Summary
Мы представляем способ генерации кДНК из экологических мРНК. В целом, общая РНК впервые собраны из окружающей среды, рРНК выборочно удалить, мРНК селективно усиливается, и кДНК синтезировали из пула мРНК обогащенного последовательности. Восстановленные последовательности могут быть аннотированный биоинформатики с использованием стандартных методов выявления выразил генов.
Abstract
По аналогии с metagenomics, экологические транскриптомику (metatranscriptomics) получает и последовательностей мРНК из экологических микробных сборки без предварительного знания того, что гены сообщество могло бы быть выражение. Таким образом он обеспечивает самый объективный взгляд на сообщество экспрессии генов
Protocol
Работа с РНК
Потому что РНКаз вездесущи и мРНК быстро разлагаться, стандартные меры предосторожности при работе в рибонуклеазы среде, свободной должны соблюдаться и образцы должны быть обработаны и сохранены как можно скорее после сбора.
Часть 1: Экологическая РНК Collection (предназначен для сбора биомассы в 0.2-3,0 мкм размер доли)
Поставки необходимо:
Masterflex трубы
Перистальтический насос
3 мкм большой объем гофрированный фильтр капсулы
0,22 мкм Supor или поликарбоната 142 мм фильтр
142 мм фильтр башня (Geotech экологического оборудования)
10-20 л Карбоя (окончил)
Вихрь пакеты
Жидкий азот
RLT буфер (Qiagen)
Бета-меркаптоэтанол
Установка:
Чистая перчатки всякий раз, когда обработка фильтров или соприкасается ни с какими внутренних компонентов фильтра линии. Пинцет следует хранить в чистых, 50 мл конические пробирки, желательно заполнить с этанолом. Для предотвращения серьезных изменений в стенограмме бассейн, держать фильтрации и обработки проб раз как можно короче.
Поместите один конец трубки в воду на нужную глубину для отбора проб. На противоположном конце, прикрепите большой объем 3 мкм. Подключение 3 мкм фильтр 0,22 мкм фильтр башни. Прямой отток из 0,22 мкм в окончила бутыль.
Порядок действий:
- Выполните несколько литров воды через систему (не 0,22 мкм фильтр) для полоскания. Когда закончите, удалите трубки от воды, а насос работает, чтобы очистить остатки воды из линии.
- Использование щипцов, место 0,22 мкм фильтра на фильтр башни и близко.
- Место конце строки обратно в воду и включить насос. Чистки воздуха от обоих фильтров. Монитор объем воды фильтруют с окончания на бутыль.
- Когда желаемый объем был отфильтрован, удалить строку из воды и очистки остатки воды из системы.
- Как только фильтр сухой, быстро удалить верхний фильтр пластину и загнуть фильтр. Место фильтр в пакет вихрь или 15 мл трубки коллекцию, содержащую 2 мл буфера RLT с бета-меркаптоэтанола. Привязка заморозить в жидком азоте.
Часть 2: Total добычи РНК от 0,22 мкм фильтр
Эта часть используется QIAGEN RNeasy мини-комплект с изменениями в инструкции производителя
- Подготовка бусинка избиения труб путем добавления 8 мл буфера RLT (бета-меркаптоэтанол добавлено) в 50 мл коническую трубку. Добавить 1-2 мл из бисера РНК из добычи комплект Mobio Powersoil
- Быстро удалить замороженные фильтр из морозильной камеры и, держа его в водоворот пакет, разбить его молотком. Кроме того, сократить фильтры на мелкие кусочки в пробирки (15 мл), используя стерильные лезвия бритвы и добавить все это на подготовленную трубу (50 мл).
- Добавить разрушенной фильтр на подготовленную трубу (50 мл), и уплотнение крышки с трубкой парафильмом или лаборатории ленты.
- Vortex в течение 10 минут на максимальной скорости, используя vortexer с приставкой для 50 мл труб.
- Центрифуга 50 мл трубки при 5000 оборотов в минуту в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Удалите как можно больше из лизата и перенести его на 15 мл трубки.
- Центрифуга 15 мл трубки в течение 5 мин при 5000 х г.
- Передача супернатант (~ 7 мл), 50 мл новые трубы.
- Добавить 1 объем (~ 7 мл) на 100% этанола на лизат.
