Summary
Foto-inducido de entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) permite la caracterización de la distribución del tamaño de oligómero de mezclas de proteínas metaestable. Se demuestra la aplicación de picup a tres péptidos representante amiloidogénica los 40 - y 42-residuo forma de amiloide β-proteína, y la calcitonina, y un péptido de control de la hormona del crecimiento factor de liberación.
Abstract
El ensamblaje de las proteínas amiloidogénica en oligómeros tóxicos es un acontecimiento fundamental en la patogénesis de las enfermedades de mal plegamiento de proteínas, como el Alzheimer, el Parkinson y las enfermedades de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica hereditaria, y la diabetes tipo 2. Debido a la naturaleza metaestable de estos conjuntos de proteínas, es difícil evaluar su distribución de tamaño de oligómero cuantitativamente mediante los métodos clásicos, como la electroforesis, cromatografía de dispersión de la luz, fluorescencia, o dinámica. Oligómeros de proteínas amiloidogénica existen como mezclas metaestable, en el que los oligómeros se disocian en monómeros y asociarse en grandes asambleas de forma simultánea. Picup estabiliza la población oligómero por covalentes entrecruzamiento y cuando se combina con los métodos de fraccionamiento, como la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) o el tamaño de cromatografía de exclusión (SEC), ofrece picup instantáneas de la distribución de oligómeros de tamaño que existía antes de cruzar -linking. Por lo tanto, picup permite la visualización y el análisis cuantitativo de las poblaciones de proteínas metaestable y puede ser usado para monitorear el montaje y descifrar las relaciones entre las modificaciones de la secuencia y oligomerización
Protocol
1. Péptido de preparación
- Pesar ~ 100-200 mg de péptido liofilizado usando una microbalanza y la transferencia en la etiqueta, revestido con silicio, tubos de microcentrífuga de baja adsorbente. Aquí, nosotros usamos las secuencias humanas de Aβ40, Aß42, calcitonina y GRF.
- Aquí, nosotros usamos los péptidos pre-tratados con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obtener homogénea, global sin preparativos. Este paso es necesario porque preformados agregados inducir la agregación de las proteínas de rápida amiloidogénica, que se traducen en una mala reproducibilidad entre los experimentos 5. Otros métodos como la filtración y la SEC también se puede utilizar para obtener agregados sin los preparativos para picup 6.
- Para el tratamiento de los péptidos con HFIP, pre-enfriar el contenedor de hielo dentro de HFIP en una campana de extracción usando la protección adecuada (HFIP es volátil y tóxico). De enfriamiento de un envase de 250 ml por lo general requiere 10-15 min. Añadir HFIP de pre-enfriado tubos que contienen péptidos liofilizados para obtener una concentración de péptido nominal de 0,5 mM.
- Sonicar las soluciones de péptidos en un sonicador de baño de María durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Vortex suavemente e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Enfriar los tubos en hielo (durante 1 minuto), y dividir las soluciones en 10-50-l alícuotas de 0,6 ml etiquetados bajo adsorbente tubos.
- Quitar HFIP por evaporación bajo una corriente ligera de nitrógeno, o dejar los tubos abiertos en la campana de humos durante la noche. Para la evaporación durante la noche, se colocan los tubos abiertos en un estante y los cubren con una hoja grande de Kimwipes para evitar el polvo y la contaminación de partículas.
- Desecar el HFIP restantes en el vacío en un liofilizador, o un concentrador centrífugo durante 30 minutos, o en un desecador conectado a una toma de aspiración de 2 h. El producto final será una película de péptidos en la parte inferior de los tubos de microcentrífuga. Si bien exsiccated, los tubos se pueden almacenar hermético durante períodos prolongados (meses) a -20 o -80 ° C.
2. Solubilización de los péptidos HFIP tratados y foto entrecruzamiento
- Antes de solubilización de los péptidos HFIP tratados por reacciones de reticulación, es necesario preparar el cross-linking y reactivos de enfriamiento.
