Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

تحليل الجينات من المجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام Transcriptomics البيئية

doi: 10.3791/1086 Published: February 18, 2009

Summary

نقدم طريقة لتوليد [كدنا] من مرنا البيئية. بشكل عام ، يتم تجميعها أولا من مجموع الحمض النووي الريبي والبيئة ، ويتم إزالة بشكل انتقائي الرنا الريباسي ، يتم تضخيمه بشكل انتقائي مرنا ، والتسلسل [كدنا] توليفها من تجمع مرنا المخصب. متواليات يمكن استردادها المشروح باستخدام معيار تقنيات المعلوماتية الحيوية لتحديد الجينات التي أعرب عنها.

Abstract

مماثلة لmetagenomics ، transcriptomics البيئية (metatranscriptomics) باسترداد ومتواليات mRNAs البيئية فيف من الجراثيم دون معرفة مسبقة لما الجينات قد يكون التعبير عن المجتمع. وبالتالي فإنه يوفر وجهة نظر غير منحازة أكثر على التعبير الجيني المجتمع

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

العمل مع الجيش الملكي النيبالي

لأن RNases موجودة في كل مكان وmRNAs تتحلل بسرعة ، والاحتياطات القياسية للعمل في بيئة خالية ريبونوكلياز يجب اتباعها ، وينبغي معالجتها أو الحفاظ على العينات في أقرب وقت ممكن لجمع التالية.

الجزء 1 : جمع البيئية RNA (المصممة لجمع الكتلة الحيوية في جزء حجم 0،2-3،0 ميكرون)

الإمدادات اللازمة :
Masterflex أنابيب
مضخة تمعجية
3 ميكرومتر ارتفاع حجم كبسولة تصفية مطوي
0.22 ميكرون أو البولي Supor 142 ملم التصفية
142 ملم تصفية البرج (جيوتك البيئية المعدات)
10-20 L الدمجانة (تخرج)
دوامة حزم
النيتروجين السائل
RLT العازلة (Qiagen)
بيتا المركابتويثانول

الإعداد :
يجب ارتداء قفازات نظيفة كلما التعامل مع الفلاتر أو لمس أي من المكونات الداخلية من خط التصفية. يجب أن تبقى نظيفة في ملقط أنابيب مخروطية 50 مل ، وشغل ويفضل مع الايثانول. لمنع التغييرات الرئيسية في التجمع نص ، والحفاظ على تصفية ومعالجة مرات عينة قصيرة قدر الإمكان.

مكان واحدة من نهاية الأنابيب في المياه على عمق المطلوب لأخذ العينات. في نهاية المقابلة ، نعلق ارتفاع حجم 3 ميكرون التصفية. ربط 3 ميكرون تصفية للبرج 0.22 ميكرون التصفية. توجيه تدفق من 0.22 ميكرون إلى الدامجانة زجاجة كبيرة تخرج.

الإجراء :

  1. تشغيل عدة لترات من المياه من خلال نظام (أي 0.22 ميكرون فلتر) لشطف. عند الانتهاء ، إزالة الأنبوب من الماء بينما يتم تشغيل المضخة لتطهير المياه المتبقية من الخط.
  2. باستخدام ملقط ، ضع 0.22 ميكرون فلتر تصفية على البرج وعلى مقربة.
  3. وضع نهاية الخط الخلفي في الماء وتشغيل المضخة. تطهير الهواء من المرشحات على حد سواء. رصد كميات المياه التي تمت تصفيتها مع التخرج على الدامجانة زجاجة كبيرة.
  4. عندما تم تصفية الصوت المطلوب ، وإزالة الخط من المياه وتطهير المياه المتبقية من النظام.
  5. حالما يتم تصفية الجافة ، إزالة بسرعة أعلى لوحة التصفية والتصفية أضعاف. وضع مرشح في حزمة الدوامة أو 15 مل تحتوي على أنبوب جمع 2 مل من RLT العازلة مع المركابتويثانول بيتا. تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل.

الجزء 2 : مجموع الاستخراج من الحمض النووي الريبي تصفية 0.22 ميكرون

هذا الجزء يستخدم عدة QIAGEN RNeasy مصغرة مع بعض التعديلات لتعليمات الشركة الصانعة

