Summary
Se presenta un método para la generación de cDNA a partir del ARNm del medio ambiente. En general, el ARN total se recogen la primera del medio ambiente, se elimina selectivamente rRNA, mRNA se amplifica de forma selectiva, y cDNA sintetizado a partir de la piscina es la secuencia de ARNm enriquecido. Secuencias recuperadas se pueden anotar utilizando las técnicas de bioinformática para identificar los genes que se expresan.
Abstract
Análoga a la metagenómica, la transcriptómica del medio ambiente (metatranscriptomics) recupera y las secuencias de ARNm del medio ambiente a partir de un conjunto microbiana sin conocimiento previo de lo que los genes de la comunidad puede expresar. Por lo tanto, ofrece la perspectiva más imparcial en la expresión de genes de la comunidad
Protocol
Trabajar con ARN
Debido a RNasas son ubicuos y ARNm se degrada rápidamente, las precauciones estándar para trabajar en un ambiente libre de ribonucleasa se deben seguir y las muestras deben ser procesadas o en conserva tan pronto como sea posible después de la recolección.
Parte 1: Colección Ambiental de ARN (diseñado para recoger la biomasa en la fracción de tamaño de 0,2 a 3,0 micras)
Material necesario:
Masterflex tubería
Bomba peristáltica
3 m de alto volumen de filtro plisado cápsula
0,22 m Supor o 142 mm de policarbonato filtro
142 mm de filtro de la torre (Geotech Equipos Ambientales)
10-20 L bombona (graduado)
Paquetes de giro
Nitrógeno líquido
RLT buffer (Qiagen)
Beta-mercaptoetanol
Configuración:
Guantes limpios deben ser usados siempre y cuando el manejo de los filtros o tocar cualquiera de los componentes del interior de la línea de filtro. Fórceps deben mantenerse limpias en 50 ml tubos cónicos, de preferencia lleno de etanol. Para evitar grandes cambios en la transcripción de la piscina, mantener el filtrado y los tiempos de manipulación de la muestra lo más corto posible.
Coloque un extremo del tubo en el agua a la profundidad deseada para el muestreo. En el extremo opuesto, fije el alto volumen de 3 micras filtro. Conecte el filtro de 3 micras a la torre de 0,22 micras filtro. Dirigir el flujo de salida del 0,22 micras en una bombona de graduado.
Procedimiento:
- Ejecutar varios litros de agua por el sistema (no 0,22 micras filtro) para enjuagar. Cuando termine, quite el tubo del agua, mientras que la bomba está funcionando para purgar el agua restante de la línea.
- Con unas pinzas, coloque un filtro de 0,22 micras en la torre del filtro y cierre.
- Coloque el extremo de la línea de fondo en el agua y encender la bomba. Purgar el aire de dos de los filtros. Controlar el volumen de agua filtrada con la graduación de la bombona.
- Cuando el volumen deseado se ha filtrado, eliminar la línea del agua y purgar el agua que quede en el sistema.
- Tan pronto como el filtro esté seco, retire rápidamente la placa superior del filtro y el filtro de veces. Coloque el filtro en un paquete de vueltas o 15 ml tubo de recogida que contiene 2 ml de solución tampón RLT con beta-mercaptoetanol. Ajustar congelación en nitrógeno líquido.
Parte 2: extracción de RNA total de 0,22 micras filtro
Esta parte utiliza el QIAGEN RNeasy mini kit con las modificaciones a las instrucciones del fabricante
- Prepare los tubos de cuentas superando mediante la adición de 8 ml de solución tampón RLT (beta-mercaptoetanol en el original) a un tubo cónico de 50 ml. Agregar 1.2 ml de ARN de cuentas de un kit de extracción MoBio Powersoil
- Quite rápidamente el filtro congelado del congelador y, manteniéndolo en el paquete de giro, que rompen con un mazo. Por otra parte, los filtros de corte en trozos pequeños en el tubo de recogida (15 ml), utilizando una hoja de afeitar estéril y añadir todo el tubo preparado (50 ml).
