Summary
फोटो प्रेरित पार से जोड़ने असंशोधित प्रोटीन (पीआईसीयूपी) के metastable प्रोटीन मिश्रण में oligomer आकार के वितरण के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है. हम तीन प्रतिनिधि amyloidogenic 40 पेप्टाइड्स पीआईसीयूपी के आवेदन का प्रदर्शन - और 42-β प्रोटीन amyloid और कैल्सीटोनिन के अवशेषों रूपों, और एक नियंत्रण पेप्टाइड वृद्धि हार्मोन जारी कारक है.
Protocol
1. पेप्टाइड तैयारी
- ~ Lyophilized पेप्टाइड के 100-200 μg और लेबल, सिलिकॉन लेपित, कम adsorbent microfuge ट्यूबों में Microbalance हस्तांतरण का उपयोग कर वजन. यहाँ, हम Aβ40 के मानव दृश्यों, Aβ42, कैल्सीटोनिन, और GRF का उपयोग करें.
- यहाँ, हम पूर्व 1,1,1,3,3,3 - hexafluoro-2-propanol (HFIP) के साथ इलाज के लिए सजातीय, कुल मुक्त तैयारी प्राप्त पेप्टाइड्स का उपयोग करें. यह कदम आवश्यक है क्योंकि पूर्व गठित समुच्चय amyloidogenic प्रोटीन की तेजी एकत्रीकरण, 5 प्रयोगों के बीच गरीब reproducibility में जो परिणाम प्रेरित. छानने का काम और एसईसी जैसे अन्य तरीकों को भी पीआईसीयूपी 6 के लिए कुल मुक्त तैयारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- HFIP साथ पेप्टाइड्स का इलाज करने के लिए, एक धूआं हुड के अंदर पर्याप्त सुरक्षा (HFIP अस्थिर और विषैला होता है) पहने बर्फ पर HFIP कंटेनर पूर्व ठंडा. एक 250 मिलीलीटर की बोतल का शीतलक आमतौर पर 10-15 मिनट की आवश्यकता है. पूर्व ठंडा पेप्टाइड lyophilizates युक्त 0.5 मिमी की एक मामूली पेप्टाइड एकाग्रता प्राप्त ट्यूबों HFIP जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक जल स्नान sonicator में पेप्टाइड समाधान Sonicate.
- धीरे भंवर और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्यूबों सेते.
- बर्फ (1 मिनट के लिए) पर ट्यूबों चिल, और लेबल 0.6 मिलीलीटर कम adsorbent ट्यूबों में 10-50-μl aliquots में समाधान विभाजित.
- HFIP वाष्पीकरण द्वारा नाइट्रोजन की एक सौम्य धारा के तहत, निकालें या धूआं हुड में खुला ट्यूबों रात छोड़. रातोंरात वाष्पीकरण के लिए, एक रैक में खुला ट्यूब जगह और उन्हें Kimwipes धूल कण और संदूषण को रोकने की एक बड़ी चादर के साथ कवर.
- Lyophilizer में vacuo में शेष HFIP, या 30 मिनट के लिए एक केन्द्रापसारक concentrator सोखना, या एक 2 एच. के लिए एक वैक्यूम इनलेट से जुड़ी exsiccator में अंतिम उत्पाद microfuge ट्यूबों के तल पर एक पेप्टाइड फिल्म होगी. अगर ठीक से exsiccated, ट्यूबों विस्तारित अवधि (माह) के लिए किया जा airtight कर सकते हैं -20 या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
2. HFIP इलाज पेप्टाइड्स Solubilizing और फोटो पार से जोड़ने
- पार से जोड़ने की प्रतिक्रियाओं, एक पार से जोड़ने और शमन अभिकर्मकों तैयार की जरूरत के लिए HFIP इलाज पेप्टाइड्स solubilizing से पहले.
- अमोनियम persulfate वजन (ए पी एस, श्री 228.2 छ / mol) और 10 मिमी सोडियम फास्फेट, 7.4 पीएच में एक 20 मिमी समाधान तैयार है. एक भंवर का उपयोग मिक्स जब तक समाधान स्पष्ट है.
- 10 मिमी सोडियम फास्फेट, 7.4 पीएच में 1 मिमी Tris के समाधान (2,2 bipyridyl) dichlororuthenium hexahydrate (द्वितीय) (RuBpy, श्री 748.63 छ / mol) तैयार करें. एक भंवर का उपयोग मिक्स और पूरा विघटन की पुष्टि. एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से ट्यूब को सुरक्षित रखें.
