Summary
Foto-bağlı çapraz bağlama değiştirilmemiş proteinleri (PICUP) metastabil protein karışımları oligomer boyutu dağılımı karakterizasyonu sağlar. Biz üç temsilci amiloidojenik peptidler 40 PICUP uygulama göstermektedir - ve 42-amiloid β-protein ve kalsitonin kalıntı formları ve kontrol peptid büyüme hormonu salgılatıcı faktör.
Abstract
Toksik oligomerler amiloidojenik proteinlerin montaj protein misfolding hastalıkları, Alzheimer, Parkinson ve Huntington hastalıkları, kalıtsal Amyotrofik lateral skleroz, ve tip 2 diyabet patogenezinde yeni ufuklar açan bir olaydır. Bu protein meclislerinin metastabil yapısı sayesinde, elektroforez, kromatografi, floresan veya dinamik ışık saçılımı gibi klasik yöntemlerle kantitatif oligomer boyutu dağılımını değerlendirmek için zordur. Amiloidojenik proteinlerin Oligomerleri oligomerler monomerlerin ilgimiz büyük meclisleri içine aynı anda ilişkilendirmek metastabil hangi karışımlar var. PICUP çapraz önce varolan oligomer boyutu dağılımları kovalent çapraz bağlama ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ya da boyut dışlama kromatografisi (SEC) gibi fraksiyon yöntemleri ile kombine edildiğinde, PICUP sağlar anlık görüntülerini oligomer popülasyonları stabilize bağlama. Bu nedenle, PICUP metastabil protein popülasyonlarının görselleştirme ve kantitatif analiz sağlar ve montaj ve deşifre dizisi değişiklikler ve oligomerization arasındaki ilişkileri izlemek için kullanılabilir
Protocol
1. Peptid hazırlık
- Etiketli, silikon kaplı, düşük adsorban mikrofuge'de tüpler içine mikro ve transfer kullanarak liyofilize peptid yaklaşık 100-200 mg tartılır. Burada, insan Aβ40, dizileri, Aβ42, kalsitonin ve GRF kullanın.
- Burada, peptidler 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) ile homojen, toplam hazırlıkları elde etmek için ön tedavi kullanın. Önceden oluşmuş agrega deneyleri 5 arasında kötü tekrarlanabilirlik neden amiloidojenik proteinlerin hızlı agregasyonu, neden çünkü bu adım gereklidir. Filtrasyon ve SEC gibi diğer yöntemleri de agrega-PICUP 6 için hazırlıklarını elde etmek için kullanılabilir.
- HFIP ile peptitler tedavi için yeterli koruma (HFIP uçucu ve zehirli) giyen bir davlumbaz içinde buz üzerinde HFIP konteyner ön soğutun. 250 ml şişe soğutma genellikle 10-15 dakika gerektirir. Peptid lyophilizates içeren 0,5 mM nominal peptid konsantrasyonu elde etmek için önceden soğutulmuş tüplere HFIP ekleyin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir su banyosu sonikatör peptid çözümler sonikasyon.
- Yavaşça vorteksleyin ve tüpler oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Buz (1 dakika için) tüpler Chill ve 10-50-ul alikotları etiketli 0.6 ml az emici tüplerin içine çözümler bölmek.
- Nazik bir azot akımı altında buharlaşma HFIP çıkarın, ya da gece davlumbaz tüpleri açık bırakın. Gecede buharlaşma için, açık tüpleri rafa yerleştirin ve Kimwipes toz ve partikül kontaminasyonu engellemek için büyük bir levha ile onları karşılamak.
- , Bir lyophilizer vakumlu kalan HFIP, ya da 30 dakika santrifüj konsantratör Exsiccate ya da 2 saat süreyle bir vakum girişine bağlı bir exsiccator Nihai ürün mikrofuge'de tüplerin alt kısmında bir peptid film olacak. Eğer düzgün exsiccated, tüpler -20 veya -80 ° C, uzun süre (ay) hava geçirmeyen saklanabilir.
2. HFIP ile tedavi edilen peptitler çözücü ve fotoğraf çapraz bağlama
- Çapraz bağlama reaksiyonlar, çapraz bağlama ve soğutma reaktifler hazırlamak için bir ihtiyacı için HFIP ile tedavi edilen peptitler çözülebilmesinde önce.
- Amonyum persülfat tartılır (APS, Sayın 228,2 g / mol) ve 10 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 20 mM solüsyon hazırlanır. Çözüm netleşene kadar bir vorteks ile karıştırın.
- 10 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 1 mM çözüm Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hekzahidrat (RuBpy, Bay 748,63 g / mol) hazırlayın. Bir vorteks ile karıştırın ve tam dağılması doğrulamak. Tüp alüminyum folyo kullanarak ışık koruyun.
- Çapraz bağlama sonrası SDS-PAGE analizi için uygun bir ısıl işlem reaktif% 5 β-mercaptoethanol 2 × SDS-PAGE numune tamponu. Alternatif olarak, 1 M dithiothreitol (DTT, Bay 154.5 g / mol) deiyonize su veya uygun bir tampon kullanılabilir.
- HFIP ile tedavi edilen peptid filmler seyreltik NaOH ilk çözülür ve daha sonra sodyum fosfat tamponu ~ 30 mcM peptid konsantrasyonu elde etmek için eklenir. Ekle 60 mM NaOH, NaOH ve su sırasıyla 10 ve% 45, son hacim teşkil ettiğini gibi peptid film içeren tüpe deiyonize su ile izledi. Ucu, yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın ve bir su banyosunda sonikatör 5 dakika boyunca sonikasyon kullanarak mikrofuge'de tüp iç duvarları kapalı peptid filmi Pençe.
- 45% 20 mM sodyum fosfat, pH 7.4, pipetleme ile karıştırın ve 10 dakika 16.000 g de santrifüj ekleyin. Negatif kontrol için su verme reaktifi ile karışık çizgilerini iptal bağlantılı peptidler hacimde bir kenara koyun.
- 1 s kamera deklanşör gecikmesi ayarlayın. Yüksek ışınlama zamanlarda, geniş radikal reaksiyonlar protein düşmesine neden olabilir. Fotoğraf makinesi obtüratör yükleyin. Işınlama süresi yeni bir protein ile yöntemi kullanılarak optimize edilmesi gerekebilir.
- Tipik bir PICUP reaksiyonu 20 ul reaksiyon hacmi yapılır. Peptid çözüm 18 ul açık, ince duvarlı, 0.2 ml PCR tüpü içine aktarın.
- Peptid çözüm için, 1 1 ul APS takip ul RuBpy ekleyin ve reaktifler pipetleme (reaksiyon karışımı RuBpy ve APS son konsantrasyonu 0.05 ve 1 mM, sırasıyla olacak) karıştırın.
- Reaksiyon tüpü 1.8 ml'lik cam flakon içinde hızlı bir şekilde yerleştirin. Kamera gövdesi önünde bağlı körük içindeki şişe yerleştirin. Lens koruyucusu takın ve örnek körük içinde 1 sn için ışınlanmış, böylece deklanşöre basın.
- Örnek ışınlama sonra, hızla flakon flakon körük ve PCR tüp almak. 1 ul DTT ya da 10 ul azaltarak SAYFA numune tamponu ekleyerek reaksiyon hızla gidermek. Reaksiyon peptid her kısım için tekrarlayın.
- 7 günden daha uzun ya da SDS-PAGE ve gümüş boyama ile analizden önce buz üzerinde tutulmalıdır tepkime saklama için -20 ° C'de dondurulur.
3. SDS-PAGE ve şerit boyamaçapraz bağlı peptid ürünleri
- Rutin SDS-PAGE ve gümüş boyama çapraz bağlı peptidler görselleştirmek için yapılmaktadır.
- ~ 130 pmol her kulvar için peptid elde etmek için her kulvar için reaksiyon karışımı 5 ul yükleyin.
- Karşılaştırma için benzer miktarlarda çizgilerini iptal bağlantılı peptitler içerir. Ayrıca peptid bantları moleküler ağırlığı görsel yaklaşım için standart bir protein merdiven içerir.
- Standart bir jel elektroforez cihazları kullanırken jel çalıştırın. Biz Invitrogen XCell SureLock Mini-Hücre sistemi kullanımı ve Invitrogen yayın IM-1002, Novex Pre-Cast Jel Elektroforez Kılavuzu göre gümüş boyama gerçekleştirmek.
Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları (Şekil 1)
Şekil 1: çizgilerini iptal-bagli gösteren gümüş lekeli poliakrilamid jeller (+ -) GRF, kalsitonin, Aβ40 ve Aβ42 ve foto-çapraz bağlı ()
SDS-PAGE ve PICUP oluşturulan Aβ40 oligomerler gümüş boyama analizleri yüksek oligomerler 7 bolluk içinde keskin bir düşüş takip tetramer yoluyla monomer yaklaşık benzer bant yoğunlukları göstermektedir. Çizgilerini iptal bağlı Aβ40 monomer 7 ile tutarlı bir Bay ile geçirir. Aβ42 ayrı bir oligomer boyut dağılımı gösterir. Aβ42 oligomerler 2-3 8 grupları oluşturmaktadır. Birinci grup, trimer yoluyla monomer, artan oligomerlerdir sipariş ile azalan yoğunluk gösterir. İkinci grupta ise, bir Gauss dağılımı, pentamer ve hexamer maksimum tetramer ve heptamer arasında görülmektedir. Burada gösterilen üçüncü grup, Bay ~ 30,000-60,000 Da 8 oligomerler içerir. Bu yüksek Bay oligomerler genellikle SEC izole LMW Aβ42 kullanarak gözlenen ama peptid filtrasyon veya HFIP tedavisi 6 tarafından hazırlanmıştır. Çizgilerini iptal-bağlantılı Aβ42 ağırlıklı olarak iki grup, bir monomer bant ve 5,9 SDS tarafından uyarılan bir eserdir, geniş bir trimer / tetramer bant, üretir. Kalsitonin dimerleri, trimerler ve tetramers 7 pre-varlığını düşündüren, tetramer yoluyla bölge monomer monoton bir üstel azalma uzaklaşmakta oligomer boyutu dağılımı verir. Kontrolü polipeptid, GRF, dimer oligomerlerinin belirgin göreceli miktarları ile katlanarak artan moleküler kütlesi azaldığı gibi hexamer kadar monoton oligomer dağıtım üretir. Diğer deneylerde, yüksek oligomerler görüntülenmiştir 7 de olabilir. Tam sayısı ve göreceli yoğunlukları oligomer bantları biraz gerçek protein konsantrasyonu, jel yüklenen protein miktarı, ve gümüş boyama protokol geliştirme adım için kullanılan zaman bağlı olarak deneyler arasında değişebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PICUP, istikrarlı bir protein kompleksleri 2 çalışma ilk geliştirilmiştir . Aβ 10, prion hastalığı ile ilişkili PrP Sc 11 ve α-sinüklein 12 metastabil amiloid protein meclisleri, kantitatif çalışma yöntemi uygulandı. PICUP Deney tasarlama dikkate alınması gereken en önemli faktörler, reaktif stokiyometri, ışınlama süresi ve numune hazırlama prosedürü. Ikinci sorun, büyük ölçüde deneysel verilerin yorumlanması etkiler ise eski iki konu, deneysel optimizasyon gerekebilir. Özellikle amiloidojenik proteinlerin metastabil oligomerlerinin boyutu dağılımları belirlenmesi agrega-başlangıç hazırlıkları kullanmayı gerektirir. Arka plan, mekanizma, enstrümantasyon, protokol, optimizasyon, kapsamı, değişiklikler, uygulamalar, ve PICUP sınırlamaları önceki yayınlar 1,2,13 kaplıydı. PICUP aşağıdaki fraksiyonasyon ve saflaştırma, yapısal çalışmalar, sitotoksisite deneyleri, oligomerization-inhibisyon çalışmaları ve moleküler tanıma araçları geliştirme gibi hedefler için kullanılan olabilir, istikrarlı, çözünür protein oligomerler oluşturmak için kullanılan olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, California Halk Sağlığı Bölümü'nden Larry L. Hillblom Alzheimer Derneği Vakfı, IIRG-07-58.334 ve 07-65798 NIH / NIA, 2005/2E AG027818 ve AG030709 hibe ile desteklendi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