- Agregue el filtro roto el tubo preparado (50 ml), y sellar la tapa del tubo con parafilm, cinta de laboratorio.
- Vortex durante 10 minutos a la máxima velocidad con un vórtice de un accesorio para tubos de 50 ml.
- Centrifugar el tubo de 50 ml a 5000 rpm durante 1 min a temperatura ambiente.
- Eliminar la mayor cantidad posible de lisado y transferirlo a un tubo de 15 ml.
- Centrifugar el tubo de 15 ml durante 5 min a 5000 x g.
- Transferir el sobrenadante (menos de 7 ml) a un tubo nuevo de 50 ml.
- Añadir un volumen (menos de 7 ml) de EtOH al 100% para el lisado.
- Con una jeringa de 30 ml que encaja en el tubo de 50 ml, sacar el lisado a través de una aguja de calibre 18-21 y pasar de nuevo a unas 5 veces. Cuando haya terminado, deje el lisado en la jeringa.
- Continuar la extracción con el kit de QIAGEN RNeasy Mini. Es útil usar un colector de vacío aquí, ya que el volumen de lisado (~ 14 ml) es mucho mayor que el protocolo original del equipo (0,7 ml). Por otra parte, el lisado se pueden extraer a través de la adición de 700 l de la columna, la centrifugación y repitiendo hasta que todo el lisado se ha aplicado a la columna.
- Coloque una columna de centrifugación en el colector de vacío y se aplican 700 l de la muestra. Aplicar presión de vacío para el colector que se utilizaran los lisado. Continúe agregando el lisado de la jeringa hasta que todo se ha aplicado a la columna.
- Añadir 700 l de buffer RW1 la columna y toma hacia abajo con la presión de vacío.
- Añadir 500 l de buffer RPE de la columna y toma hacia abajo con la presión de vacío.
- Añadir una segunda alícuota de 500 l de buffer RPE de la columna y toma hacia abajo con la presión de vacío.
- Una vez que la lava está completamente diseñado a través de, quite la columna y colocar en un tubo de recogida.
- Centrifugar el tubo durante 1 minuto a 8000 x g. Desechar el filtrado.
- Centrífuga un adicional de 2 minutos a 8000 xg para deshacerse de la EtOH.
- Transferencia de columna a una nueva col 2 mlLECCIÓN tubo. Pipeta de 35 l de RNasa libre de agua directamente sobre la membrana. Cerrar el tubo y dejar reposar durante 1 minuto.
- Centrifugar durante 2 min a 8000 x g.
- Cuantificar el ARN total por espectrofotometría.
Parte 3. DNAsa tratamiento
Esta parte se utiliza el ADN libre de Ambion TURBO kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante
- Añadir 3,4 l 10x DNasa I Buffer y 1μl I rDNase a la muestra de RNA.
- Se incuba a 37 º C durante 30 minutos.
- Vortex el reactivo de inactivación DNasa y añadir 3,4 l de reactivo de inactivación de la muestra.
- Incubar 2 min a temperatura ambiente con mezcla ocasional.
- Giran a 10.000 xg durante 1,5 minutos a temperatura ambiente, a continuación, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Evitar la introducción de la inactivación reactivo en el tubo nuevo.
Parte 4. En primer lugar la eliminación rRNA
Esta parte se utiliza el kit de Epicentro ARNm-Sólo en función de las instrucciones del fabricante
- Mezclar suavemente y centrifugar brevemente la memoria intermedia de ARNm única reacción 10X antes de su uso.
- En un recipiente estéril (libre de RNasa) tubo de 0,5 ml, combinar los componentes de la reacción siguiente en el hielo:
ARNm-ONLY tampón de reacción 10X 2,0 l Inhibidor de la RNasa 0,5 l ARN total de la muestra (200 ng-10 mg) L 16,5 Terminator exonucleasa (1 Unidad) 1,0 l Volumen total 20,0 l - Incubar la reacción a 30 ° C durante 60 minutos en un termociclador (con tapa caliente) o baño de agua.