- Использование 30 мл шприц, который вписывается в 50 мл трубки, рисовать лизат вверх через 18-21 иглы и передать его обратно ~ 5 раз. Когда закончите, оставьте лизат в шприце.
- Продолжить экстракции комплект QIAGEN RNeasy Mini. Это полезно использовать вакуумный коллектор здесь, так как лизат объема (~ 14 мл) намного выше, чем оригинал протокола комплект (0,7 мл). С другой стороны, лизат можно провести через добавлением 700 мкл на колонку, центрифугирование, и повторяя, пока все лизат был применен к колонке.
- Место спина колонке на вакуумном коллекторе и применять 700 мкл образца. Применение вакуума в многообразии перенести лизат. Продолжайте добавлять лизат из шприца, пока вся она была применена к колонке.
- Добавить 700 мкл буфера для RW1 колонки и перенести с вакуумным давлением.
- Добавить 500 мкл буфера для НПП колонки и перенести с вакуумным давлением.
- Добавьте второй аликвоту 500 мкл буфера для НПП колонки и перенести с вакуумным давлением.
- После мытья была полностью проведена через, удалите колонку и поместить в пробирку.
- Центрифуга трубки в течение 1 мин при 8000 х г. Отменить проточные.
- Центрифуга еще 2 мин при 8000 мкг, чтобы избавиться от этанола.
- Передача колонку на новую 2 мл коллеглекция трубки. Внесите 35 мкл РНКазы без воды непосредственно на мембране. Закрыть трубку и дать постоять в течение 1 мин.
- Центрифуга в течение 2 мин при 8000 х г.
- Количественная общей РНК спектрофотометрически.
Часть 3. ДНКазы лечения
Эта часть используется Амбион TURBO ДНК-бесплатный комплект в соответствии с инструкциями производителя
- Добавить 3,4 мкл 10x ДНКазы я буфера и 1 мкл rDNase я к образцу РНК.
- Инкубировать при 37 º C в течение 30 минут.
- Vortex реагента ДНКазы Инактивация и добавить 3,4 мкл реагента для инактивации образца.
- Инкубировать 2 мин при комнатной температуре с редкими смешивания.
- Спиновые в 10,000 мкг в течение 1,5 мин при комнатной температуре, а затем перенести супернатант в новую пробирку. Избегайте введения инактивации реагента в новую пробирку.
Часть 4. Первое удаление рРНК
Эта часть использует Эпицентр мРНК-ТОЛЬКО комплект в соответствии с инструкциями производителя
- Аккуратно перемешайте и кратко центрифуги мРНК-ТОЛЬКО 10X реакционный буфер перед использованием.
- В стерильные (без РНКазы) 0,5 мл трубки, объединять следующие компоненты реакции на льду:
мРНК-ТОЛЬКО 10X буфера реакции 2,0 мкл Ингибитор РНКазы 0,5 мкл Всего Пример РНК (200 нг-10 мкг) 16,5 мкл Терминатор экзонуклеазная (1 единица) 1,0 мкл Общий объем 20,0 мкл - Инкубируйте реакции при 30 ° С в течение 60 мин в амплификаторе (с подогревом крышкой) или водяной бане.
- Завершить реакции с фенолом / EtOH осадков:
- Добавить РНКазы без H2O до общего объема 200 мкл (= 180 мкл).
- Извлечение: фенол: хлороформ (1:1), 1 громкость (= 200 мкл). Vortex энергично, а затем спина 2-5 мин при максимальной скорости.
- Удалить водной фазе (~ 200 мкл).
- Добавить 0,1 объемами 3 М ацетата натрия (20 мкл) + 2,5 объеме 100% ледяной EtOH (500 мкл)
- Инкубировать при температуре -80 ° С в течение 15-30 мин.
- Гранул при 4 ° С, максимальная скорость, 30 мин; отметить положение трубки для последующего стремление образца (гранул может быть трудно понять).
- Удалите надосадочную с аспиратором или пипетки.
- Промыть 500 мкл 70% этанола ледяным холодом. Ресуспендируют на вортексе.
- Центрифуга течение 10 мин при максимальной скорости. Удалите супернатант.
- Центрифуга оставшуюся жидкость в трубке снова 10 мин при максимальной скорости.