- एसडीएस पृष्ठ के पार से जोड़ने के बाद विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक शमन अभिकर्मक 2 में 5% β-mercaptoethanol × एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर. एक वैकल्पिक रूप से एम dithiothreitol (डीटीटी, श्री 154.5 छ / mol) विआयनीकृत जल या एक उपयुक्त बफर में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- HFIP इलाज पेप्टाइड फिल्मों पतला NaOH पहला में भंग कर रहे हैं और फिर सोडियम फॉस्फेट बफर ~ 30 सुक्ष्ममापी पेप्टाइड एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ा जाता है. जोड़ें 60 मिमी NaOH पेप्टाइड फिल्म ऐसी है कि NaOH और पानी के 10 और अंतिम मात्रा का 45%, क्रमशः गठन युक्त ट्यूब में विआयनीकृत जल द्वारा पीछा किया. Microfuge ट्यूब के अंदर की दीवारों टिप, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण है, और एक sonicator पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए sonicate का उपयोग बंद पेप्टाइड फिल्म परिमार्जन.
- 45% 20 मिमी सोडियम फास्फेट, 7.4 पीएच, pipetting द्वारा मिश्रण है, और 10 मिनट के लिए 16,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र जोड़ें. Uncross से जुड़े नकारात्मक नियंत्रण के लिए शमन अभिकर्मक के साथ मिश्रित पेप्टाइड्स के अलग सेट aliquots.
- 1 एस करने के लिए कैमरा शटर देरी समायोजित उच्च विकिरण समय में, व्यापक कट्टरपंथी प्रतिक्रियाओं प्रोटीन गिरावट का कारण हो सकता है. लोड कैमरा शटर. किरणन समय जब एक नए प्रोटीन के साथ विधि का उपयोग कर अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है.
- एक ठेठ पीआईसीयूपी प्रतिक्रिया एक 20 μl प्रतिक्रिया मात्रा में किया जाता है. एक पतली दीवारों, स्पष्ट, 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में पेप्टाइड समाधान के 18 μl स्थानांतरण.
- पेप्टाइड समाधान करने के लिए, एक μl 1 μl ए पी एस के द्वारा पीछा RuBpy जोड़ने और pipetting (प्रतिक्रिया मिश्रण में RuBpy और ए पी एस के अंतिम एकाग्रता 0.05 और 1 मिमी, क्रमशः हो जाएगा) द्वारा अभिकर्मकों मिश्रण.
- जल्दी प्रतिक्रिया में एक गिलास 1.8 एमएल शीशी के अंदर ट्यूब जगह है. कैमरे के शरीर के सामने में संलग्न धौंकनी अंदर शीशी रखें. लेंस रक्षक संलग्न और इतना कि धौंकनी अंदर एक एस के लिए नमूना है विकिरणित शटर प्रेस.
- नमूना विकिरण के बाद, जल्दी शीशी बाहर ले धौंकनी और पीसीआर ट्यूब की शीशी से बाहर. जल्दी 1 μl डीटीटी या 10 μl कम करने PAGE नमूना बफर जोड़ने के द्वारा प्रतिक्रिया बुझाना. दोहराएँ प्रत्येक पेप्टाइड विभाज्य के लिए प्रतिक्रिया.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण भंडारण के लिए अब 7 दिनों की तुलना में अब या एसडीएस पृष्ठ और चांदी धुंधला द्वारा विश्लेषण से पहले बर्फ पर रखा के लिए कर सकते हैं जमे हुए किया जा.
3. एसडीएस पृष्ठ और ज़ुल्फ़ धुंधला हो जानापार से जुड़े पेप्टाइड उत्पादों की
- एसडीएस PAGE नियमित और चांदी धुंधला पार से जुड़े पेप्टाइड्स कल्पना प्रदर्शन कर रहे हैं.
- ~ लेन प्रति पेप्टाइड के 130 pmol को प्राप्त करने के लिए लेन के प्रति प्रतिक्रिया मिश्रण के 5 μl लोड.
- तुलना के लिए uncross से जुड़े पेप्टाइड्स के समान मात्रा में शामिल करें. इसके अलावा पेप्टाइड बैंड के आणविक वजन के दृश्य सन्निकटन के लिए एक मानक सीढ़ी प्रोटीन शामिल हैं.
- भागो जेल का उपयोग एक मानक जेल वैद्युतकणसंचलन तंत्र. हम Invitrogen से XCell SureLock मिनी सेल प्रणाली का उपयोग करें और Invitrogen प्रकाशन IM-1002, Novex प्री - कास्ट जेल वैद्युतकणसंचलन गाइड के अनुसार चांदी धुंधला प्रदर्शन.