- Terminar la reacción con la precipitación con fenol / EtOH:
- Añadir RNasa libre de H2O hasta un volumen total de 200 l (l = 180).
- Extracto: fenol: cloroformo (1:1), un volumen (= 200 l). Agitar vigorosamente y luego girar 2-5 minutos a velocidad máxima.
- Eliminar la fase acuosa (~ 200 l).
- Añadir 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (20 l) + 2,5 volumen de 100% de hielo de EtOH frío (500 l)
- Incubar a -80 º C durante 15-30 min.
- Pellet a 4 º C, velocidad máxima, 30 min, tenga en cuenta la posición de la sonda de aspiración después de la muestra (pastilla puede ser difícil de ver).
- Desechar el sobrenadante con aspirador o una pipeta.
- Lavar con 500 l de hielo un 70% EtOH frío. Resuspender por agitación.
- Centrifugar durante 10 minutos a velocidad máxima. Desechar el sobrenadante.
- Centrifugar el líquido residual en el tubo de nuevo 10 minutos a velocidad máxima.
- Aspirar el contenido cuidadosamente y completamente seco en pelets, dejándolo abierto a unos 10 minutos bajo el capó.
- Resuspender en 15 a 20 l RNasa libre de H2O (volumen máximo de entrada de MICROBExpress es de 15 l), se deja reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Use Bioanalyzer o Experion para comprobar si hay contaminación rRNA y la calidad de ARNm en este paso.
- Este es un punto de parada potenciales. ARN pueden ser almacenadas a -80 º C en almacenamiento.
Parte 5. En segundo lugar la eliminación rRNA
Esta parte utiliza el Ambion MICROBEnrich y kits MICROBExpress de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Ambos kits se pueden utilizar varias veces para aumentar la eficiencia de los eucariotas (MICROBEnrich) y procariotas (MICROBExpress) la eliminación rRNA. La entrada de ARN total debe estar entre 20-10 mg. El volumen de la ARN debe ser inferior a 15 l. Así, el ideal de entrada es> 150 ng / l. -
MICROBEnrich
- Pipetear 300 l buffer vinculante en un tubo de 1,5 ml
- Añadir 500-100 g de ARN total en un volumen máximo de 30μl y agitar suavemente
- Añadir 2 l de captura Mix Oligo por 5 mg de ARN en tampón de unión. Toque suavemente el tubo y una breve vuelta por la mezcla.
- Mezcla desnaturaliza a 70 ° C durante 10 minutos
- Recocer la mezcla a 37 ° C durante 1 hora. Preparar las cuentas durante la incubación.
- Prepare Oligo MagBeads (normalmente de 25 l) por lavado de vez en agua libre de nucleasa y una vez en tampón de unión, la captura de las cuentas en un soporte magnético entre lavados. Almacenar los granos en el hielo. Calentarlos a la temperatura ambiente de 5 minutos antes de su uso.
- Calentar la solución de lavado a 37 º C en el bloque de calor.
- Añadir el ARN / captura Mix Oligo al lavado MagBeads Oligo. Muy suavemente la mezcla del tubo y girar brevemente.
- Incubar la mezcla a 37 ° C durante 15 min.
- Colocar el tubo en el soporte magnético y esperar a que ~ 3 min.
- Aspirar el sobrenadante (contiene ARNm) y transferirlo a un tubo de recogida en el hielo.
- Añadir 100 ml de solución de lavado pre-calentado a cuentas capturado. Suavemente vortex brevemente las cuentas. Captura de cuentas y recuperar el sobrenadante. Piscina con este sobrenadante de ARNm en el tubo de recogida en el hielo (~ 450 l de volumen final).
- Coloque el tubo de recogida en el hielo. Si una segunda ronda se va a llevar a cabo, volver a la 5.3) de sección y repita el procedimiento. Por otra parte, cambiar de inmediato al equipo de MICROBExpress (5.18, ver más abajo).