- Аспирацию жидкости тщательно и сухие гранулы полностью, оставляя ее открытой для ~ 10 мин под капотом.
- Ресуспендируют в 15-20 мкл РНКазы без H2O (максимальный объем ввода MICROBExpress составляет 15 мкл); оставить на 5 мин при комнатной температуре.
- Используйте Bioanalyzer или Experion для проверки рРНК загрязнение и качество мРНК на этот шаг.
- Это потенциальная точка остановки. РНК может храниться при температуре -80 º C хранения.
Часть 5. Второе удаление рРНК
Эта часть используется Амбион MICROBEnrich и MICROBExpress комплектов в соответствии с инструкциями производителя. Оба комплекта можно использовать несколько раз, чтобы повысить эффективность эукариотических (MICROBEnrich) и прокариотических (MICROBExpress) рРНК удаления. Ввод общей РНК должна быть в пределах 2-10 мкг. Объем РНК должна быть не менее 15 мкл. Таким образом, идеальный вход> 150 нг / мкл. -
MICROBEnrich
- Внесите 300 мкл буфера для связывания в 1,5 мл трубки
- Добавить 5-100 мкг тотальной РНК в максимальный объем 30μl и вихревые мягко
- Добавить 2 мкл Смешать Захват Oligo на 5 мкг РНК в связывании буфера. Нажмите трубки осторожно и кратко спином вниз смеси.
- Денатурировать смеси при температуре 70 ° С в течение 10 мин
- Отжиг смеси при 37 ° С в течение 1 часа. Подготовка бисером в этот инкубации.
- Подготовка Oligo MagBeads (обычно 25 мкл) промывкой раз в нуклеазы без воды и один раз в буфере связывания, захватив бусины на магнитных стоять между стирок. Магазин бусин на льду. Теплый их до комнатной температуры за 5 минут до использования.
- Тепло Промывочный раствор до 37 ° С тепла, в блоке.
- Добавить РНК / захвата Oligo Mix, чтобы мыть MagBeads Oligo. Очень осторожно перемешать трубу и спина кратко.
- Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
- Поместите пробирку в магнитном стоять и ждать в течение ~ 3 мин.
- Аспирируйте супернатант (содержит мРНК) и передать его на пробирку на льду.
- Добавить 100 мкл подогретого Вымойте решение захватили бисером. Аккуратно вихрь бисером кратко. Захват бисером и восстановить супернатант. Бассейн этого супернатант с мРНК в пробирку на льду (~ 450 мкл конце).
- Место пробирку на льду. Если второй тур будет выполняться, вернитесь к 5,3) раздел и повторите процедуру. Кроме того, коммутатор немедленно MICROBExpress комплект (5,18, см. ниже).
- Используется OlioBeads может быть использована во второй раз. Восстановить Oligobeads путем инкубации их с 2-х томах (обычно 50 мкл) Регенерация Решение 1 в течение 1 часа. Захват бисером в магнитном стенде. Вымойте их в два раза с 2-х томах регенерации Решение 2 (обычно 50 мкл) и ресуспендируют в их первоначальный объем ресуспендирования раствор (обычно 25 мкл).
MICROBExpress - Внесите 200 мкл буфера для связывания в 1,5 мл трубки.
- Добавить 2-10 мкг тотальной РНК в максимальный объем 15μl и вихревые мягко.
- Добавьте 4 мкл Смешать Захват Oligo для связывания РНК в буфере. Нажмите трубки осторожно и кратко спином вниз смеси.
- Денатурировать смеси при температуре 70 ° С в течение 10 мин.
- Отжиг смеси при температуре 37 ° С в течение 15 мин Подготовка бисером в этот инкубации.
- Подготовка Oligo MagBeads промывкой раз в нуклеазы без воды, а затем на два моет в 50 мкл буфера для связывания, захватив бусины на магнитных стоять между стирок. Ресуспендируют бусины в 50 мкл буфера для связывания и инкубировать при 37 ° С до использования.
- Тепло Промывочный раствор до 37 ° С тепла, в блоке
- Vortex мыть Oligo MagBeads мягко. Добавить 50 мкл MagBeads Oligo к РНК / захвата Oligo Mix. Очень осторожно перемешать трубу и спина кратко.
- Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
- Поместите пробирку в магнитном стоять и ждать в течение ~ 3 мин.
- Аспирируйте супернатант (содержит мРНК) и передать его на пробирку на льду.
- Добавить 100 мкл подогретого Вымойте решение захватили бисером. Аккуратно вихрь бисером кратко.
- Захват бисером и восстановить супернатант. Бассейн этого супернатант с мРНК в пробирку на льду (~ 350 мкл конце).
- Если второй тур будет выполняться, вернитесь к разделу 5.18) и повторите процедуру. Кроме того, сразу же приступить к мРНК осадков.
- Осадок и ресуспендируйте мРНК:
- Для объединенных мРНК добавить 35 мкл ацетата натрия и добавить 7 мкл гликогена.
- Добавить 1175 мкл ледяной 100% этанола и вихревые тщательно.
- Осадка при температуре -20 ° С не менее 1ч.
- Центрифуга течение 30 мин при 10,000 х г.
- Тщательно слейте и выбросьте супернатант.
- Добавить 750 мкл ледяной 70% этанола и вихревые кратко.
- Центрифуга в течение 5 мин при 10,000 мкг и отбросить супернатант.
- У второго 70% этанола стирки.
- Кратко respin трубку после отбрасывания второго 70% этанола стирки.
- Осторожно удалите супернатант с пипеткой.
- Воздух сухой осадок в течение 5 мин.
- Ресуспендируют РНК гранул в 25 мкл ТЕ-буфера или РНКазы свободной воды
- Увлажняет РНК в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Vortex образец энергично, если необходимо.
- Если необходимо удалить остатки бисера, место трубки на магнитных выступаем за ~ 3 минуты и двигаться обогащенного мРНК к новым РНКазы свободной трубки.
- Используйте Bioanalyzer или Experion для проверки рРНК загрязнение и качество мРНК на этот шаг.
- Это потенциальная точка остановки. РНК может храниться при температуре -80 º C хранения.
Часть 6: Усиление мРНК
Эта часть используется Амбион MessageAmp II-Бактерии комплект в соответствии с инструкциями производителя. Рассчитать мастер смешивает в Интернете по адресу www.ambion.com/tools/ma2bact .
- Полиаденилирования шаблона РНК:
- Место до 1000 нг тотальной РНК (обычно 100-500 нг) или до 500 нг мРНК (как правило, 10 нг-200 нг) в стерильных РНКазы без микроцентрифужную трубки. Используйте 6,5 мкл образца и не РНКазы свободной воды в первом буфере.
- Инкубировать 10 мин при 70 ° С, предпочтительно в амплификаторе.
- Удалить РНК пробы 70 ° C инкубатора и центрифуги кратко (~ 5 с) для сбора образцов в нижней части трубы. Поместите смесь на льду в течение 3 мин.
- Подготовка Mix полиаденилирования Магистр нуклеазы без трубки при комнатной температуре в порядке, показанном на расчет листа. Соберите достаточно Mix Master для всех образцов в эксперименте, в том числе ≤ 5% для покрытия превышения пипетирования ошибки. Аккуратно вихрь, чтобы сделать однородной смеси без инактивации фермента, то центрифуга для ~ 5 с, чтобы собрать мастер смесь в нижней части трубы.
- Передача 3,5 мкл полиаденилирования Master Mix к каждой пробе РНК, тщательно перемешать, осторожно вортексе и следовать с быстрой спин собирать реакции.
- Место образцов в 37 ° С инкубатор. Инкубируйте реакции в течение 15 минпри 37 ° С, а затем кратко центрифуги для сбора реакции на дне трубки.
- После инкубации 37 ° С, место реакций на лед и немедленно приступить к обратной транскрипции.
- Обратной транскрипции синтезировать первой цепи кДНК:
- Подготовка Обратный Mix Master Транскрипция в нуклеазы без трубки при комнатной температуре в порядке, показанном на расчет листа. Соберите достаточно Mix Master для всех образцов в эксперименте, в том числе ≤ 5% для покрытия превышения пипетирования ошибки. Аккуратно вихрь, чтобы сделать однородной смеси без инактивации фермента, то центрифуга для ~ 5 с, чтобы собрать мастер смесь в нижней части трубы.