- Pesar persulfato de amonio (APS, el Sr. 228,2 g / mol) y preparar una solución 20 mM de fosfato sódico 10 mM, pH 7,4. Mezclar con un agitar hasta que la solución es clara.
- Prepare una solución mM de Tris (2,2-bipiridilo) dichlororuthenium (II) hexahidratado (RuBpy, el Sr. 748,63 g / mol) en fosfato sódico 10 mM, pH 7,4. Mezclar con un vórtice y verificar su completa disolución. Proteger el tubo de la luz con papel de aluminio.
- Para el análisis de SDS-PAGE siguientes enlaces cruzados, un reactivo de enfriamiento conveniente es de 5% β-mercaptoetanol en 2 × SDS-PAGE muestra de amortiguación. Por otra parte, un M ditiotreitol (DTT, el Sr. 154,5 g / mol) en agua desionizada o un tampón adecuado se puede utilizar.
- HFIP tratados con películas péptido se disolvió en NaOH diluido y luego tampón fosfato de sodio se agrega para obtener ~ 30 mM concentración de péptido. Añadir 60 mM NaOH seguido de agua destilada en el tubo que contiene la película péptido de tal manera que NaOH y el agua constituyen el 10 y el 45% del volumen final, respectivamente. Raspe la película de péptidos de las paredes en el interior del tubo de microcentrífuga con la punta, mezclar con la pipeta hacia arriba y abajo, y someter a ultrasonidos durante 5 minutos en un baño de ultrasonidos en baño María.
- Añadir un 45% fosfato sódico 20 mM, pH 7,4, mezclar con la pipeta, y se centrifuga a 16.000 g durante 10 minutos. Dejar de lado alícuotas de descruzar vinculados péptidos se mezcla con el reactivo de enfriamiento en los controles negativos.
- Ajuste el obturador de la cámara de retardo de 1 s. En tiempos de irradiación más alta, amplia reacciones de los radicales puede causar la degradación de proteínas. Cargar el obturador de la cámara. Tiempo de irradiación posible que tenga que ser optimizada al utilizar el método con una nueva proteína.
- Una reacción típica picup se lleva a cabo en un volumen de reacción de 20 microlitros. Transferencia de 18 l de la solución de péptidos en una pared delgada, transparente, de 0,2 ml tubo de PCR.
- Para la solución de péptido, agregue 1 RuBpy l seguido de un APS l y mezclar los reactivos con pipeta (la concentración final de RuBpy y APS en la mezcla de reacción de 0.05 y 1 mM, respectivamente).
- Rápidamente coloque el tubo de reacción dentro de un frasco de vidrio de 1,8 ml. Coloque el vial en el interior del fuelle conectado por delante de la cámara. Coloque el protector del objetivo y pulse el disparador para que la muestra se irradia durante 1 s en el interior del fuelle.
- Después de la irradiación de la muestra, rápidamente retire el vial del fuelle y el tubo de PCR de la ampolla. Rápidamente detener la reacción mediante la adición de una TDT l ó 10 l de amortiguación reduciendo página de muestra. Repita la reacción de cada alícuota de péptidos.
- Las mezclas de reacción ya se puede congelar a -20 ° C para el almacenamiento de no más de 7 días o se mantienen en hielo antes de su análisis por SDS-PAGE y tinción con plata.
3. SDS-PAGE y tinción astilla-de los productos péptido reticulado
- Rutina de SDS-PAGE y tinción con plata-se realiza para visualizar reticulado péptidos.
- Carga de 5 l de la mezcla de reacción por carril para obtener ~ 130 pmol de péptido por carril.
- Incluyen cantidades similares de descruzar vinculados péptidos para la comparación. También incluye una escalera de proteínas estándar de aproximación visual de un peso molecular de las bandas de péptidos.