- OlioBeads utilizado puede ser utilizado una segunda vez. Regenerar el Oligobeads por incubación con 2 volúmenes (normalmente 50 l) de la solución de una regeneración durante 1 hora. Captura las bolas en un soporte magnético. Lavar dos veces con dos volúmenes de la solución de regeneración 2 (por lo general 50 l) y volver a suspender en su volumen original de la solución de resuspensión (normalmente de 25 l).
MICROBExpress - Pipetear 200 l buffer vinculante en un tubo de 1,5 ml.
- Añadir 20-10 mg de ARN total en un volumen máximo de 15μl y agitar suavemente.
- Agregar 4 l de captura Mix Oligo al ARN en tampón de unión. Toque suavemente el tubo y una breve vuelta por la mezcla.
- Mezcla desnaturaliza a 70 ° C durante 10 min.
- Recocido mezcla a 37 ° C durante 15 minutos Preparar cuentas durante la incubación.
- Prepare MagBeads Oligo lavando de vez en agua libre de nucleasa seguido de dos lavados en tampón de unión 50 l, la captura de las cuentas en un soporte magnético entre lavados. Volver a suspender las bolas en 50 l de amortiguación de unión y se incuba a 37 ° C hasta su uso.
- Calentar la solución de lavado a 37 º C en el bloque de calor
- Vortex lavado Oligo MagBeads suavemente. Añadir 50 l MagBeads Oligo de ARN / captura Mix Oligo. Muy suavemente la mezcla del tubo y girar brevemente.
- Incubar la mezcla a 37 ° C durante 15 min.
- Colocar el tubo en el soporte magnético y esperar a que ~ 3 min.
- Aspirar el sobrenadante (contiene ARNm) y transferirlo a un tubo de recogida en el hielo.
- Añadir 100 ml de solución de lavado pre-calentado a cuentas capturado. Suavemente vortex brevemente las cuentas.
- Captura de cuentas y recuperar el sobrenadante. Piscina con este sobrenadante de ARNm en el tubo de recogida en el hielo (~ 350 l de volumen final).
- Si una segunda ronda se va a realizar, se remontan a la sección 5.18) y repita el procedimiento. Por otra parte, procederá de inmediato a ARNm precipitación.
- Precipitado y resuspender ARNm:
- Para el ARNm agrupados añadir 35 Acetato de Sodio y añadir l 7 l glucógeno.
- Agregar el hielo 1.175 l frío EtOH al 100% y agitar bien.
- Precipitado a -20 ° C durante al menos 1 hora.
- Centrifugar durante 30 minutos a 10.000 x g.
- Decantar cuidadosamente y desechar el sobrenadante.
- Añadir 750 l de hielo frío EtOH 70% y agitar brevemente.
- Centrifugar durante 5 min a 10.000 xg y desechar el sobrenadante.
- Hacer un segundo lavado de EtOH 70%.
- En pocas palabras volver a girar el tubo después de descartar el segundo un 70% EtOH lavar.
- Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
- Deje secar al aire el precipitado durante 5 min.
- Resuspender el precipitado de ARN en 25 l de buffer TE o agua libre de RNasa
- Rehidratar ARN durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Vortex la muestra vigorosamente si es necesario.
- Si es necesario eliminar las perlas restantes, tubo lugar el soporte magnético de ~ 3 minutos y mover ARNm enriquecido al nuevo tubo RNasa libre.
- Use Bioanalyzer o Experion para comprobar si hay contaminación rRNA y la calidad de ARNm en este paso.
- Este es un punto de parada potenciales. ARN pueden ser almacenadas a -80 º C en almacenamiento.
Parte 6: La amplificación del ARNm
Esta parte utiliza el Ambion MessageAmp II-Las bacterias kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Calcular mezclas maestras en línea en www.ambion.com/tools/ma2bact .
