Summary
我们提出了一个方法生成环境的mRNA的cDNA。在一般情况下，总RNA是第一次从环境中收集，rRNA的选择性去除，mRNA的选择性扩增，并从丰富的mRNA池合成cDNA测序。使用标准的生物信息学技术确定基因表达，恢复序列，可以注明。
Abstract
类似于宏基因组学，环境转录（metatranscriptomics）检索和环境微生物组合没有先验知识的社会可能是哪些基因表达序列的mRNA。因此，它提供了最不偏不倚的角度，对社区的基因表达
Protocol
工作与RNA
由于RNase的是无处不在的mRNA迅速降解，在核糖核酸酶自由的环境中工作，必须遵循和样品应尽快以下尽可能收集加工或腌制的标准预防措施。
第1部分：环境RNA集合 （旨在收集在0.2 - 3.0微米大小的一小部分生物量）
用品需要：
的Masterflex管
蠕动泵
3微米高容量褶囊式过滤器
苏泊尔0.22微米或聚碳酸酯142毫米过滤器
142毫米的过滤塔（岩土环保设备）
10-20大号Carboy（毕业）
旋涡包
液氮
RLT缓冲（QIAGEN）
β-巯基乙醇
安装：
每当处理的过滤器或触摸过滤器行的内部组件，应戴上干净的手套。应保持干净，最好用充满乙醇50 ml锥形管，镊子。要防止在成绩单池中的重大变化，保持尽可能短的过滤和样品处理时间。
管子的一端放入水中进行采样所需的深度。在另一端，附加3微米过滤器的高容量。连接到0.22微米的过滤塔3微米过滤器。直接从0.22微米到一个毕业于carboy流出。
程序：
- 运行通过该系统的几公升的水（没有0.22微米的过滤器）冲洗。完成后，从水中取出油管，而泵运行，以清除剩余的水，从行。
- 使用镊子，将0.22微米过滤器过滤塔和密切。
- 行的末尾放置入水，打开泵。从过滤器清除空气。监控carboy毕业过滤的水量。
- 当所需的卷已被过滤，去除水中行，从系统中清除剩余的水。
- 只要是干燥过滤器，迅速取下顶部的过滤板和折叠过滤器。放置到一抡包或15 mL收集管中含有β-巯基乙醇2毫升的RLT缓冲的过滤器。管理单元在液氮中冷冻。
第2部分：0.22微米过滤器的总RNA提取
这部分与制造商的指示进行修改使用QIAGEN公司的RNeasy试剂盒
- 准备，加入8毫升的RLT缓冲（添加β-巯基乙醇）到50毫升锥形管珠跳动管。添加1-2毫升的RNA珠从MoBio Powersoil提取试剂盒
- 快速从冰箱中取出冷冻过滤器，并保持在抡包，粉碎一棒。另外，切小块，在收集管，用消毒的刀片（15毫升）的过滤器，并把它添加所有的准备管（50毫升）。
- 粉碎过滤，加入准备管（50毫升），并用封口膜或实验室胶带密封管盖。
- 涡10分钟以最快的速度为50毫升管附件使用一个vortexer。
- 在室温下1分钟5000转离心50毫升管。
- 尽可能的裂解可能删除，并转移到一个15毫升的管。
- 15毫升管离心5分钟在5000 X G.
- 转移上清到一个新的50毫升管（〜7毫升）。
- 新增1 100％乙醇的体积（〜7毫升）的裂解。
- 使用适合到50毫升管的30毫升注射器，吸取裂解液通过18-21号针头，并回传了出来〜5倍。完成后，留在注射器的裂解。
- 继续与QIAGEN公司的RNeasy试剂盒提取。这里是有帮助的使用真空歧管，自裂解量（〜14毫升），比原来的工具包协议（0.7毫升）高得多。另外，裂解液可以通过列加入700μL，离心，并重复，直到所有裂解液已被应用到列。
- 自旋列放置在真空歧管，适用于700μL的样品。应用的画下来的裂解气歧管的真空压力。继续从注射器加入裂解液，直到所有已应用于列。
- 加入700μL缓冲液RW1列，并利用真空压力。
- 加入500μl缓冲的RPE列，并利用真空压力。
- 添加500μL缓冲的RPE第二等分列，并利用真空压力。
- 一旦洗已经完全制定，删除列在收集管和地点。
- 8000小工1分钟离心管流丢弃。
- 离心2分钟在8000 XG摆脱乙醇。
- 将列传输到一个新的2毫升COLlection管。吸取35μL无RNase水直接喷在膜。关闭管，让1分钟的立场。
- 离心2分钟，在8000小工
- 量化的总RNA，分光光度计。
第3部分。 DNA酶处理
根据制造商的指示，这部分使用的Ambion公司的涡轮DNA的免费工具包
- 添加3.4μL10X DNA酶我缓冲区和加入1μlrDNase我RNA样品。
- 在37℃孵育30分钟。
- 旋涡DNA酶失活的试剂和样品的灭活剂中添加3.4μL。
- 孵育2分钟在室温搅拌偶尔。
- 自旋为10.000 XG在室温下为1.5分钟，然后将上清转移到新管。避免引入新鲜管灭活试剂。
第4部分。第一rRNA基因去除
根据制造商的指示，这部分使用的震中的mRNA -套件
- 轻轻混匀，短暂离心前的mRNA - 10X反应缓冲使用。
- 在无菌（无RNase）0.5毫升管，冰下面的反应元件结合：
的mRNA - 10X反应缓冲 2.0μL 核糖核酸酶抑制剂 0.5μL 总RNA样品（200 NG - 10微克） 16.5μL 终结者核酸外切酶（1个单元） 1.0μL 总成交量 20.0μL - 孵育反应30 ° 60分钟，在热循环仪（热盖）或水浴C。
- 终止与苯酚/乙醇沉淀反应：
- 加入无RNase的水的总体积200μL（= 180μL）。
- 摘录：酚：氯仿（1:1），1卷（= 200μL）。涡大力，然后以最快的速度旋转2-5分钟。
- 取出水相（约200μL）。
- 添加0.1卷3 M醋酸钠（20μL）+ 2.5 100％冰冷乙醇的体积（500μL）
- 孵育15-30分钟-80 º C。
- 佩莱在4℃，最高时速可达30分钟，注意管，为以后的样品愿望（颗粒可以不难看出）的位置。
- 弃去上清液用吸引器或吸管。
- 洗净与500μL70％冰冷的乙醇。悬浮由振荡。
- 离心机以最快的速度为10分钟。弃上清。
- 离心管10分钟以最快的速度再次剩余的液体。
- 小心吸液和干颗粒完全离开它打开引擎盖下〜10分钟。
- 在15-20μL无RNase H2O悬浮（MICROBExpress最大输入量为15μL）;让它站立在室温下5分钟。
- 使用生物分析仪或的Experion检查rRNA的污染和在此步骤中的mRNA的质量。
- 这是一个潜在的停止点。 RNA可以储存在-80℃储存。
第5部分。第二个rRNA基因去除
这部分采用Ambion公司MICROBEnrich和MICROBExpress包根据 制造商的指示。两种试剂盒可多次使用，以提高效率（MICROBEnrich）真核和原核（MICROBExpress）rRNA基因去除 。 总RNA的输入应该是2-10微克之间 。 RNA的量应少于15μL。因此，理想的输入> 150毫微克/μL。 -
MICROBEnrich
- 移取300μL结合缓冲液成1.5毫升管
- 5-100微克总RNA加入30μl和旋涡轻轻的一个最大音量
- 5微克的RNA结合缓冲液中加入2μL捕捉寡糖混合。轻轻点击管，并简要降速的混合物。
- 变性混合在70 ° C下10分钟
- 在37℃1小时退火的混合物。准备在此孵化的珠子。
- 准备寡糖MagBeads（通常为25μL），无核酸酶水和洗一次，一旦结合缓冲液中，捕捉一个清洗间的磁立场上的珠子。储存在冰珠。暖室温5分钟，使用前。
- 洗涤液加热至37 ° C加热块。
- 添加RNA /捕获寡核苷酸混合洗净寡糖MagBeads。轻轻地混合管和旋转简要。
- 孵育混合在37℃15分钟。
- 管放置在磁场的立场和等待〜3分钟。
- 吸上清液（包含的mRNA）和转移到一个收集管冰。
- 预热洗涤液加入100μL抓获珠。轻轻振荡珠简要。 捕捉珠上清和恢复。池与冰收集管中的mRNA（〜450μL年底量）上清。
- 将收集管上的冰。如果第二轮将要执行的，回去到5.3）部分，并重复上述步骤。另外，开关立即MICROBExpress套件（5.18，见下文）。
- 用于OlioBeads可用于第二次。再生孵化与再生液1（通常为50μL）1小时2卷Oligobeads。捕捉的珠子，在磁场的立场。洗两次与再生液2（通常为50μL）2卷，重悬在其原始卷的再悬浮溶液（通常为25μL）。
MICROBExpress - 移液器200μL结合缓冲液成1.5毫升管。
- 加入15μl和旋涡轻轻的最大音量在2-10μg总RNA。
- 捕捉寡糖混合加入4μL结合缓冲液中的RNA。轻轻点击管，并简要降速的混合物。
- 变性混合在70 ° C为10分钟。
- 退火的混合物在37℃，15分钟准备在此孵化珠。
- 准备寡糖MagBeads无核酸酶水冲洗一次，随后由两个50μL结合缓冲液洗涤，捕捉一个清洗间的磁立场上的珠子。重悬珠在50μL结合缓冲液和孵化在37℃直至使用。
- 洗涤液加热至37 ° C加热块
- 涡洗寡糖MagBeads轻轻。添加50μL的寡核苷酸MagBeads的RNA /捕获寡糖混合。轻轻地混合管和旋转简要。
- 在37℃15分钟的组合。
- 管放置在磁场的立场和等待〜3分钟。
- 吸上清液（包含的mRNA）和转移到一个收集管冰。
- 预热洗涤液加入100μL抓获珠。轻轻振荡珠简要。
- 捕捉珠上清和恢复。池与冰收集管中的mRNA（〜350μL年底量）上清。
- 如果第二轮将要执行，返回到第5.18节），并重复上述步骤。此外，立即着手mRNA的降水。
- 沉淀和悬浮表达：
- 要汇集表达中加入35μl醋酸钠和添加7μL糖原。
- 添加1175μL冰冷的100％的乙醇和旋涡彻底。
- 在-20 ° C沉淀至少1小时。
- 离心30分钟10.000小工
- 小心倒出上清液。
- 添加750μL冰冷的70％乙醇和涡简要。
- 10.000 XG和离心5分钟，弃上清。
- 做了第二次的70％乙醇洗。
- 简要respin管的第二个70％的乙醇洗涤后丢弃。
- 用移液器小心取出任何上清。
- 空气干燥5分钟沉淀。
- 重悬的RNA沉淀在25μLTE缓冲液中或核糖核酸酶自由水
- 在室温为15分钟，补充水分的RNA。
- 涡样品大力如有必要。
- 如果有必要取消对磁立场〜3分钟的剩余珠，地方管和丰富的mRNA移动到新的核糖核酸酶自由管。
- 使用生物分析仪或的Experion检查rRNA的污染和在此步骤中的mRNA的质量。
- 这是一个潜在的停止点。 RNA可以储存在-80℃储存。
第6部分：基因扩增
这部分使用的Ambion公司MessageAmp II细菌试剂盒，根据制造商的指示。 计算掌握混合在网上www.ambion.com/tools/ma2bact 。
- 多聚腺苷酸化的模板RNA：
- 广场高达1000纳克的总RNA（一般为100-500吴）或高达500毫微克的mRNA（通常是10 NG - 200纳克）的无菌无RNase离心管。使用6.5μL的样品和无RNase的自由水，在第一个缓冲区。
- 在70 ° C孵育10分钟，最好是在一个热循环。
- 删除从70℃的孵化器和离心（〜5秒）的RNA样品收集管底部的样品。混合物放置在冰浴3 min。
- 准备计算表上显示的顺序在室温无核酸管聚腺苷酸法师组合。组装足够所有样品在实验中的主结构，包括≤5％的盘盈盖移液错误。轻轻涡旋未经灭活的酶，使一个均匀混合物，然后离心收集在试管底部的主组合〜5秒。
- 3.5聚腺苷酸法师组合，每个RNA样品液转移，调匀温和的震荡和快速自旋的收集反应。
- 放置在37℃孵化器的样品。 15分钟的孵育反应在37 ° C，然后离心收集在试管底部的反应。
- 37℃孵育后，置于冰上反应，并立即进行反转录。
- 反转录合成第一链cDNA：
- 准备计算表上显示的顺序在室温无核酸管反转录预混。组装足够所有样品在实验中的主结构，包括≤5％的盘盈盖移液错误。轻轻涡旋未经灭活的酶，使一个均匀混合物，然后离心收集在试管底部的主组合〜5秒。
- 10μL逆转录硕士混合传输到每个样品中，调匀，轻轻振荡，快速自旋的收集反应。
- 放置在42℃孵化器的样品。孵育2小时，在42 ° C，然后短暂离心（〜5秒），收集在试管底部的反应。
- 管置于冰上，并立即进行第二链cDNA合成。
- 第二链cDNA合成：
- 在冰上，准备二股主混合下列试剂混合计算表中显示的顺序。组装足够所有样品在实验中的主结构，包括≤5％的盘盈盖移液错误。轻轻涡旋没有失活的酶，使一个均匀混合物，然后离心收集在试管底部的主组合〜5秒。
- 每个样品80μl第二链预混的转移，调匀，轻轻振荡，快速自旋的收集反应。
- 放置在16 ° C的热循环仪的样本。冷却至16℃前加入反应管，因为受反应温度> 16 ° C会损害ARNA产量的热循环块，它是重要的。
- 孵育2小时16 ° C孵育2小时在16 ° C的热循环仪。如果盖的温度不能调整，以符合16 ° C块温度，盖上热盖关闭的反应，如果盖子不能关闭不包括与它的管。
- 将冰简要的反应。不要长时间离开冰的反应。
- 5.4）cDNA的分离纯化：
- 应该在这个净化过程中的所有离心万XG在室温（通常〜10,000 RPM）。在使用前检查结合缓冲液沉淀的cDNA。如果是可见的沉淀，溶解，升温至37 ° C，最多10分钟的解决方案，并大力涡旋。冷却到室温使用前的临时。
- 在开始的cDNA净化，预热无核酸酶水10毫升一瓶至50 ° C至少10分钟。
- 加入到每个样品250μL的cDNA结合缓冲液，调匀，轻轻振荡。
- 离心10,000克〜1分钟，或直到混合物通过过滤器。丢弃的流量通过，并更换滤芯在冲洗管的cDNA。
- 500μL洗涤缓冲液应用到每个基因滤芯。离心10,000克〜1分钟，或直到所有的洗涤缓冲液通过过滤器。丢弃流量通过和自旋额外分钟，以去除微量乙醇的cDNA滤芯。
- 转移基因的cDNA洗脱管滤芯。 20μL50 ° C无核酸酶水洗脱的cDNA。重要的是要使用的cDNA洗脱无核酸酶水，在50 ° C的。冷水将洗脱的cDNA，效率较低和较热的水（> 55℃），可能会导致ARNA产量减少。
- 要在中心的cDNA滤芯过滤器，适用于20μL预热（50℃）无核酸酶水。保留在室温2分钟，然后离心万XG〜1.5分钟，或直至所有无核酸酶水通过过滤器。双链cDNA现在将在洗脱（〜16μL）。
- 纯化的基因可存放于-80 ° C，在这一点上过夜，如果需要的话。
- 体外转录合成ARNA
- 建议使用，因为其温度均匀，杂交炉，因为它是非常重要的，并不构成管道内的冷凝的。我们强烈建议的14小时IVT反应潜伏期ARNA产量最大化。 ARNA产量最高，最终在40μL反应体积进行IVT的。
- 在室温下，组装IVT预混，在计算表中列出的顺序添加试剂。充分混匀，轻轻振荡。短暂离心（〜5秒）到山坳lect IVT预混管置于冰上底部。
- 传输IVT的法师组合，每个样本计算表的指引，组合彻底温和的震荡，短暂离心收集反应，并将其放置在37℃孵化器的管。
- 14小时在37 ° C。
- 孵化后，添加无核酸酶水到每个ARNA样品，使最终体积为100μL。调匀，轻轻振荡。广场上的冰稀释ARNA ARNA纯化步骤，将立即进行。另外，可以储存在-20 ° C ARNA
- ARNA净化
- 在本节中的所有离心应该在10.000 XG（通常〜10,000 RPM）。
- 开始之前ARNA净化预热无核酸酶水10毫升至55℃，> 10分钟。
- ARNA结合缓冲液中添加350μL，每个ARNA样品。调匀，轻轻振荡，并立即进行下一步。
- 移液的混合物向上和向下的3倍，新增250μLACS级每个ARNA样品100％的乙醇，混匀。不要旋涡混合。只要你有到每个样品的乙醇混合立即着手下一步。
- ARNA收集管放置在一个ARNA滤芯，每个样品的混合物滴入ARNA滤芯过滤器的中心。
- 〜1分钟离心10,000 × G.继续，直到混合物通过过滤器通过。丢弃的流量通过和ARNA收集管取代ARNA滤芯。
- 应用650μL洗涤缓冲液到每个ARNA滤芯。离心1分钟，在10000 XG，或直到所有的洗涤液通过过滤器。丢弃流量通过和自旋ARNA滤芯额外〜1分钟，以去除微量乙醇。
- 传输滤芯（S）ARNA到一个新的收集管。滤波器的中心，添加75μL无核酸酶水预热至50-60 ° C。更换无核酸酶水在50-60℃孵化器的容器。
- 保留在室温2分钟，然后离心万XG〜1.5分钟，或直至该解决方案是通过过滤器。
- 第二个75μL无核酸酶水的重复洗脱。 ARNA现在ARNA〜150μL无核酸酶水收集管。丢弃ARNA滤芯。
- 商店ARNA在-80 ° C，并尽量减少重复冷冻解冻。
第7部分：合成cDNA
这部分稍作修改，以制造商的指示使用Promega的通用RiboClone cDNA合成系统套件。标准输入2微克; 454测序，建议开始与10微克。如果浓度太低，ARNA可以集中或者乙醇沉淀或真空浓缩。如果使用10微克的RNA输入，然后扩展所有试剂5The酶在不同的每一批次的单位来的一个因素，因此量要计算每次。
- 第一链合成：
- 以0.5 ml PCR管中，并添加：
基因样本 2微克（或10微克，如果用454测序） 随机六角底漆（0.5毫克/毫升） 2μL 核酸自由水体积 0（或非样品稀释） 总成交量 15μL - 反应加热到70 ° C为10分钟。冰寒管冰浴5分钟和自旋简要收集管底部的解决方案。
- 所显示的顺序添加以下组件：
样品 15μL 第一链5X缓冲 5μL RNasin核酸酶抑制剂40 U 1μL... 40 U /μL 总成交量 21μL - 混合reaction和旋转简要。热的混合物在37 ° C为5分钟。
- 添加以下组件：
从第1步样本 21.0μL 焦磷酸钠，40毫米 2.5μL AMV反Trancriptase 30 U 1.5μL... 22 U /μL 核酸免费水 0.0μL 总成交量 25.0μL - 在37 ° C的杂交炉反应1 h。
- 孵育后，置于冰上反应。
- 以0.5 ml PCR管中，并添加：
- 第二链的合成：
- 添加以下组件：
第一链反应 25.0μL 第二链2.5X缓冲区 40.0μL BSA，1毫克/毫升 5.0μL DNA聚合酶我23 U 3.0μL 核糖核酸酶H 0.8 ü 0.5μL... 1.5 U /μL 核酸免费水 26.5μL 总成交量 100.0μL - 轻轻弹管混合。反应孵育14 ° C为一个热循环2小时。重要的是要冷却至14℃前加入反应管的热循环。不要让超过14℃前或在反应过程中反应。
- 终止反应，加2个单位每微克输入的mRNA反应的T4 DNA聚合酶。孵育10分钟，在14 ° C。
- 停止加入10μL500毫米处理EDTA的DEPC置于冰上的反应。
- 清洁的cDNA根据制造商的说明使用乙醇沉淀或Promega的向导DNA清理系统。商店的样品在-80 ° C双链cDNA可直接pyrosequenced在这一点上。
- 添加以下组件：
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Discussion
基因表达的天然微生物群落的调查，近年来已成为共同探索微生物的生态作用和功能的一种手段。海洋微生物的检测，量化，并表征结合使用，可用于基因表达分析链接系统发育功能的天然微生物群落。为目标的功能基因表达的许多技术，依赖于特异性探针或基因的已知序列设计的引物。相比之下，环保转录可用于研究基因的表达没有施加的限制，现有的序列数据，并正在积极表达这些基因的偏好。对在环境中的mRNA池的分析，因此可以提供之间的主要活动和调解他们的生物体中发现连接的最有效途径之一。
环境转录初始应用程序提供了一个在自然生态系统的3中的细菌基因池的组成和动态的第一个意见。成绩单库从一个沿海的盐沼（Sapelo岛，GA）和碱性盐湖，湖（莫诺湖CA）的基因表达分析，发现基因序列的生物地球化学的兴趣，其中包括几个功能基因，如几丁质酶和硫的环境变异，氧化基因，这些生态系统中的每个具体。它还提供了意想不到的新颖，如维管束植物和藻类衍生多胺作为一种可能的碳和氮的来源的微生物降解过程的证据。
随着分子生物学技术的发展，以减少与环境样品，并与RNA测序技术的改进相关的限制，环境转录已成为一个更广泛使用的技术。它已被用于研究在海洋表面6的微生物的功能和比较在相同的环境 7日夜功能基因的表达。环境的转录也可以用于特定的环境因素和生物地球化学获得一个更好地了解微生物反应。基因功能发现使用这种技术可以作为定量研究基因表达微阵列和定量PCR等目标。
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Acknowledgments
经费是由戈登和贝蒂摩尔基金会赠款和美国国家科学基金会的资助MCB - 0702125。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega Corp. | A7280 |
References
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