Summary
תמונה-Induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) מאפשר אפיון של התפלגות גודל oligomer תערובות חלבון metastable. אנו מדגימים יישום PICUP שלושה פפטידים נציג amyloidogenic 40 - ו 42-שאריות צורות של עמילואיד β-חלבון, קלציטונין ו פפטיד לשלוט הורמון גדילה גורם משחרר.
Abstract
הרכבה של חלבונים amyloidogenic לתוך oligomers רעילים הינה אירוע מכונן בפתוגנזה של מחלות misfolding חלבון, כולל אלצהיימר, פרקינסון, ומחלות של הנטינגטון, תורשתיות טרשת לרוחב amyotrophic, וסוכרת מסוג 2. בשל אופי metastable של מכלולים אלה חלבון, קשה להעריך את גודל oligomer שלהם הפצה כמותית תוך שימוש בשיטות קלאסיות, כגון אלקטרופורזה, כרומטוגרפיה, הקרינה, או פיזור אור דינאמי. Oligomers של חלבונים amyloidogenic קיימים תערובות metastable, שבו oligomers לנתק לתוך מונומרים ולשייך לתוך מכלולים גדולים בו זמנית. PICUP מייצב אוכלוסיות oligomer על ידי cross-linking וכאשר בשילוב עם שיטות חלוקה, כגון אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג'ל polyacrylamide (SDS-PAGE) או גודל הרחקת כרומטוגרפיה (SEC), PICUP מספק תמונות קוולנטיים של הפצות גודל oligomer שהיה קיים לפני צלב -linking. לפיכך, PICUP מאפשרת הדמיה ניתוח כמותי של אוכלוסיות חלבון metastable וניתן להשתמש בו כדי לפקח על הרכבה לפענח את יחסי הגומלין בין השינויים ברצף oligomerization
Protocol
1. פפטיד הכנה
- לשקול את ~ 100-200 מיקרוגרם של הפפטיד lyophilized באמצעות microbalance ולהעביר לתוך שכותרתו, סיליקון מצופה, בעלי כושר ספיגה נמוך צינורות microfuge. כאן, אנו משתמשים רצפים האדם של Aβ40, Aβ42, קלציטונין, ואת פוי.
- כאן, אנו משתמשים פפטידים מראש שטופלו 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) כדי להשיג הומוגניות, במצטבר ללא הכנות. צעד זה הוא הכרחי משום מראש יצרו אגרגטים לגרום להצטברות מהירה של חלבונים amyloidogenic, אשר התוצאה reproducibility העניים בקרב ניסויים 5. שיטות אחרות כגון סינון ה-SEC גם יכול לשמש כדי להשיג המצרפי ללא ההכנות PICUP 6.
- כדי לטפל פפטידים עם HFIP, טרום הקור מיכל HFIP על הקרח בתוך ברדס קטר לבוש הגנה נאותה (HFIP הוא נדיפים רעילים). קירור של בקבוק 250 מ"ל מחייב בדרך כלל 10-15 דקות. הוסף HFIP מראש צונן צינורות המכיל lyophilizates פפטיד לקבל ריכוז הפפטיד נומינלית של 0.5 מ"מ.
- Sonicate הפתרונות פפטיד sonicator מים באמבט במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- וורטקס בעדינות דגירה צינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- צ'יל הצינורות על הקרח (דקות 1), ולחלק את פתרונות ל 10-50-μl aliquots שכותרתו ב 0.6-מ"ל נמוך צינורות בעלי כושר ספיגה.
- הסר HFIP על ידי אידוי תחת זרם עדין של חנקן, או לעזוב את צינורות פתוחים בשכונה קטר בן לילה. עבור אידוי לילה, במקום צינורות פתוחים במעמד ומכסים אותם עם סדין גדול של Kimwipes כדי למנוע אבק וזיהום החלקיקים.
- Exsiccate HFIP הנותרים האור בריק ב lyophilizer, או concentrator צנטריפוגלי למשך 30 דקות, או exsiccator מצורף כניסת ואקום עבור 2 ח המוצר הסופי יהיה סרט פפטיד בתחתית הצינורות microfuge. אם exsiccated כראוי, צינורות יכול להיות מאוחסן אטום ב -20 או -80 ° C. במשך תקופות ממושכות (חודשים)
2. Solubilizing HFIP שטופלו פפטידים צילום cross-linking
- לפני solubilizing HFIP שטופלו פפטידים עבור cross-linking תגובות, צריך להכין את cross-linking ו ריאגנטים מרווה.