  1. إعداد حبة أنابيب الضرب بإضافة 8 مل من RLT العازلة (بيتا المركابتويثانول المضافة) إلى أنبوب مخروطي 50 مل. إضافة 1-2 مل من الحمض النووي الريبي حبات من استخراج MoBio عدة Powersoil
  2. إزالة بسرعة تصفية المجمدة من الفريزر ، وابقائها في حزمة الدوامة ، تتحطم مع مطرقة. بدلا من ذلك ، قطع المرشحات في قطع صغيرة في أنبوب جمع (15ml) باستخدام شفرة حلاقة معقمة وإضافته إلى جميع أنبوب المعدة (50ml).
  3. إضافة إلى تصفية حطم أنبوب المعدة (50ml) ، وختم غطاء أنبوب مع parafilm الشريط أو المختبر.
  4. دوامة لمدة 10 دقائق على سرعة أعلى باستخدام vortexer مع مرفق الأنابيب لمدة 50 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 50 مل في 5000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إزالة أكبر قدر ممكن من lysate وتحويلها إلى أنبوب 15 مل.
  7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل لمدة 5 دقائق في 5000 س ز
  8. نقل طاف (~ 7 مل) إلى أنبوب جديد 50 مل.
  9. إضافة 1 الحجم (~ 7 مل) من 100 ٪ EtOH إلى lysate.
  10. باستخدام الحقنة 30 مل التي تناسبها في أنبوب 50 مل ، يوجه lysate تصل عن طريق إبرة قياس 18-21 وتمريرها مرة أخرى إلى ~ 5 مرات. عند الانتهاء ، وترك lysate في المحاقن.
  11. مواصلة الاستخراج مع عدة QIAGEN RNeasy البسيطة. ومن المفيد استخدام مشعب الفراغ هنا ، لأن حجم lysate (~ 14ml) هو أعلى بكثير من بروتوكول عدة الأصلي (0.7 مل). بدلا من ذلك ، يمكن رسمها من خلال lysate بإضافة 700 ميكروليتر إلى العمود ، الطرد المركزي ، وتكرار حتى يتم تطبيق كافة lysate إلى العمود.
  12. مكان عمود متعددة تدور حول الفراغ وتطبيق 700 ميكرولتر من العينة. الضغط فراغ إلى مشعب السحب لأسفل lysate. واضاف ان مواصلة lysate من الحقنة حتى تم تطبيق كل ذلك إلى العمود.
  13. إضافة 700 RW1 العازلة ميكرولتر إلى العمود والسحب مع الضغط فراغ.
  14. إضافة 500 RPE العازلة ميكرولتر إلى العمود والسحب مع الضغط فراغ.
  15. إضافة قسامة الثانية من 500 RPE العازلة ميكرولتر إلى العمود والسحب مع الضغط فراغ.
  16. بمجرد غسل رسمها تماما ، عن طريق إزالة العمود ووضعه في أنبوب جمع.
  17. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب لل1 دقيقة في ز س 8000 التدفق من خلال تجاهل.
  18. الطرد المركزي 2 دقيقة اضافية في 8000 XG للتخلص من EtOH.
  19. نقل عمود إلى عمود جديد مل 2فصل من الكتاب المقدس الأنبوب. 35 ماصة ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه مباشرة على الغشاء. إغلاق أنبوب واسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة.
  20. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة على ز س 8000
  21. قياس الحمض النووي الريبي مجموع spectrophotometrically.

الجزء 3. الدناز العلاج

هذا الجزء يستخدم الحمض النووي خالية Ambion TURBO عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة

  1. اضافة 3.4 ميكرولتر 10X الدناز أنا العازلة و1μl rDNase الأول للعينة الحمض النووي الريبي.
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية ل30min.
  3. في دوامة التعطيل الدناز الكاشف وإضافة 3.4 ميكرولتر من كاشف لتعطيل العينة.
  4. احتضان 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع خلط في بعض الأحيان.
  5. تدور 10،000 XG مقابل 1.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم نقل إلى طاف أنبوب جديد. تجنب إدخال كاشف التعطيل في أنبوب جديد.

الجزء 4. الأولى إزالة الرنا الريباسي

هذا الجزء يستخدم عدة Epicentre مرنا ، إلا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة

  1. المزيج بلطف وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الاحتياطي مرنا - ONLY الرد 10X قبل الاستخدام.
  2. في العقيمة (ريبونوكلياز مجانا) 0.5 مل أنبوب ، والجمع بين العناصر التالية رد فعل على الجليد :
    مرنا - ONLY الاحتياطي الرد 10X 2.0 ميكرولتر
    ريبونوكلياز المانع 0.5 ميكرولتر
    مجموع عينة الحمض النووي الريبي (200 نانوغرام - 10 ميكروغرام) ميكرولتر 16.5
    فاصل نوكلياز خارجية (1 وحدة) 1.0 ميكرولتر
    اجمالى حجم 20.0 ميكرولتر
  3. احتضان رد الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في thermocycler (مع غطاء ساخنة) أو حمام المياه.
  4. إنهاء التفاعل مع هطول الأمطار الفينول / EtOH :
    1. إضافة ريبونوكلياز خالية H2O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 200 ميكرولتر (= 180 ميكرولتر).
    2. خلاصة : الفينول : الكلوروفورم (1:1) ، 1 الحجم (= 200 ميكرولتر). دوامة تدور بقوة ثم 2-5 دقيقة في سرعة قصوى.
    3. إزالة المرحلة المائية (~ 200 ميكرولتر).
    4. إضافة وحدات التخزين 0.1 من 3 خلات الصوديوم M (20 ميكرولتر) + 2.5 ٪ 100 حجم الجليد الباردة EtOH (500 ميكرولتر)
    5. في احتضان -80 درجة مئوية عن 15-30 دقيقة.
    6. بيليه عند 4 درجات مئوية ، وسرعة أعلى ، 30 دقيقة ، علما أن موقف لأنبوب الشفط في وقت لاحق من العينة (بيليه قد يكون من الصعب أن نرى).
    7. تجاهل طاف مع الشافطة أو ماصة.
    8. يغسل مع 500 ميكرولتر 70 ٪ الجليد الباردة EtOH. Resuspend بواسطة vortexing.
    9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في سرعة قصوى. تجاهل طاف.
    10. الطرد المركزي السائل المتبقي في الأنبوب مرة أخرى 10 دقيقة في سرعة قصوى.
    11. نضح السائل بعناية وجافة تماما بيليه من خلال ترك الباب مفتوحا لدقيقة 10 ~ تحت غطاء محرك السيارة.
    12. Resuspend في 15-20 ريبونوكلياز خالية H2O ميكرولتر (الحجم الأقصى للمساهمة هو 15 MICROBExpress ميكرولتر) ؛ السماح لها الوقوف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    13. أو استخدام Bioanalyzer Experion للتحقق من تلوث الرنا الريباسي ونوعية مرنا في هذه الخطوة.
    14. هذه هي نقطة التوقف المحتملة. ويمكن تخزين الحمض النووي الريبي في تخزين -80 درجة مئوية.

الجزء 5. الثانية الرنا الريباسي إزالة

هذا الجزء يستخدم MICROBEnrich Ambion MICROBExpress ومجموعات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ويمكن استخدام كل من مجموعات عدة مرات لزيادة كفاءة حقيقية النواة (MICROBEnrich) وإزالة بروكاريوتيك الرنا الريباسي (MICROBExpress). ينبغي للمدخلات من الحمض النووي الريبي مجموع ما بين 20-10 ميكروغرام. يجب أن يكون حجم الحمض النووي الريبي أقل من 15 ميكرولتر. وبالتالي ، فإن الحل الأمثل هو إدخال> 150 نانوغرام / ميكرولتر. --