- Poliadenilación del ARN de la plantilla:
- Lugar hasta 1000 ng de ARN total (típicamente 100 a 500 ng) o hasta 500 ng de mRNA (típicamente de 10 ng-200 ng) en un tubo de microcentrífuga estéril RNasa libre. Use 6,5 l de muestra y no RNasa libre de agua en el primer buffer.
- Incubar 10 min a 70 ° C, de preferencia en un termociclador.
- Eliminar las muestras de ARN de la incubadora de 70 ° C y una breve centrifugación (~ 5 s) para recoger la muestra en la parte inferior del tubo. Colocar la mezcla en hielo durante 3 min.
- Prepare la mezcla de poliadenilación Maestro en un tubo libre de nucleasa a temperatura ambiente en el orden indicado en la hoja de cálculo. Ensamble mezcla maestra suficiente para todas las muestras en el experimento, incluyendo exceso ≤ 5% para cubrir los errores de pipeteo. Suavemente vortex para hacer una mezcla homogénea sin inactivar la enzima, centrifugar durante ~ 5 s para recoger la mezcla maestra en la parte inferior del tubo.
- La transferencia de 3,5 l de mezcla de poliadenilación Maestro para cada muestra de ARN, mezclar bien por agitación suave y seguir con una vuelta rápida para recoger la reacción.
- Colocar las muestras en una incubadora a 37 ° C. Las reacciones se incuban durante 15 minutosa 37 ° C, centrifugar brevemente para recoger la reacción en la parte inferior del tubo.
- Después de la incubación de 37 ° C, coloque las reacciones en el hielo y proceder inmediatamente a la transcripción inversa.
- Transcripción inversa para sintetizar primera cadena de ADNc:
- Prepare la mezcla inversa Maestro de transcripción en un tubo libre de nucleasa a temperatura ambiente en el orden indicado en la hoja de cálculo. Ensamble mezcla maestra suficiente para todas las muestras en el experimento, incluyendo exceso ≤ 5% para cubrir los errores de pipeteo. Suavemente vortex para hacer una mezcla homogénea sin inactivar la enzima, centrifugar durante ~ 5 s para recoger la mezcla maestra en la parte inferior del tubo.
- Transferencia de 10 l de mezcla de maestro de transcripción inversa a cada muestra, mezclar bien por agitación suave, y seguir con una vuelta rápida para recoger la reacción.
- Colocar las muestras en una incubadora de 42 ° C. Incubar durante 2 horas a 42 ° C, centrifugar brevemente (~ 5 s) para recoger la reacción en la parte inferior del tubo.
- Coloque los tubos en hielo y proceder de inmediato a la síntesis de ADNc segundo.
- Síntesis de cDNA segundo:
- En hielo, preparar una mezcla Strand segundo maestro mediante la mezcla de los reactivos siguientes en el orden indicado en la hoja de cálculo. Ensamble mezcla maestra suficiente para todas las muestras en el experimento, incluyendo exceso ≤ 5% para cubrir los errores de pipeteo. Suavemente vortex para hacer una mezcla homogénea sin inactivar las enzimas, centrifugar durante ~ 5 s para recoger la mezcla maestra en la parte inferior del tubo.
- Transferencia de 80 l de mezcla Segundo Maestro Strand a cada muestra, mezclar bien por agitación suave, y seguir con una vuelta rápida para recoger la reacción.
- Colocar las muestras en un termociclador 16 ° C térmica. Es importante que se enfríe el bloque termociclador a 16 ° C antes de añadir los tubos de reacción, ya someter a las reacciones a temperaturas> 16 ° C pondrá en peligro el rendimiento ARNA.
- Incubar 2 horas a 16 ° C Incubar 2 horas en 16 ° C ciclador térmico. Si la temperatura de la tapa no se puede ajustar para que coincida con la 16 ° C de temperatura del bloque, cubierta de las reacciones con la tapa térmica apagada, o si la tapa no se puede apagar, no cubren los tubos con él.