- Передача 10 мкл Обратный Mix Master Транскрипция для каждого образца, тщательно перемешать, осторожно вортексе, и следуйте с быстрой спин собирать реакции.
- Место образцов в 42 ° С инкубатор. Инкубируйте в течение 2 часов при 42 ° С, то центрифуги кратко (~ 5 с) для сбора реакции на дне трубки.
- Место трубок на лед и сразу перейти ко второй цепи кДНК синтеза.
- Вторая цепь кДНК Синтез:
- На льду, подготовить второй Mix Master Strand путем смешивания следующие реагенты в порядке, указанном в расчете листа. Соберите достаточно Mix Master для всех образцов в эксперименте, в том числе ≤ 5% для покрытия превышения пипетирования ошибки. Аккуратно вихрь, чтобы сделать однородной смеси без инактивации ферментов, то центрифуга для ~ 5 с, чтобы собрать мастер смесь в нижней части трубы.
- Передача 80 мкл вторых Mix Master Strand к каждому образцу, тщательно перемешать, осторожно вортексе, и следуйте с быстрой спин собирать реакции.
- Место образцов в 16 ° C термоциклер. Важно, чтобы охладить тепловой блок циклер до 16 ° C, прежде чем добавлять реакционные пробирки, потому подвергать реакции до температур> 16 ° C пойдет на компромисс Арна доходности.
- Инкубировать 2 часа при 16 ° С Инкубировать 2 часа в 16 ° C термоциклер. Если крышка температура не может быть скорректирована в соответствии с 16 ° С температуру блока, крышка реакции с подогревом крышки выключен, или если крышка не может быть отключен-не покрывают трубы с ним.
- Место реакции на льду кратко. Не оставляйте реакции на льду в течение длительных периодов времени.
- 5,4) кДНК Очистка:
- Все центрифугирования в этой процедуры очистки должно быть сделано на 10 000 мкг (как правило ~ 10000 оборотов в минуту) при комнатной температуре. Проверьте кДНК буфера для связывания для осаждения перед ее использованием. Если осадок видимой, растворяться при нагревании его решение до 37 ° С не более 10 мин и вортексе энергично. Остудить до комнатной температуры перед использованием.
- Перед началом кДНК очистки, подогрева 10 мл бутылка нуклеазы без воды до 50 ° С в течение не менее 10 мин.
- Добавить 250 мкл буфера для связывания кДНК для каждого образца и тщательно перемешать, осторожно вортексе.
- Центрифуга для ~ 1 мин при 10000 г, или пока смесь не станет через фильтр. Откажитесь от проточных и заменить кДНК фильтр в мытье трубки.
- Применить 500 мкл промывочного буфера для каждого кДНК сменный фильтр. Центрифуга для ~ 1 мин при 10000 г, или пока все Промывочный буфер через фильтр. Откажитесь от проточных и спин кДНК фильтр-картридж дополнительные минуты для удаления следовых количеств этанола.
- Передача кДНК фильтр патрон кДНК труб элюции. Элюировать кДНК с 20 мкл 50 ° C нуклеазы без воды. Важно использовать нуклеазы без воды, которая при температуре 50 ° С в течение кДНК элюирования. Холодная вода будет менее эффективным при элюировании кДНК и горячей воды (> 55 ° C) может привести к снижению выхода Арна.
- До центра фильтра в кДНК фильтра, примените 20 мкл предварительно нагретого (50 ° С), нуклеазы без воды. Оставить при комнатной температуре в течение 2 мин, а затем центрифуги для ~ 1,5 мин при 10 000 мкг, или пока все нуклеазы без воды через фильтр. Двухцепочечной кДНК теперь будет в элюции (~ 16 мкл).
- Очищенной кДНК можно хранить в течение ночи при -80 ° С в этой точке, если это необходимо.
- In Vitro транскрипции синтезировать Арна
- Рекомендуется использовать гибридизации печи из-за их равномерной температуры, и потому что это чрезвычайно важно, чтобы конденсат не образуется внутри труб. Мы настоятельно рекомендуем 14 часов IVT реакции инкубации максимально Арна доходности. За высокий урожай Арна, проведение IVT в 40 мкл конечного объема реакции.