MICROBEnrich

  1. ماصة 300 العازلة تجليد ميكرولتر في أنبوب 1.5ml
  2. إضافة RNA 500-100 ميكروغرام التام في أقصى حجم 30μl ودوامة بلطف
  3. إضافة 2 ميكرولتر من مزيج أليغو لالتقاط RNA ميكروغرام 5 في تجليد العازلة. اضغط أنبوب بلطف وتدور باستمرار لفترة وجيزة الخليط.
  4. خليط تفسد عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة
  5. يصلب الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إعداد حبات خلال هذه الحضانة.
  6. إعداد أليغو MagBeads (عادة 25 ميكرولتر) عن طريق الغسيل مرة واحدة في nuclease خالية من المياه ، ومرة ​​واحدة في المخزن وتجليد ، التقاط حبات على حامل المغناطيسي بين يغسل. تخزين حبات على الجليد. الحار لهم حتى 5 درجة حرارة الغرفة دقيقة قبل الاستخدام.
  7. الحرارة الحل اغسل إلى 37 درجة مئوية في حرارة كتلة.
  8. إضافة الحمض النووي الريبي / التقاط أليغو ميكس لMagBeads أليغو غسلها. المزيج بلطف جدا وتدور في أنبوب لفترة وجيزة.
  9. احتضان هذا المزيج على 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  10. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي وانتظر 3 دقائق ~.
  11. نضح طاف (يحتوي على مرنا) وتحويلها إلى أنبوب جمع على الجليد.
  12. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الغسيل قبل استعد لالتقاط حبات. دوامة الخرز برفق لفترة وجيزة. التقاط الخرز واسترداد طاف. تجمع هذه طاف مع مرنا في أنبوب جمع على الجليد (~ 450 حجم نهاية ميكرولتر).
  13. وضع أنبوب جمع على الجليد. إذا كانت الجولة الثانية سيكون أداؤها ، يعود إلى 5.3) وكرر القسم الداخلي. بدلا من ذلك ، التبديل على الفور لعدة MICROBExpress (5.18 ، أنظر أدناه).
  14. ويمكن استخدام OlioBeads تستخدم للمرة الثانية. تجديد Oligobeads التي تفرخ لهم مع 2 مجلدات (عادة 50 ميكرولتر) من الحل 1 التجديد لمدة 1 ساعة. التقاط حبات في موقف المغناطيسي. غسلها مرتين مع 2 مجلدات من الحل التجديد 2 (عادة 50 ميكرولتر) وresuspend لهم في حجمها الأصلي من الحل إعادة تعليق (عادة 25 ميكرولتر).
    MICROBExpress
  15. ماصة 200 العازلة تجليد ميكرولتر في أنبوب 1.5ml.
  16. إضافة RNA 20-10 ميكروغرام التام في أقصى حجم 15μl ودوامة بلطف.
  17. إضافة 4 ميكرولتر من التقاط ميكس أليغو في الحمض النووي الريبي لربط العازلة. اضغط أنبوب بلطف وتدور باستمرار لفترة وجيزة الخليط.
  18. خليط تفسد عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  19. يصلب خليط عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تحضير حبات خلال هذه الحضانة.
  20. يتبع إعداد MagBeads أليغو عن طريق الغسيل مرة واحدة في nuclease خالية من المياه من قبل اثنين من يغسل العازلة في 50 ميكرولتر تجليد ، التقاط حبات على حامل المغناطيسي بين يغسل. الخرز Resuspend العازلة في 50 ميكرولتر تجليد واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  21. الحرارة الحل اغسل إلى 37 درجة مئوية في حرارة كتلة
  22. تغسل دوامة أليغو MagBeads بلطف. إضافة 50 ميكرولتر MagBeads أليغو إلى RNA / التقاط أليغو ميكس. المزيج بلطف جدا وتدور في أنبوب لفترة وجيزة.
  23. احتضان المزيج على 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  24. وضع أنبوب في موقف المغناطيسي وانتظر 3 دقائق ~.
  25. نضح طاف (يحتوي على مرنا) وتحويلها إلى أنبوب جمع على الجليد.
  26. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الغسيل قبل استعد لالتقاط حبات. دوامة الخرز برفق لفترة وجيزة.
  27. التقاط الخرز واسترداد طاف. تجمع هذه طاف مع مرنا في أنبوب جمع على الجليد (~ 350 حجم نهاية ميكرولتر).
  28. إذا كانت الجولة الثانية سيكون أداؤها ، والعودة إلى القسم 5.18) ، وكرر هذا الإجراء. بدلا من ذلك ، الشروع فورا في مرنا هطول الأمطار.
  29. ويعجل مرنا resuspend :
    1. إلى مرنا مجمعة إضافة خلات الصوديوم 35 ميكرولتر وإضافة 7 الجليكوجين ميكرولتر.
    2. 1175 إضافة الجليد الباردة ميكرولتر EtOH 100 ٪ ودوامة بدقة.
    3. يعجل في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل 1H.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في ز س 10.000
    5. صب بعناية وتجاهل طاف.
    6. إضافة 750 الجليد الباردة ميكرولتر EtOH 70 ٪ لفترة وجيزة الدوامة.
    7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 10،000 XG وتجاهل طاف.
    8. لا تغسل EtOH الثانية 70 ٪.
    9. respin لفترة وجيزة في الأنبوب بعد رميه الثاني غسل EtOH 70 ٪.
    10. إزالة بعناية أي طاف مع ماصة.
    11. الهواء الجاف وبيليه لمدة 5 دقائق.
    12. Resuspend بيليه في الحمض النووي الريبي في 25 العازلة TE ميكرولتر أو ريبونوكلياز المياه مجانا
    13. ترطيب الحمض النووي الريبي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    14. دوامة العينة بقوة اذا لزم الامر.
  30. إذا كان من الضروري إزالة ما تبقى الخرز ، أنبوب مكان على أهبة الاستعداد ل~ المغناطيسي 3min مرنا والانتقال إلى أنبوب التخصيب ريبونوكلياز الحرة الجديدة.
  31. أو استخدام Bioanalyzer Experion للتحقق من تلوث الرنا الريباسي ونوعية مرنا في هذه الخطوة.
  32. هذه هي نقطة التوقف المحتملة. ويمكن تخزين الحمض النووي الريبي في تخزين -80 درجة مئوية.

الجزء 6 : التضخيم مرنا

هذا الجزء يستخدم Ambion MessageAmp II - البكتيريا مجموعة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حساب الرئيسي على الانترنت يمزج www.ambion.com/tools/ma2bact .

