Fondation Larry L. Hillblom, IIRG-07-58334 de l'Association Alzheimer, et 07-65798 de la Californie ministère de la Santé publique.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