- לשקול את persulfate אמוניום (APS, מר 228.2 g / mol) ולהכין פתרון 20 מ"מ פוספט 10 mM נתרן, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור.
- הכן פתרון 1 מ"מ טריס (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate (RuBpy, מר 748.63 g / mol) ב 10 mM נתרן פוספט, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת לאמת התפרקות מוחלטת. הגן על הצינור מן האור באמצעות רדיד אלומיניום.
- לניתוח SDS-PAGE הבאים cross-linking, מגיב מרווה נוח היא 5% β-mercaptoethanol ב 2 × SDS-PAGE חיץ המדגם. לחלופין, 1 M dithiothreitol (DTT, מר 154.5 g / mol) במים deionized או חיץ מתאים יכול לשמש.
- HFIP שטופלו סרטים פפטיד הם מומסים לדלל NaOH הראשון ולאחר מכן פוספט נתרן חיץ נוסף כדי לקבל ריכוז הפפטיד ~ 30 מיקרומטר. הוסף 60 mM NaOH ואחריו deionized המים לתוך הצינור המכיל את הסרט פפטיד כזה NaOH מים מהווים 10 ו - 45% מנפח הסופי, בהתאמה. גרדו את הסרט פפטיד מהקירות בתוך צינור microfuge משתמש קצה, על ידי שילוב pipetting למעלה ולמטה, ועל sonicate במשך 5 דקות בתוך sonicator מים באמבטיה.
- הוסף 45% 20 mM נתרן פוספט, pH 7.4, לערבב ידי pipetting ו צנטריפוגות ב g 16,000 עבור 10 דקות. מניחים בצד aliquots של uncross צמודות פפטידים מעורבב עם מגיב מרווה עבור פקדי שלילית.
- כוון את המצלמה תריס, עיכוב 1 s. בזמנים קרינה גבוהות יותר, התגובות רדיקלי נרחב עלול לגרום פירוק חלבונים. טען את תריס המצלמה. זמן הקרנה ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה כאשר בשיטת עם חלבון חדש.
- תגובה PICUP טיפוסי מבוצע בהיקף 20 תגובה μl. העברת 18 μl של הפתרון הפפטיד לתוך צינורית דקה חומה, ברור, PCR 0.2-מ"ל.
- לפתרון פפטיד, להוסיף 1 RuBpy μl ואחריו APS 1 μl ומערבבים ריאגנטים ידי pipetting (הריכוז הסופי של RuBpy ו APS בתערובת התגובה תהיה 0.05 ו - 1 מ"מ, בהתאמה).
- במהירות למקום צינור תגובה בתוך בקבוקון 1.8 מ"ל זכוכית. מניחים את הבקבוקון בתוך מפוח מצורף מול גוף המצלמה. צרף את מגן העדשה ולחץ על תריס כך המדגם הוא מוקרן עבור 1 s בתוך המפוח.
- לאחר הקרנת המדגם, מהר לקחת את הבקבוקון מן המפוח ואת הצינור PCR מתוך הבקבוקון. במהירות להרוות את התגובה על ידי הוספת 1 או 10 μl DTT מדגם μl צמצום מאגר הדפים. חזור על התגובה aliquot כל פפטיד.
- תערובות התגובה כעת ניתן קפוא ב -20 ° C עבור אחסון לא יותר מ 7 ימים או שמרו על הקרח לפני הניתוח על ידי-SDS וכסף-מכתים.
3. SDS-PAGE ו רסיס-מכתיםשל צולבים מוצרים פפטיד
- שגרה SDS-PAGE ו כסף מכתים מבוצעות לדמיין צולבים פפטידים.
- טען 5 μl מתערובת התגובה לכל נתיב להשיג ~ 130 pmol של הפפטיד לכל נתיב.
- כלול כמויות דומות של uncross צמודות פפטידים להשוואה. כמו כן כוללים סולם חלבון סטנדרטי עבור אומדן ויזואלי של משקל מולקולרי של להקות פפטיד.