  1. تذييل بعديد الأدينيلات من الحمض النووي الريبي القالب :
    1. مكان ما يصل إلى 1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع (100-500 نانوغرام عادة) أو ما يصل إلى 500 نانوغرام مرنا (عادة 10 نانوغرام - 200 نانوغرام) في أنبوب عقيم microfuge ريبونوكلياز خالية. استخدام 6.5 ميكرولتر من العينة وجود مياه ريبونوكلياز الحرة في المخزن الأول.
    2. احتضان 10 دقيقة عند درجة 70 ، ويفضل في thermocycler.
    3. إزالة عينات من الحمض النووي الريبي من الحاضنة 70 درجة مئوية لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي (~ ق 5) لجمع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب. ضع الخليط على الجليد لمدة 3 دقائق.
    4. إعداد تذييل بعديد الأدينيلات ميكس ماجستير في أنبوب nuclease خالية في درجة حرارة الغرفة في الترتيب الذي يظهر على ورقة الحساب. تجميع ما يكفي من مزيج الرئيسي لجميع العينات في التجربة ، بما في ذلك الفائض ≤ 5 ٪ لتغطية الخطأ pipetting. دوامة برفق لجعل مزيج متجانس من دون تعطيل انزيم ، ثم الطرد المركزي ليالي 5 ~ لجمع المزيج الرئيسية في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. نقل 3.5 ميكرولتر من مزيج ماجستير تذييل بعديد الأدينيلات لكل عينة الحمض النووي الريبي ، مزيج دقيق من قبل لطيف واتباع vortexing مع دوران سريع لجمع ردود الفعل.
    6. وضع العينات في حاضنة 37 درجة مئوية. ردود فعل احتضان لمدة 15 دقيقةفي 37 درجة مئوية ، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع ردود الفعل في الجزء السفلي من الأنبوب.
    7. بعد حضانة 37 درجة مئوية ، ومكان ردود الفعل على الجليد ، والشروع فورا في النسخ العكسي.
  2. عكس النسخ الأولى لتجميع ستراند [كدنا] :
    1. إعداد النسخ العكسي ميكس ماجستير في أنبوب nuclease خالية في درجة حرارة الغرفة في الترتيب الذي يظهر على ورقة الحساب. تجميع ما يكفي من مزيج الرئيسي لجميع العينات في التجربة ، بما في ذلك الفائض ≤ 5 ٪ لتغطية الخطأ pipetting. دوامة برفق لجعل مزيج متجانس من دون تعطيل انزيم ، ثم الطرد المركزي ليالي 5 ~ لجمع المزيج الرئيسية في الجزء السفلي من الأنبوب.
    2. نقل 10 من ميكرولتر عكس نسخ ميكس ماجستير في كل عينة ، مزيج دقيق من قبل vortexing لطيف ، واتبع مع دوران سريع لجمع ردود الفعل.
    3. وضع العينات في حاضنة 42 درجة مئوية. احتضان لمدة 2 ساعة على 42 درجة مئوية ، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة (~ ق 5) لجمع ردود الفعل في الجزء السفلي من الأنبوب.
    4. وضع أنابيب على الجليد ، والشروع فورا في تجميع الشق الثاني [كدنا].
  3. الثانية التجميعي ستراند [كدنا] :
    1. على الجليد ، وإعداد الماجستير ستراند ميكس الثاني عن طريق خلط الكواشف التالية في الترتيب المعروض في ورقة الحساب. تجميع ما يكفي من مزيج الرئيسي لجميع العينات في التجربة ، بما في ذلك الفائض ≤ 5 ٪ لتغطية الخطأ pipetting. دوامة برفق لجعل مزيج متجانس من دون تعطيل الإنزيمات ، ثم الطرد المركزي ليالي 5 ~ لجمع المزيج الرئيسية في الجزء السفلي من الأنبوب.
    2. نقل 80 ميكرولتر الثانية من ستراند ميكس ماجستير في كل عينة ، مزيج دقيق من قبل vortexing لطيف ، واتبع مع دوران سريع لجمع ردود الفعل.
    3. وضع العينات في cycler 16 درجة مئوية الحرارية. من المهم أن تبرد كتلة cycler الحرارية إلى 16 درجة مئوية قبل إضافة أنابيب رد فعل لأن إخضاع ردود الفعل على درجات الحرارة> 16 درجة مئوية وسطا آرنا الغلة.
    4. احتضان 2 ساعة على 16 درجة مئوية احتضان 2 ساعة في cycler 16 درجة مئوية الحرارية. إذا لا يمكن ضبط درجة حرارة الغطاء لتتناسب مع كتلة 16 درجة مئوية درجة الحرارة ، وتغطية ردود الفعل مع غطاء ساخنة إيقاف ، أو إذا لا يمكن إيقاف غطاء ، لا تغطي أنابيب معها.
    5. ردود الفعل على مكان لفترة وجيزة الجليد. لا تترك ردود الفعل على الجليد لفترات طويلة من الزمن.
  4. 5.4) تنقية [كدنا] :
    1. وينبغي أن يتم كل centrifugations في هذا الإجراء في تنقية 10000 XG (عادة ~ 10،000 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة. التحقق من الاحتياطي [كدنا] ملزم لهطول الأمطار قبل استخدامه. إذا كان يعجل مرئيا ، redissolve من قبل الحل لارتفاع درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 دقيقة وvortexing بقوة. باردة لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    2. قبل البدء في تنقية [كدنا] ، تسخين الزجاجة 10 مل من الماء الخالي من Nuclease إلى 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    3. إضافة 250 ميكرولتر من الاحتياطي ملزم [كدنا] لكل عينة ومزيج دقيق من قبل vortexing بلطف.