- Lugar reacciones en breve hielo. No deje las reacciones en hielo durante largos períodos de tiempo.
- 5.4) La purificación de cDNA:
- Todas las centrifugaciones en este procedimiento de purificación se debe hacer a 10.000 xg (normalmente ~ 10.000 rpm) a temperatura ambiente. Compruebe la memoria intermedia de enlace de cDNA precipitación antes de usarlo. Si se forma un precipitado visible, disolver calentando la solución a 37 ° C durante 10 min y agitación vigorosa. Enfriar a temperatura ambiente antes de su uso.
- Antes de comenzar la purificación de cDNA, precalentar el frasco de 10 ml de agua libre de nucleasa a 50 ° C durante al menos 10 min.
- Añadir 250 l de tampón de unión cDNA de cada muestra y mezclar bien por agitación suave.
- Centrifugar durante aproximadamente 1 minuto a 10.000 g, o hasta que la mezcla es a través del filtro. Deseche el filtrado y sustituir el cartucho de filtro de cDNA en el tubo de lavado.
- Aplicar 500 l de tampón de lavado a cada uno de los filtros de cartucho de cDNA. Centrifugar durante aproximadamente 1 minuto a 10.000 g, o hasta que todo el tampón de lavado es a través del filtro. Deseche el filtrado y girar el cartucho de filtro de cDNA por un minuto más para eliminar trazas de EtOH.
- La transferencia de los filtros de cartucho de cDNA a un tubo de elución cDNA. Eluyen cDNA con 20 l de 50 ° C agua libre de nucleasa. Es importante utilizar agua libre de nucleasa que es de 50 ° C para la elución de cDNA. El agua más fría será menos eficiente en la elución de la cDNA y agua más caliente (> 55 ° C) puede causar pérdidas de rendimiento ARNA reducido.
- Para el centro del filtro en el cartucho de filtro de cDNA, aplicar 20 l de precalentado (50 ° C) agua libre de nucleasa. Dejar a temperatura ambiente durante 2 minutos y centrifugar durante aproximadamente 1,5 minutos a 10.000 xg, o hasta que toda el agua libre de nucleasa es a través del filtro. El ADNc de doble cadena estará ahora en la elución (~ 16 l).
- El cDNA purificado puede ser almacenado durante la noche a -80 ° C en este momento si lo desea.
- Transcripción in vitro para sintetizar ARNA
- Se recomienda utilizar un horno de hibridación, debido a su uniforme de la temperatura, y porque es muy importante que la condensación no se forma dentro de los tubos. Se recomienda encarecidamente a 14 horas de incubación la reacción IVT para maximizar el rendimiento ARNA. Para el mayor rendimiento de Arna, realizar la FIV en un volumen de 40 l de reacción final.
- A temperatura ambiente, armar un Mix Master IVT mediante la adición de reactivos en el orden indicado en la hoja de cálculo. Mezclar bien por agitación suave. Centrifugar brevemente (~ 5 s) de colnar el Master Mix IVT en la parte inferior del tubo y el lugar en el hielo.
- Transferencia de IVT Mix Master de cada muestra siguiendo las directrices de la hoja de cálculo, mezclar bien por agitación suave, centrifugar brevemente para recoger la reacción, y se colocan los tubos en una incubadora a 37 ° C.
- Incubar durante 14 horas a 37 ° C.
- Después de la incubación, añadir agua libre de nucleasa a cada muestra ARNA para llevar el volumen final de 100 microlitros. Mezclar bien por agitación suave. Coloque el ARNA diluido en hielo si la etapa de purificación ARNA se llevará a cabo de inmediato. Por otra parte, el ARNA se pueden almacenar a -20 ° C.
- ARNA Purificación
- Todas las centrifugaciones en esta sección se debe hacer a 10.000 xg (normalmente ~ 10.000 rpm).
- Antes de comenzar la purificación ARNA precalentar el frasco de 10 ml de agua libre de nucleasa a 55 ° C durante> 10 min.