- При комнатной температуре, собрать Mix IVT Мастер, добавляя реагенты в указанном порядке на расчете листа. Хорошо перемешайте, аккуратно вортексе. Центрифуга кратко (~ 5 с) для коллегlect Mix IVT Мастер на дне пробирки и помещают на лед.
- Передача IVT Master Mix для каждого образца в соответствии с инструкциями из расчета лист, тщательно перемешать, осторожно вортексе, центрифуги кратко собрать реакции, и места труб в 37 ° С инкубатор.
- Инкубируйте в течение 14 ч при 37 ° C.
- После инкубации, добавьте нуклеазы без воды к каждому образцу Арна довести до конечного объема 100 мкл. Тщательно перемешать, осторожно вортексе. Место разбавленный Арна на льду, если шаг Арна очистки будет сделано немедленно. Кроме того, Арна можно хранить при температуре -20 ° C.
- Арна очистки
- Все центрифугирования в этом разделе должно быть сделано в 10,000 мкг (обычно ~ 10.000 оборотов в минуту).
- Перед началом очистки Арна подогрева 10 мл бутылка нуклеазы без воды до 55 ° С в течение> 10 мин.
- Добавить 350 мкл буфера для связывания Арна к каждому образцу Арна. Тщательно перемешать, осторожно вортексе и переходите к следующему шагу немедленно.
- Добавить 250 мкл ACS класса 100% этанола к каждому образцу Арна, и соединение с помощью пипетки смесь вверх и вниз три раза. Не вихрь перемешать. Немедленно приступить к следующему шагу, как только вы смешали этанола в каждом образце.
- Место Арна фильтр в трубы Коллекция Арна и пипетки каждый образец смеси на центр фильтра в Арна сменный фильтр.
- Центрифуга для ~ 1 мин при 10000 х g. Продолжайте, пока смесь пропускают через фильтр. Откажитесь от проточных и заменить Арна фильтр в трубы Коллекция Арна.
- Применить 650 мкл промывочного буфера для каждого Арна сменный фильтр. Центрифуга для ~ 1 мин при 10 000 мкг, или пока все промывочного раствора через фильтр. Откажитесь от проточных и спин Арна фильтр-картридж дополнительные ~ 1 мин для удаления следовых количеств этанола.
- Передача фильтра картриджа (ей) свежих труб Коллекция Арна. До центра процедить, добавить 75 мкл нуклеазы без Вода, которая подогревается до 50-60 ° C. Замените контейнер нуклеазы без воды в 50-60 ° С инкубатор.
- Оставить при комнатной температуре в течение 2 мин, а затем центрифуги для ~ 1,5 мин при 10 000 мкг, или пока решение через фильтр.
- Повторите элюирования второй 75 мкл нуклеазы без воды. Арна теперь будет в трубке Арна коллекции в ~ 150 мкл нуклеазы без воды. Отменить Арна сменный фильтр.
- Магазин Арна при -80 ° C и минимизировать повторяющиеся замораживания-оттаивания.
Часть 7: синтеза кДНК
Эта часть используется Promega Универсальный RiboClone кДНК комплект системы синтеза с небольшими изменениями с инструкциями производителя. Стандартные лотки 2 мкг; на 454 последовательности, рекомендуется начинать с 10 мкг. Если концентрация слишком мала, Арна могут быть сосредоточены либо с этанолом осадков или вакуумной концентрации. Если 10 мкг используется в качестве входных данных РНК затем масштабировать все реагенты до с коэффициентом 5The ферменты входят в различные единицы каждой партии, при этом объемы должны быть рассчитаны каждый раз.
- Первый синтез Strand:
- Возьмите 0,5 мл ПЦР трубки и добавить:
мРНК образца 2 мкг (или 10 мкг если они используются для секвенирования 454) Случайные Primer Hex (0,5 мг / мл) 2 мкл Нуклеазы свободной воды к объему 0 (или не является образцом разбавленный) Общий объем 15 мкл - Тепло реакции до 70 ° С в течение 10 мин. Холод пробирку на льду в течение 5 мин и спин кратко собрать решение в нижней части трубы.
- Добавьте следующие компоненты в указанном порядке:
Образец 15 мкл Первый Strand 5X буфера 5 мкл RNasin рибонуклеазы Ингибитор 40 U 1 мкл ... 40 ед / мкл Общий объем 21 мкл - Смешайте reactioп и спина кратко. Тепло смеси при температуре 37 ° С в течение 5 мин.
- Добавьте следующие компоненты:
Пример с шагом 1 21,0 мкл Пирофосфат натрия, 40 мМ 2,5 мкл AMV Обратный Trancriptase 30 U 1,5 мкл ... 22 ед / мкл Нуклеазы свободной воды 0,0 мкл Общий объем 25,0 мкл - Инкубируйте реакции в течение 1 ч при 37 ° С в гибридизации духовке.
- После инкубации место реакция на льду.
- Возьмите 0,5 мл ПЦР трубки и добавить:
- Второй-Strand синтез:
- Добавьте следующие компоненты:
Первая реакция Strand 25,0 мкл Второе направление 2.5X буфера 40,0 мкл BSA, 1 мг / мл 5,0 мкл ДНК-полимераза I 23 U 3,0 мкл РНКазы H 0,8 U 0,5 мкл ... 1,5 ед / мкл Нуклеазы свободной воды 26,5 мкл Общий объем 100,0 мкл - Осторожно перемешать, щелкая трубки. Инкубируйте реакции при 14 ° С в течение 2 ч в амплификаторе. Важно, чтобы охладить амплификаторе до 14 ° C, прежде чем добавлять реакции труб. Не позволяйте реакции подняться выше 14 ° C до или во время реакции.
- Для прекращения реакции, добавьте 2 единицы Т4 ДНК-полимеразы на мкг вход мРНК к реакции. Инкубируйте в течение 10 мин при 14 ° C.
- Остановить реакцию добавлением 10 мкл 500 мМ ЭДТА DEPC лечение и место на льду.
- Чистая кДНК с использованием либо осадков этанола или Promega ДНК-Мастер очистки системы в соответствии с инструкциями производителя. Магазин образцы при -80 ° C. Двухцепочечной кДНК могут быть непосредственно pyrosequenced в этой точке.
- Добавьте следующие компоненты:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследование экспрессии генов с природными микробных сообществ стало обычным в последние годы как средство для изучения экологической роли и функции микроорганизмов. Используется в сочетании с обнаружения, количественное определение и характеристику морских микроорганизмов, анализ экспрессии генов можно использовать для связи филогении функционировать в природных микробных сообществ. Многие приемы для целенаправленной функциональной экспрессии генов основываются на специфических зондов или грунтовки наборы предназначены для генов с известной последовательностью. В отличие от этого, экологические транскриптомику могут быть использованы для изучения экспрессии генов без ограничений, существующих данных, последовательности и с предпочтением для тех генов, активно выражено. Анализ мРНК бассейн в окружающей среде может поэтому представляют собой один из наиболее эффективных способов обнаружения связей между ключевыми деятельности и организмы, которые опосредуют их.
Первоначального применения экологических транскриптомику при условии, одним из первых виды состава и динамики бактериальных мРНК в бассейн 3 природных экосистем. Анализ выразил генов в стенограмме библиотек с обеих прибрежных солончаках (Сапело острова, Джорджия) и щелочную, гиперсоленых озера (озеро Моно CA) показали последовательностей генов биогеохимических интерес, в том числе экологические варианты из нескольких функциональных генов, таких как хитиназ и серы окисления гены, которые являются специфическими для каждой из этих экосистем. Он также представил доказательства для новых, неожиданных процессов, таких как микробного разложения сосудистых полиамины растительного и водорослевого происхождения в качестве возможного углерода и азота источников.
Как молекулярных методов развиваться, чтобы уменьшить ограничения, связанные с работой с РНК из проб окружающей среды и последовательность совершенствования технологий, охраны окружающей транскриптомику стала более широко использовать технику. Он был использован для изучения функций микроорганизмов в поверхность океана 6 и сравнивать день и ночь функциональное выражение гена в той же среде 7. Экологические транскриптомику также может быть использован для получения лучшего понимания микробных ответов на конкретные факторы окружающей среды и биогеохимии. Гены или функции обнаружены с помощью этой техники может служить в качестве мишеней для более количественного исследования экспрессии генов, такие как микрочипы и количественный ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено Гордона и Бетти Мур Фонд грантов и Национального научного фонда грант MCB-0702125.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega Corp. | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