    4. الطرد المركزي للدقيقة في 1 ~ 10000 غرام ، أو حتى يصبح الخليط من خلال تصفية. تجاهل والتدفق من خلال استبدال خرطوشة تصفية [كدنا] في أنبوب الغسيل.
    5. تطبيق 500 مخزن اغسل ميكرولتر لتصفية كل خرطوشة [كدنا]. الطرد المركزي للدقيقة في 1 ~ 10000 غرام ، أو حتى كل اغسل الاحتياطي هو من خلال التصفية. تجاهل التدفق من خلال وتدور خرطوشة [كدنا] تصفية لدقيقة إضافية لإزالة كميات ضئيلة من EtOH.
    6. [كدنا] نقل خرطوشة تصفية لأنبوب شطف [كدنا]. أزل [كدنا] مع 20 ميكرولتر من 50 درجة مئوية Nuclease خالية من المياه. من المهم استخدام Nuclease خالية من المياه التي يتم عند 50 درجة مئوية لشطف [كدنا]. وسوف تكون المياه أكثر برودة يبلغ حجمه أقل كفاءة في [كدنا] ، وحرارة المياه (> 55 درجة مئوية) قد يؤدي إلى انخفاض العائد آرنا.
    7. الى مركز للتصفية في خرطوشة تصفية [كدنا] ، وتطبيق 20 ميكرولتر من محمى (50 درجة مئوية) Nuclease المياه خالية. ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة ثم الطرد المركزي للدقيقة 1.5 ~ في XG 10000 ، أو حتى كل الماء Nuclease الخالية من خلال التصفية. [كدنا] سوف تكون المزدوج تقطعت بهم السبل الآن في أزل (~ 16 ميكرولتر).
    8. ويمكن تخزين [كدنا] بين عشية وضحاها في تنقية -80 درجة مئوية في هذه المرحلة إذا رغبت في ذلك.
  5. النسخ في المختبر لتجميع آرنا
    1. فمن المستحسن استخدام فرن التهجين بسبب درجة الحرارة بشكل موحد ، ولأن من المهم للغاية أن التكثيف لا تشكل داخل الأنابيب. ونحن نوصي بشدة لمدة 14 ساعة حضانة IVT رد فعل لتعظيم العائد آرنا. لأعلى محصول آرنا ، إجراء IVT في 40 ميكرولتر حجم رد الفعل النهائي.
    2. في درجة حرارة الغرفة ، وتجميع خليط ماجستير IVT بإضافة الكواشف في ترتيب المدرجة على ورقة الحساب. مزيج جيد من قبل vortexing بلطف. الطرد المركزي لفترة وجيزة (~ 5 ليالي) لعمودlect ميكس IVT ماجستير في الجزء السفلي من الأنبوب ومكان على الجليد.
    3. نقل ميكس ماجستير IVT لكل عينة التالية للمبادئ التوجيهية للورقة الحساب ، مزيج دقيق من قبل vortexing رقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع ردود الفعل ، ووضع الأنابيب في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    4. احتضان لمدة 14 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    5. بعد حضانة ، إضافة Nuclease خالية من المياه لكل عينة آرنا لتحقيق الحجم النهائي إلى 100 ميكرولتر. مزيج دقيق من قبل vortexing لطيف. ضع آرنا المخفف على الجليد إذا كان سيتم القيام به في خطوة لتنقية آرنا على الفور. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين آرنا في -20 درجة مئوية.
  6. آرنا تنقية
  7. وينبغي أن يتم كل centrifugations في هذا القسم على 10،000 XG (عادة ~ 10،000 دورة في الدقيقة).
  8. قبل البدء في تنقية آرنا تسخين الزجاجة 10 مل من الماء الخالي من Nuclease إلى 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة>.
  9. إضافة 350 ميكرولتر من الاحتياطي آرنا ملزم لكل عينة آرنا. مزيج دقيق من قبل vortexing لطيف ، والشروع في الخطوة التالية مباشرة.
  10. إضافة 250 ميكرولتر من EtOH الصف ACS 100 ٪ لتصل إلى كل عينة آرنا ، ومزيج من قبل pipetting الخليط صعودا وهبوطا 3 مرات. لا الدوامة إلى المزيج. الشروع فورا في الخطوة التالية في أقرب وقت لديك مختلطة EtOH في كل عينة.
  11. مكان عامل تصفية آرنا خرطوشة في أنبوب جمع آرنا ، وماصة كل خليط العينة على مركز للتصفية في خرطوشة تصفية آرنا.
  12. الطرد المركزي للدقيقة في 1 ~ ز س 10000 يستمر حتى يصبح الخليط مرت التصفية. تجاهل التدفق من خلال تصفية واستبدال خرطوشة آرنا في أنبوب جمع آرنا.
  13. تطبيق 650 مخزن اغسل ميكرولتر لكل خرطوشة تصفية آرنا. الطرد المركزي لدقائق 1 ~ في XG 10000 ، أو حتى عن غسل الحل هو من خلال التصفية. تجاهل التدفق من خلال تصفية وتدور آرنا خرطوشة إضافية ل~ 1 دقيقة لإزالة كميات ضئيلة من EtOH.
  14. نقل تصفية خرطوشة (ق) إلى أنبوب جديد كوكتيل آرنا. الى مركز للتصفية ، إضافة 75 ميكرولتر Nuclease خالية من المياه التي يتم تسخينها إلى 50-60 درجة مئوية. استبدال حاوية Nuclease خالية من المياه في الحاضنة 50-60 درجة مئوية.
  15. ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة ثم الطرد المركزي للدقيقة 1.5 ~ في XG 10000 ، أو حتى الحل هو من خلال التصفية.
  16. تكرار شطف مع ميكرولتر 75 ثانية من Nuclease خالية من المياه. سوف يكون الآن آرنا في أنبوب جمع آرنا في ميكرولتر 150 ~ Nuclease خالية من المياه. تجاهل تصفية آرنا خرطوشة.
  17. آرنا في تخزين -80 درجة مئوية والحد من تكرار تجميد الذوبان.