- Añadir 350 l de tampón ARNA unión a cada muestra ARNA. Mezclar bien por agitación suave, y proceder al siguiente paso de inmediato.
- Añadir 250 ml del grado ACS EtOH al 100% a cada muestra de Arna, y mezclar con la pipeta de la mezcla de arriba a abajo 3 veces. No vortex para mezclar. Proceder de inmediato a la siguiente etapa tan pronto como se haya mezclado el EtOH en cada muestra.
- Coloque un ARNA cartucho de filtro en un tubo de colección de Arna, y la pipeta cada mezcla de la muestra en el centro del filtro en el cartucho de filtro ARNA.
- Centrifugar durante aproximadamente 1 min a 10.000 x g. Continúe hasta que la mezcla ha pasado por el filtro. Deseche el filtrado y reemplazar el cartucho de filtro ARNA en el tubo de recogida ARNA.
- Aplicar 650 l de tampón de lavado a cada cartucho de filtro ARNA. Centrifugar durante ~ 1 min a 10.000 xg, o hasta que toda la solución de lavado a través del filtro. Deseche el filtrado y girar la ARNA cartucho de filtro para un adicional de ~ 1 minuto para eliminar trazas de EtOH.
- Transferencia de cartucho de filtro (s) a un tubo de recogida fresca ARNA. Para el centro del filtro, añadir 75 l de agua libre de nucleasa que es precalentado a 50-60 º C. Vuelva a colocar el contenedor de agua libre de nucleasa en el 50-60 ° C incubadora.
- Dejar a temperatura ambiente durante 2 minutos y centrifugar durante aproximadamente 1,5 minutos a 10.000 xg, o hasta que la solución es a través del filtro.
- Repetir la elución con un segundo 75 l de agua libre de nucleasa. El ARNA estará ahora en el tubo de recogida ARNA en ~ 150 ml de agua libre de nucleasa. Deseche el cartucho de filtro ARNA.
- Tienda ARNA a -80 ° C y minimizar repetidos de congelación-descongelación.
Parte 7: la síntesis de ADNc
Esta parte utiliza el Promega universal RiboClone cDNA kit de síntesis del sistema con una ligera modificación a las instrucciones del fabricante. De entrada estándar de 2 mg, por 454 de secuenciación, se recomienda comenzar con 10 mg. Si la concentración es demasiado baja, el ARNA se puede concentrar, ya sea con la precipitación o la concentración de EtOH al vacío. Si 10 mg se utiliza como entrada de ARN luego escalar todos los reactivos, hasta por un factor de enzimas 5El vienen en diferentes unidades de cada lote, por lo tanto el volumen que se calcula cada vez.
- Síntesis primer capítulo:
- Tome un tubo de 0,5 ml PCR y añadir:
ARNm de la muestra 2 mg (10 mg o si se utiliza para la secuenciación 454) Primer hexadecimal al azar (0,5 mg / ml) 2 l Nucleasa libre de agua a volumen 0 (o no se muestra fue diluida) Volumen Total 15 l - El calor de la reacción a 70 ° C durante 10 min. Enfriar el tubo en hielo durante 5 minutos y girar brevemente para recoger la solución en la parte inferior del tubo.
- Agregue los siguientes componentes en el orden indicado:
Muestra 15 l Strand Buffer 5X primera 5 l RNasin ribonucleasa inhibidor de 40 u L 1 ... 40 U / l Volumen Total 21 l - Mix reaction breve y vuelta. Mezcla de calor a 37 ° C durante 5 min.
- Agregue los siguientes componentes:
Muestra en el paso 1 21,0 l Pirofosfato de sodio, 40 mM 2,5 l AMV inversa Trancriptase 30 u L 1,5 ... 22 u / l Nucleasa agua libre 0,0 l Volumen Total 25,0 l - Incubar la reacción durante 1 hora a 37 ° C en horno de hibridación.
- Después de la reacción de incubación a cabo en el hielo.
- Tome un tubo de 0,5 ml PCR y añadir:
- Segundo capítulo de síntesis:
- Agregue los siguientes componentes:
Primer capítulo de la reacción 25,0 l Strand 2,5 veces el segundo buffer 40,0 l BSA, 1 mg / ml 5,0 l ADN polimerasa I 23 u 3,0 l RNasa H 0,8 u L 0,5 ... 1,5 u / l Nucleasa agua libre L 26,5 Volumen Total 100,0 l - Mezclar suavemente agitando el tubo. Incubar las reacciones a 14 ° C durante 2 h en un termociclador. Es importante que se enfríe el termociclador a 14 ° C antes de añadir los tubos de reacción. No permita que la reacción de obtener por encima de 14 ° C antes o durante la reacción.
- Para terminar la reacción, añadir dos unidades de ADN polimerasa T4 por ARNm mg de entrada a la reacción. Incubar durante 10 min a 14 ° C.
- Detener la reacción añadiendo 10 l de DEPC 500 mM EDTA tratada y el lugar en el hielo.
- Limpie el cDNA utilizando una precipitación EtOH o el Sistema de Promega Asistente de ADN de limpieza de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Almacene las muestras a -80 ° C. CDNA de doble cadena puede ser directamente pyrosequenced en este momento.
- Agregue los siguientes componentes:
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Discussion
La investigación de la expresión génica de las comunidades microbianas naturales se ha vuelto común en los últimos años como un medio para explorar los roles y funciones ecológicas de los microorganismos. Utilizado en combinación con la detección, cuantificación y caracterización de microorganismos marinos, análisis de expresión génica puede ser utilizado para conectar la filogenia de funcionar en las comunidades microbianas naturales. Muchas de las técnicas para dirigir la expresión de genes funcionales se basan en sondas específicas o conjuntos de cebadores diseñados para genes de la secuencia conocida. Por el contrario, la transcriptómica del medio ambiente puede ser utilizado para examinar la expresión de genes sin las limitaciones impuestas por la secuencia de datos existentes y con preferencia por los genes que se expresan activamente. Análisis de la piscina de ARNm en el medio ambiente por lo tanto, puede proporcionar una de las maneras más eficaces de las conexiones entre el descubrimiento de las actividades principales y los organismos que los median.
La aplicación inicial de la transcriptómica ambientales que proporcionan una de las primeras vistas de la composición y la dinámica de la piscina del ARNm de bacterias en un ecosistema natural 3. El análisis de los genes expresados en las bibliotecas de transcripción, tanto desde la costa marisma (Sapelo Island, GA) y una alcalina, lago salado (Mono Lake CA) reveló secuencias de genes de interés biogeoquímicos, incluyendo las variantes del medio ambiente de varios genes funcionales, tales como quitinasas y azufre genes de oxidación que son específicas de cada uno de estos ecosistemas. También presentó pruebas de nuevos procesos, inesperadas, tales como la degradación microbiana de las poliaminas de plantas vasculares y algas derivados-como posible de carbono y fuentes de nitrógeno.
Como evolucionan las técnicas moleculares para reducir las limitaciones asociadas con el trabajo con RNA de muestras ambientales y mejorar las tecnologías de secuenciación, transcriptómica del medio ambiente se ha convertido en una técnica más ampliamente utilizada. Se ha utilizado para examinar las funciones de los microorganismos en la superficie del océano y 6 para comparar el día y la noche, la expresión de genes funcionales en el mismo ambiente 7. Transcriptómica del medio ambiente también puede ser utilizado para obtener una mejor comprensión de las respuestas microbianas con algunos factores ambientales y la biogeoquímica. Genes o funciones descubierto usando esta técnica puede servir como objetivos para los estudios más cuantitativos de la expresión génica como los microarrays y PCR cuantitativa.
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Acknowledgments
El financiamiento fue proporcionado por la Gordon and Betty Moore Foundation y subvenciones de la National Science Foundation MCB-0702125.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega Corp. | A7280 |
References
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