भाग 4: प्रतिनिधि के परिणाम (चित्रा 1)
चित्रा 1: चांदी से सना हुआ polyacrylamide uncross से जुड़े दिखा जैल (-) और फोटो पार से जुड़े (+) GRF, कैल्सीटोनिन, Aβ40, और Aβ42
एसडीएस पृष्ठ और पीआईसीयूपी उत्पन्न Aβ40 oligomers की चांदी धुंधला विश्लेषण monomer के लगभग इसी तरह tetramer के माध्यम से बैंड तीव्रता, उच्च 7 oligomers का बहुतायत में तेज कमी के द्वारा बाद दिखा. Uncross से जुड़े Aβ40 7 monomer के साथ एक संगत श्री के साथ migrates . Aβ42 एक अलग oligomer आकार के वितरण से पता चलता है. Aβ42 oligomers 2-3 8 समूहों में शामिल हैं. पहले समूह, trimer माध्यम monomer, बढ़ती oligomer आदेश के साथ तीव्रता को कम प्रदर्शित करता है. दूसरे समूह में, एक गाऊसी - तरह वितरण tetramer और heptamer के बीच मनाया जाता है पर pentamer है और hexamer एक अधिकतम के साथ. तीसरे समूह है, जो यहाँ नहीं दिखाया गया है श्री ~ 30,000-60,000 8 दा की oligomers शामिल हैं . इन उच्च श्री oligomers आमतौर पर एसईसी - पृथक Aβ42 LMW का उपयोग करने के लिए मनाया जाता है, लेकिन नहीं पेप्टाइड निस्पंदन या HFIP 6 उपचार द्वारा तैयार. Aβ42 Uncross से जुड़े मुख्य रूप से दो बैंड, एक monomer के बैंड और एक व्यापक बैंड / trimer tetramer, जो एक 5,9 एसडीएस द्वारा प्रेरित मूर्ति है पैदा करता है. कैल्सीटोनिन पैदावार एक oligomer आकार वितरण है कि जोरदार tetramer के माध्यम से क्षेत्र monomer में एक नीरस घातीय कमी से diverges, dimers, trimers, और 7 tetramers के पूर्व अस्तित्व का सुझाव दे. नियंत्रण पॉलीपेप्टाइड, GRF, एक monotonic oligomer ऐसी है कि oligomers का स्पष्ट रिश्तेदार मात्रा बढ़ती आणविक जन के साथ तेजी से कमी hexamer के माध्यम से डिमर से लेकर वितरण पैदा करता है. अन्य प्रयोगों में, उच्च oligomers भी 7 visualized किया जा सकता है . सही संख्या और oligomer बैंड के रिश्तेदार तीव्रता कुछ वास्तविक प्रोटीन एकाग्रता, प्रोटीन की मात्रा जेल पर लोड, और चांदी धुंधला प्रोटोकॉल में विकास के कदम के लिए प्रयोग किया जाता समय पर निर्भर करता है प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकते हैं.
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Discussion
पीआईसीयूपी मूल स्थिर प्रोटीन परिसरों 2 अध्ययन के लिए विकसित किया गया था. विधि metastable amyloid प्रोटीन सहित 10 Aβ, और रोग संबद्ध prion PRP 11 एससी, और α-synuclein 12 विधानसभाओं, मात्रात्मक अध्ययन के बाद लागू किया गया था. सबसे महत्वपूर्ण कारक है कि जब एक पीआईसीयूपी प्रयोग डिजाइनिंग विचार किया जाना चाहिए अभिकर्मक stoichiometry, विकिरण समय और नमूना तैयार करने की प्रक्रिया कर रहे हैं. पूर्व दो मुद्दों अनुभवजन्य अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जबकि बाद मुद्दा काफी हद तक प्रयोगात्मक डेटा की व्याख्या को प्रभावित करता है हो सकता है. विशेष रूप से amyloidogenic प्रोटीन के लिए, metastable oligomers के आकार के वितरण का निर्धारण कुल मुक्त शुरू करने की तैयारी का उपयोग कर की आवश्यकता है. पृष्ठभूमि, तंत्र, इंस्ट्रूमेंटेशन, प्रोटोकॉल, अनुकूलन, गुंजाइश, संशोधनों, अनुप्रयोगों, और पीआईसीयूपी की सीमाओं पिछले 1,2,13 प्रकाशनों में शामिल थे. पीआईसीयूपी स्थिर, घुलनशील प्रोटीन oligomers उत्पन्न कि निम्नलिखित fractionation और शुद्धि, संरचनात्मक अध्ययन, cytotoxicity assays, oligomerization निषेध अध्ययन, और आणविक मान्यता टूल्स के विकास के लिए लक्ष्य के रूप में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Acknowledgments
यह काम AG027818 अनुदान और लैरी एल Hillblom फाउंडेशन, IIRG-07-58,334 अल्जाइमर एसोसिएशन से, और सार्वजनिक स्वास्थ्य के कैलिफोर्निया विभाग से 07-65798 से AG030709 NIH / एनआईए, 2005/2E से के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
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