الجزء 7 : [كدنا] توليف

هذا الجزء يستخدم النظام العالمي Promega RiboClone التجميعي [كدنا] طقم مع تعديل طفيف لتعليمات الشركة الصانعة. المدخلات القياسية 2 ميكروغرام ؛ لتسلسل 454 ، فمن المستحسن أن تبدأ مع 10 ميكروغرام. إذا كان تركيز منخفض جدا ، ويمكن أن تتركز آرنا مع هطول الأمطار EtOH أو تركيز الفراغ. إذا تم استخدام 10 ميكروغرام كمدخل RNA ثم النطاق جميع الكواشف بنسبة عاملا من الإنزيمات 5The يأتي في وحدات مختلفة في كل دفعة ، وبالتالي يجب أن تكون الكميات محسوبة في كل مرة.

  1. أول ستراند التجميعي :
    1. أخذ 0.5 مل أنبوب PCR ونضيف :
      عينة مرنا 2 ميكروغرام (10 ميكروغرام أو إذا تم استخدامها لتسلسل 454)
      عشوائي التمهيدي الهيكس (0.5 ملغ / مل) 2 ميكرولتر
      Nuclease المياه مجانا للحجم 0 (أو غير هو عينة تم تمييع)
      اجمالى حجم التداول 15 ميكرولتر
    2. حرارة التفاعل إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. البرد أنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق وتدور لفترة وجيزة لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.
    3. إضافة العناصر التالية في الترتيب هو مبين :
      عينة 15 ميكرولتر
      أول الاحتياطي ستراند 5X 5 ميكرولتر
      RNasin ريبونوكلياز المانع 40 ش ميكرولتر 1... 40 ش / ميكرولتر
      اجمالى حجم التداول 21 ميكرولتر
    4. مزيج reaction وتدور لفترة وجيزة. مزيج الحرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. إضافة العناصر التالية :
      عينة من الخطوة 1 21.0 ميكرولتر
      بيروفوسفيت الصوديوم ، 40 مم 2.5 ميكرولتر
      AMV عكس Trancriptase 30 ش ميكرولتر 1.5... 22 ش / ميكرولتر
      Nuclease المياه مجانا 0.0 ميكرولتر
      اجمالى حجم التداول 25.0 ميكرولتر
    6. رد فعل لاحتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في فرن التهجين.
    7. بعد رد فعل مكان الحضانة على الجليد.
  2. ثاني ستراند التجميعي :
    1. إضافة العناصر التالية :
      أول رد فعل ستراند 25.0 ميكرولتر
      الثانية الاحتياطي ستراند 2.5X 40.0 ميكرولتر
      جيش صرب البوسنة ، 1 ملغ / مل 5.0 ميكرولتر
      بوليميراز الدنا أنا ش 23 3.0 ميكرولتر
      ريبونوكلياز H 0.8 ش ميكرولتر 0.5... 1.5 ش / ميكرولتر
      Nuclease المياه مجانا ميكرولتر 26.5
      اجمالى حجم التداول 100.0 ميكرولتر
    2. المزيج بلطف عبها الأنبوب. احتضان ردود الفعل عند 14 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في thermocycler. فمن المهم لتبريد thermocycler إلى 14 درجة مئوية قبل إضافة أنابيب التفاعل. لا تدع الحصول على رد فعل فوق 14 درجة مئوية قبل أو أثناء عملية التفاعل.
    3. لإنهاء رد الفعل ، إضافة 2 وحدات البلمرة DNA T4 مرنا في إدخال ميكروغرام في رد الفعل. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 14 درجة مئوية.
    4. وقف رد الفعل من خلال إضافة 10 ميكرولتر من 500 مم DEPC EDTA المعالجة ومكان على الجليد.
    5. [كدنا] تنظيف باستخدام إما EtOH هطول الأمطار أو معالج Promega نظام تنظيف الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. عينات في مخزن -80 درجة مئوية. يمكن المزدوج تقطعت بهم السبل [كدنا] pyrosequenced مباشرة عند هذه النقطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد أصبح التحقيق في التعبير الجيني للمجتمعات الميكروبية الطبيعية شيوعا في السنوات الأخيرة كوسيلة لاستكشاف الأدوار البيئية ووظائف الكائنات الحية الدقيقة. استعملت في تآلف مع الكشف والتقدير الكمي ، وتوصيف الكائنات المجهرية البحرية ، ويمكن استخدام تحليل التعبير الجيني لربط نسالة لتعمل في المجتمعات الميكروبية الطبيعية. العديد من التقنيات لاستهداف الجينات الوظيفية تعتمد على تحقيقات معينة أو مجموعات التمهيدي مصممة لتسلسل الجينات المعروفة. في المقابل ، يمكن استخدام transcriptomics البيئية لدراسة التعبير الجيني دون القيود التي تفرضها المعطيات الحالية وتسلسل مع تفضيل تلك الجينات يجري التعبير عنه بنشاط. يمكن تحليل تجمع مرنا في بيئة توفر بالتالي واحدة من أكثر الطرق فعالية في اكتشاف صلات بين الأنشطة الرئيسية والكائنات الحية التي توسط فيها.