- Ejecute el gel usando un aparato de electroforesis en gel estándar. Usamos la XCell SureLock Mini-célula del sistema de Invitrogen y realizar la tinción de plata de acuerdo a la publicación Invitrogen IM-1002, Novex Pre-Cast electroforesis en gel.
Parte 4: Los resultados representativos (Figura 1)
Figura 1: plata manchada geles de poliacrilamida que muestra descruzar vinculados (-) y foto-reticulado (+) GRF, la calcitonina, Aβ40 y Aß42
SDS-PAGE y tinción de plata-análisis de picup generado Aβ40 oligómeros muestran intensidades de las bandas de aproximadamente similares de monómero a través de tetrámero, seguido por una fuerte disminución en la abundancia de oligómeros superiores 7. Descruzar vinculados Aβ40 migra con un consistente con la de monómero 7 señor. Aß42 muestra una distribución de oligómeros de tamaño distinto. Aß42 oligómeros comprenden grupos de 2-3 8. El primer grupo, a través de monómero trímero, muestra disminución de la intensidad con el fin de oligómeros en aumento. En el segundo grupo, una distribución de Gauss-como se observa entre tetrámero y heptamer, con un máximo de pentámero y hexámero. El tercer grupo, que no se muestra aquí, contiene oligómeros de Mr ~ 30.000-60.000 Da 8. Estos oligómeros superiores señor general, cuando se utilice SEC-LMW Aß42 aislados, pero no péptido preparado por filtración o tratamiento HFIP 6. Descruzar vinculados a Aß42 produce principalmente dos bandas, una banda de monómero y un amplio trimer / tetrámero banda, que es un artefacto inducido por SDS 5,9. La calcitonina se obtiene una distribución de tamaño de oligómero que difiere fuertemente de una disminución monótona exponencial de la región a través de monómero tetrámero, lo que sugiere la pre-existencia de dímeros, trímeros, tetrámeros y 7. El control de polipéptidos, GRF, produce una distribución de oligómeros monótona desde dímeros a través de hexamer de tal manera que las cantidades relativas de oligómeros aparente disminuye exponencialmente con el incremento de la masa molecular. En otros experimentos, los oligómeros superiores también pueden ser visualizados 7. El número exacto y la intensidad relativa de las bandas de oligómero pueden variar entre los experimentos en función de la concentración de proteínas reales, la cantidad de proteína cargada en el gel, y el tiempo empleado en la etapa de desarrollo en el protocolo de tinción de plata.
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Discussion
Picup fue desarrollado originalmente para estudiar complejos estables de proteínas 2. El método fue aplicado más tarde para el estudio cuantitativo de las asambleas metaestable proteína amiloide, incluyendo Aß 10, priones y las enfermedades asociadas a PrP Sc 11, y α-sinucleína 12. Los factores más importantes que deben considerarse al diseñar un experimento picup son la estequiometría reactivo, tiempo de irradiación, y el procedimiento de preparación de la muestra. Las dos primeras cuestiones pueden exigir una optimización empírica, mientras que esta última cuestión afecta principalmente a la interpretación de los datos experimentales. Para las proteínas amiloidogénica en particular, la determinación de la distribución de tamaño de los oligómeros metaestable requiere el uso de agregados sin iniciar los preparativos. El fondo, el mecanismo, la instrumentación, el protocolo, la optimización, el alcance, las modificaciones, las aplicaciones y limitaciones de picup fueron cubiertos en publicaciones anteriores 1,2,13. Picup se puede utilizar para generar oligómeros estables, proteína soluble que el fraccionamiento y purificación siguientes, podrían ser utilizados para estudios estructurales, ensayos de citotoxicidad, estudios de inhibición de oligomerización, y como objetivos para el desarrollo de herramientas moleculares de reconocimiento.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas y AG027818 AG030709 de NIH / NIA, 2005/2E de Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 de la Asociación de Alzheimer, y 07-65798 de California Departamento de Salud Pública.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
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