- הרץ את הג'ל באמצעות מנגנון סטנדרטי ג'ל אלקטרופורזה. אנו משתמשים SureLock XCell Mini-Cell המערכת Invitrogen ולבצע כסף מכתים לפי Invitrogen פרסום IM-1002, Novex טרום יצוקה ג'ל אלקטרופורזה מדריך.
חלק 4: תוצאות נציג (איור 1)
איור 1: כסף מוכתם ג'לים polyacrylamide מראה uncross צמוד (-) ו צילום צולבים (+) פוי, קלציטונין, Aβ40 ו Aβ42
SDS-PAGE ו כסף מכתים ניתוח PICUP שנוצר Aβ40 oligomers להראות בעוצמות הלהקה דומה של כ מונומר דרך tetramer, ואחריו לירידה חדה שפע oligomers גבוה 7. Uncross צמודות Aβ40 נודד עם מר בקנה אחד עם זה של מונומר 7. Aβ42 מראה חלוקה ברורה גודל oligomer. Aβ42 oligomers מהווים 2-3 קבוצות 8. הקבוצה הראשונה, מונומר דרך trimer, מציג ירידה באינטנסיביות עם סדר oligomer גוברת. בקבוצה השנייה, הפצה גאוס כמו שנצפה בין tetramer ו heptamer, עם מקסימום ב pentamer ו hexamer. הקבוצה השלישית, אשר אינו מוצג כאן, מכיל oligomers של מר ~ 30,000-60,000 דה 8. Oligomers אלה גבוהה בדרך כלל מר הם נצפו באמצעות ה-SEC, מבודדות LMW Aβ42 אך לא פפטיד שהוכן על ידי סינון או טיפול HFIP 6. Uncross צמודות Aβ42 מייצרת בעיקר שתי להקות, להקה מונומר ותזמורת רחב trimer / tetramer, המהווה artefact המושרה על ידי SDS 5,9. קלציטונין התשואות גודל oligomer הפצה חזק סוטה מירידה מעריכי מונוטוני ב מונומר את האזור באמצעות tetramer, מה שמרמז מראש קיומה של הדימרים, trimers, ו tetramers 7. השליטה פוליפפטיד, פוי, מייצר הפצה oligomer מונוטונית החל dimer דרך hexamer כזה כמויות יחסית לכאורה של oligomers ירידה אקספוננציאלית עם הגדלת המסה המולקולרית. בניסויים אחרים, oligomers גבוה גם יכול להיות 7 דמיינו. המספר המדויק ואת עוצמות היחסי של להקות oligomer עשוי להשתנות מעט בין ניסויים תלוי בריכוז החלבון בפועל, את כמות החלבון טעון על הג'ל, והזמן המשמש בשלב פיתוח פרוטוקול כסף מכתים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PICUP פותחה במקור כדי ללמוד קומפלקסים חלבונים יציב 2. השיטה יושמה מאוחר ללמוד כמותי של metastable החלבון עמילואיד מכלולים, כולל 10 Aβ, הפריון ומחלות הקשורים PRP Sc 11, ו - α-synuclein 12. הגורמים החשובים ביותר כי יש לקחת בחשבון בעת תכנון הניסוי PICUP הם stoichiometry מגיב, זמן הקרנה, והכנת הליך הדגימה. לשעבר שני נושאים עשויים לדרוש אופטימיזציה אמפירי, ואילו הנושא השני משפיע בעיקר פרשנות של נתונים ניסיוניים. עבור חלבונים amyloidogenic בפרט, קביעה של הפצות גודל oligomers metastable מחייבת שימוש המצרפי ללא הכנות ההתחלה. ברקע, מנגנון, מכשור פרוטוקול, אופטימיזציה, היקף, שינויים, יישומים, ואת המגבלות של PICUP היו מכוסות בפרסומים קודמים 1,2,13. PICUP יכול לשמש כדי ליצור יציבות, oligomers חלבון מסיס כי חלוקה טיהור הבאים, יוכל לשמש מחקרים מבניים, מבחני cytotoxicity, oligomerization-עיכוב מחקרים, וכן מטרות התפתחות ההכרה המולקולרית כלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AG027818 ו AG030709 מ-NIH / NIA, 2005/2E מן ל לארי Hillblom קרן, IIRG-07-58334 של איגוד האלצהיימר, 07-65798 מקליפורניה המחלקה לבריאות הציבור.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