قدم الطلب الأولي للtranscriptomics البيئية واحدة من وجهات النظر الأولى لتكوين وديناميات تجمع مرنا البكتيرية في 3 الإيكولوجي الطبيعي. وكشف تحليل للجينات التي أعرب عنها في مكتبات نسخة من كل من المستنقعات المالحة في المناطق الساحلية (Sapelo الجزيرة ، GA) والقلوية ، والملوحة البحيرة (بحيرة مونو CA) تسلسل الجينات ذات الاهتمام البيوجيوكيميائية ، بما في ذلك المتغيرات البيئية للجينات وظيفية عدة مثل chitinases والكبريت الجينات الأكسدة التي كانت محددة لكل من هذه النظم الإيكولوجية. وقدمت أيضا أدلة على العمليات ، ورواية غير متوقعة مثل التحلل الميكروبي للمصنع الأمينات والطحالب والأوعية الدموية والمستمدة من الكربون والمصادر الممكنة النيتروجين.

كما تتطور التقنيات الجزيئية للحد من القيود المرتبطة بالعمل مع الحمض النووي الريبي من العينات البيئية وتحسين تقنيات التسلسل ، أصبح transcriptomics البيئية أكثر تقنية تستخدم على نطاق واسع. وقد تم استخدامه لفحص وظائف الكائنات الحية الدقيقة في سطح المحيطات (6) وقارن بين اليوم والليلة التعبير الجيني وظيفية داخل نفس البيئة 7. ويمكن أيضا أن تستخدم transcriptomics البيئية من أجل الحصول على فهم أفضل للردود الميكروبية إلى عوامل بيئية محددة والبيوجيوكيميائية. ويمكن اكتشاف الجينات أو وظائف باستخدام هذه التقنية بمثابة أهداف لمزيد من الدراسات الكمية في التعبير الجيني مثل PCR ميكروأرس والكمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

تم توفير التمويل بواسطة غوردون وبيتي مور منح المؤسسة والمؤسسة الوطنية للعلوم منح MCB - 0702125.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PowerSoil Bead Tubes kit MoBio 12866-25-PBT
RNeasy Mini Kit kit Qiagen 74104
TURBO DNA-free kit Ambion AM1907
mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit kit Epicentre Biotechnologies MOP51010/MOP51024
MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit kit Ambion AM1905
MICROBEnrich kit kit Ambion AM1901
MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit kit Ambion AM1790
Universal RiboClone cDNA Synthesis System kit Promega Corp. C4360
Wizard DNA Clean-Up System kit Promega Corp. A7280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257, (5072), 967-967 (1992).
  2. Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
  3. Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71, (7), 4121-4121 (2005).
  4. Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87, (5), 1663-1663 (1990).
  5. Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437, (7057), 376-376 (2005).
  6. Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (10), 3805-3805 (2008).
  7. Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11, (6), 1358-1375 (2009).
تحليل الجينات من المجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام Transcriptomics البيئية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poretsky, R. S., Gifford, S., Rinta-Kanto, J., Vila-Costa, M., Moran, M. A. Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics. J. Vis. Exp. (24), e1086, doi:10.3791/1086 (2009).More

Poretsky, R. S., Gifford, S., Rinta-Kanto, J., Vila-Costa, M., Moran, M. A. Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics. J. Vis. Exp. (24), e1086, doi:10.3791/1086 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter