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Biology

Analysant l'expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement

doi: 10.3791/1086 Published: February 18, 2009

Summary

Nous présentons une méthode pour générer des ADNc de l'ARNm de l'environnement. En général, l'ARN total est d'abord recueilli de l'environnement, l'ARNr est enlevé sélectivement, l'ARNm est sélectivement amplifié, et l'ADNc synthétisé à partir de la piscine ARNm enrichi est séquencé. Séquences récupérés peuvent être annotés en utilisant des techniques standard de la bioinformatique pour identifier les gènes exprimés.

Abstract

Analogue à la métagénomique, transcriptomique de l'environnement (metatranscriptomics) récupère et les séquences des ARNm de l'environnement à partir d'un assemblage de micro sans connaissance préalable de ce que les gènes de la communauté pourrait être exprimer. Ainsi, il offre la perspective la plus impartiale sur l'expression du gène de la Communauté

Protocol

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Travailler avec l'ARN

Parce RNases sont omniprésents et les ARNm se dégrader rapidement, les précautions standard pour travailler dans un environnement exempt de ribonucléase doivent être suivies et les échantillons doivent être traités ou conservés dès possible après le prélèvement.

Partie 1: environnement ARN Collection (conçu pour collecter la biomasse dans la fraction granulométrique 0,2 à 3,0 um)

Fournitures nécessaires:
Tube Masterflex
Pompe péristaltique
3 microns filtre haute capsule de volumes plissés
0,22 um ou Supor en polycarbonate 142 mm de filtre
142 mm Filtre tour (Geotech Environmental Equipment)
10-20 l Tourie (diplômé)
Packs Tourbillon
L'azote liquide
Tampon RLT (Qiagen)
Les bêta-mercaptoéthanol

Configuration:
Nettoyer les gants devraient être portés lors de la manipulation des filtres ou de toucher l'un des composants intérieurs de la ligne de filtre. Pince devraient être conservés dans un endroit propre, 50 ml tubes coniques, de préférence remplie avec de l'éthanol. Afin d'éviter des changements majeurs dans la piscine transcription, garder le filtrage et les temps de manipulation des échantillons aussi courte que possible.

Placez une extrémité du tube dans l'eau à la profondeur désirée pour l'échantillonnage. À l'autre bout, attachez le volume élevé 3 microns filtre. Connectez le filtre à 3 um à la tour de filtre de 0,22 um. Direct la sortie de la 0.22 um dans une tourie graduée.

Procédure:

  1. Exécuter plusieurs litres d'eau par le système (pas de filtre de 0,22 um) pour le rinçage. Lorsque vous avez terminé, retirez le tuyau de l'eau lorsque la pompe est en marche pour purger le reste de l'eau de la ligne.
  2. En utilisant des pinces, placer un filtre de 0,22 um sur la tour de filtre et fermer.
  3. Placez l'extrémité de la ligne du dos dans l'eau et tourner sur la pompe. Purger l'air à la fois des filtres. Surveiller le volume d'eau filtrée avec la graduation sur la bonbonne.
  4. Lorsque le volume désiré a été filtré, supprimer la ligne de l'eau et purger l'eau restant dans le système.
  5. Dès que le filtre est sec, enlever rapidement la plaque supérieure du filtre et de plier le filtre. Placez le filtre dans un pack tourbillon ou 15 ml contenant le tube collecteur de 2 ml de tampon RLT avec des bêta-mercaptoéthanol. Aligner geler dans l'azote liquide.

Partie 2: extraction d'ARN total à partir de 0,22 um de filtre

Cette partie utilise le kit Qiagen RNeasy Mini avec des modifications aux instructions du fabricant

  1. Préparer perles tubes battre en ajoutant 8 ml de tampon RLT (béta-mercaptoéthanol ajoutée) dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 1-2 ml de billes d'ARN à partir d'un kit d'extraction Mobio Powersoil
  2. Vite retirer le filtre du congélateur et le maintenir dans le peloton tourbillon, la briser avec un maillet. Sinon, couper les filtres en petits morceaux dans le tube collecteur (15ml) à l'aide d'une lame de rasoir stérile et ajouter tous les tubes préparés (50ml).
  3. Ajouter le filtre brisé le tube préparé (50ml), et sceller le couvercle du tube avec du parafilm ou une bande de laboratoire.
  4. Vortex pendant 10 minutes à la vitesse supérieure en utilisant une Vortexer avec une attache pour tubes de 50 ml.
  5. Centrifuger le tube de 50 ml à 5000 rpm pendant 1 min à température ambiante.
  6. Enlever autant que possible du lysat et le transférer dans un tube de 15 ml.
  7. Centrifuger le tube de 15 ml pendant 5 min à 5000 x g.
  8. Transférer le surnageant (~ 7 ml) à un nouveau tube de 50 ml.
  9. Ajouter 1 volume (~ 7 ml) de EtOH à 100% au lysat.
  10. En utilisant une seringue de 30 ml, qui s'insère dans le tube de 50 ml, dessiner le lysat à travers une aiguille 18-21 gauge et il passe en retrait à ~ 5 fois. Lorsque vous avez terminé, quittez le lysat dans la seringue.
  11. Continuer l'extraction avec le kit Qiagen RNeasy Mini. Il est utile d'utiliser un collecteur à vide ici, puisque le volume de lysat (~ 14ml) est beaucoup plus élevé que le protocole du kit d'origine (0,7 ml). Alternativement, le lysat peut être établi grâce en ajoutant 700 ul de la colonne, la centrifugation, et en répétant jusqu'à ce que tous le lysat a été appliquée à la colonne.
  12. Placer une colonne spin sur le collecteur d'aspiration et d'appliquer 700 pl de l'échantillon. Appliquer une pression de vide à la tubulure de puiser dans le lysat. Continuez à ajouter le lysat de la seringue jusqu'à ce que tous, il a été appliqué à la colonne.
  13. Ajouter 700 pi de tampon RW1 à la colonne et tirer vers le bas avec la pression à vide.
  14. Ajouter 500 pi de tampon RPE à la colonne et tirer vers le bas avec la pression à vide.
  15. Ajouter une seconde portion aliquote de 500 ul de tampon RPE à la colonne et tirer vers le bas avec la pression à vide.
  16. Une fois le lavage a été entièrement dessiné, enlever la colonne et le placer dans un tube de collecte.
  17. Centrifuger le tube pendant 1 min à 8000 x g. Jeter l'éluat.
  18. Centrifuger 2 min de plus à 8000 xg pour se débarrasser de l'EtOH.
  19. Transfert de colonne à une nouvelle colonne 2 mltube de collecte. Pipeter 35 pl d'eau sans RNase directement sur la membrane. Fermer le tube et laisser reposer pendant 1 min.
  20. Centrifuger pendant 2 min à 8000 x g.
  21. Quantifier les ARN totaux par spectrophotométrie.

Partie 3. DNAse traitement

Cette partie utilise l'ADN sans Ambion TURBO kit selon les instructions du fabricant

  1. Ajouter 3,4 ul 10x DNase I tampon et 1 microlitre rDNase I de l'échantillon d'ARN.
  2. Incuber à 37 º C pendant 30min.
  3. Vortex, le réactif d'inactivation de DNase et ajouter 3,4 ul de réactif d'inactivation de l'échantillon.
  4. Incuber 2 minutes à température ambiante avec mélange occasionnel.
  5. Spin à 10,000 xg pendant 1,5 min à température ambiante, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube. Évitez d'introduire le réactif d'inactivation dans le tube frais.

Partie 4. D'abord l'enlèvement d'ARNr

Cette partie utilise le kit Epicentre ARNm UNIQUEMENT selon les instructions du fabricant

  1. Mélanger délicatement et centrifuger brièvement le tampon ARNm seule réaction 10X avant de l'utiliser.
  2. Dans un stérile (sans RNase) 0,5 ml tube, mélanger les composants de la réaction suivante sur la glace:
    ARNm-tampon de réaction 10X SEULEMENT 2,0 ul
    Inhibiteur de RNase 0,5 ul
    Total des échantillons d'ARN (200 ng-10 ug) 16,5 ul
    Exonucléase Terminator (1 unité) 1,0 ul
    Le volume total 20,0 ul
  3. Incuber la réaction à 30 ° C pendant 60 min dans un thermocycleur (avec couvercle chauffant) ou bain-marie.
  4. Terminer la réaction avec des précipitations de phénol / EtOH:
    1. Ajouter RNase H2O à un volume total de 200 pi (= 180 pl).
    2. Extrait: phénol: chloroforme (1:1), 1 volume (= 200 pi). Vortex vigoureusement puis tourner 2-5 min à la vitesse supérieure.
    3. Retirer phase aqueuse (~ 200 pi).
    4. Ajouter 0,1 volumes d'acétate de sodium 3 M (20 pi) + 2,5 volume de 100% glacée EtOH (500 pl)
    5. Incuber à -80 º C pendant 15-30 min.
    6. Pellet à 4 º C, vitesse de pointe, 30 min; noter la position du tube d'aspiration de l'échantillon tard (à granulés peut être difficile à voir).
    7. Rejeter le surnageant à l'aspirateur ou une pipette.
    8. Laver avec 500 EtOH à 70% de glace ul froid. Resuspendre par vortex.
    9. Centrifuger pendant 10 min à la vitesse supérieure. Rejeter le surnageant.
    10. Centrifuger le liquide restant dans le tube à nouveau 10 min à la vitesse supérieure.
    11. Aspirer le liquide soigneusement et culot sec complètement en le laissant ouvert pour ~ 10 min sous le capot.
    12. Resuspendre dans 15-20 ul RNase H2O (volume d'entrée maximale de 15 pi est MICROBExpress); laisser reposer pendant 5 min à température ambiante.
    13. Utilisez Bioanalyzer ou Experion pour vérifier la contamination et la qualité de l'ARNr ARNm à cette étape.
    14. Ceci est un point d'arrêt potentiels. L'ARN peut être conservé à -80 ° C de stockage º.

Partie 5. Deuxième retrait ARNr

Cette partie utilise les Ambion et MICROBEnrich kits MICROBExpress conformément aux instructions du fabricant. Les deux kits peuvent être utilisés plusieurs fois pour augmenter l'efficacité des eucaryotes (MICROBEnrich) et procaryotes (MICROBExpress) la suppression d'ARNr. L'entrée de l'ARN total devrait être entre 2-10 mg. Le volume de l'ARN doit être inférieure à 15 pi. Ainsi, l'apport idéal est> 150 ng / ul. -

MICROBEnrich

  1. Pipeter 300 pi de tampon de liaison dans un tube de 1.5ml
  2. Ajouter 500 à 100 ug d'ARN total dans un volume maximal de 30μl et le vortex en douceur
  3. Ajouter 2 ul de capture Oligo Mélangez pendant 5 ug d'ARN dans un tampon de liaison. Tap tube doucement et brièvement spin down le mélange.
  4. Dénaturer mélange à 70 ° C pendant 10 min
  5. Recuit le mélange à 37 ° C pendant 1 heure. Préparer les perles pendant cette incubation.
  6. Préparer Oligo MagBeads (généralement 25 pl) par un lavage une fois dans une eau sans nucléase et une fois dans un tampon de liaison, capturant les perles sur un support magnétique entre les lavages. Magasin de perles sur la glace. Les réchauffer à température ambiante 5 min avant utilisation.
  7. Chauffer la solution de lavage à 37 ° C dans le bloc thermique.
  8. Ajouter l'ARN / capture Mélanger à l'Oligo Oligo MagBeads lavés. Très mélanger délicatement le tube et centrifuger brièvement.
  9. Incuber le mélange à 37 ° C pendant 15 min.
  10. Placer le tube dans le support magnétique et attendre ~ 3 min.
  11. Aspirer le surnageant (contenant l'ARNm) et le transférer à un tube de prélèvement sur la glace.
  12. Ajouter 100 ul de solution de lavage préchauffée à perles capturés. Vortexer doucement les perles brièvement. Capturez des perles et récupérer le surnageant. Piscine ce surnageant avec l'ARNm dans le tube de prélèvement sur la glace (~ 450 volume final ul).
  13. Placez le tube de prélèvement sur la glace. Si un second tour va être effectué, revenir à 5,3) de l'article et répétez la procédure. Sinon, passer immédiatement à la trousse de MICROBExpress (5.18, voir ci-dessous).
  14. OlioBeads d'occasion peuvent être utilisés une seconde fois. Régénérer le Oligobeads en les incubant avec 2 volumes (généralement 50 pi) d'une solution de régénération pendant 1 heure. Capturez les perles dans un support magnétique. Lavez-les deux fois avec 2 volumes de solution de régénération 2 (habituellement 50 pi) et de les remettre en suspension dans leur volume initial de la solution de remise en suspension (généralement 25 pl).
    MICROBExpress
  15. Pipeter 200 pi de tampon de liaison dans un tube de 1,5 ml.
  16. Ajouter de 20 à 10 ug d'ARN total dans un volume maximal de 15μl et vortex doucement.
  17. Ajouter 4 pi de capture Oligo Mélanger à l'ARN dans le tampon de liaison. Tap tube doucement et brièvement spin down le mélange.
  18. Dénaturer mélange à 70 ° C pendant 10 min.
  19. Recuit mélange à 37 ° C pendant 15 min Préparer perles pendant cette incubation.
  20. Préparer MagBeads Oligo par un lavage une fois dans une eau sans nucléase suivie de deux lavages en tampon de 50 ul reliure, capturant les perles sur un support magnétique entre les lavages. Remettre en suspension dans 50 perles tampon de liaison ul et incuber à 37 ° C jusqu'à utilisation.
  21. Chauffer la solution de lavage à 37 ° C dans le bloc thermique
  22. Vortex lavés Oligo MagBeads doucement. Ajouter 50 ul MagBeads Oligo à l'ARN / capture Mix Oligo. Très mélanger délicatement le tube et centrifuger brièvement.
  23. Incuber mélange à 37 ° C pendant 15 min.
  24. Placer le tube dans le support magnétique et attendre ~ 3 min.
  25. Aspirer le surnageant (contenant l'ARNm) et le transférer à un tube de prélèvement sur la glace.
  26. Ajouter 100 ul de solution de lavage préchauffée à perles capturés. Vortexer doucement les perles brièvement.
  27. Capturez des perles et récupérer le surnageant. Piscine ce surnageant avec l'ARNm dans le tube de prélèvement sur la glace (~ 350 volume final ul).
  28. Si un second tour va être effectué, retournez à la section 5.18) et répétez la procédure. Sinon, procéder immédiatement à l'ARNm de précipitation.
  29. Précipiter et l'ARNm resuspendre:
    1. Pour l'ARNm en commun ajouter 35 ul d'acétate de sodium et ajouter 7 glycogène ul.
    2. Ajouter de la glace 1175 ul EtOH froid 100% et le vortex soigneusement.
    3. Précipité à -20 ° C pendant au moins 1h.
    4. Centrifuger pendant 30 min à 10.000 x g.
    5. Soigneusement décanter et jeter le surnageant.
    6. Ajouter 750 ul de la glace froide EtOH à 70% et brièvement au vortex.
    7. Centrifuger pendant 5 min à 10.000 xg et éliminer le surnageant.
    8. Ne lavez une deuxième EtOH à 70%.
    9. Brièvement respin le tube après avoir jeté le second lavage EtOH à 70%.
    10. Retirez soigneusement le surnageant avec une pipette.
    11. Sécher à l'air le culot pendant 5 min.
    12. Reprendre le culot d'ARN dans 25 ul de tampon TE ou RNase l'eau
    13. Réhydrater ARN pendant 15 min à température ambiante.
    14. Vortex de l'échantillon vigoureusement si nécessaire.
  30. S'il est nécessaire de supprimer les billes restantes, tube place sur support magnétique pour ~ 3min et déplacer ARNm enrichi de nouvelles RNase tubes libre.
  31. Utilisez Bioanalyzer ou Experion pour vérifier la contamination et la qualité de l'ARNr ARNm à cette étape.
  32. Ceci est un point d'arrêt potentiels. L'ARN peut être conservé à -80 ° C de stockage º.

Partie 6: Amplification ARNm

Cette partie utilise les Ambion MessageAmp II-Les bactéries kit selon les instructions du fabricant. Calculer master mix en ligne à www.ambion.com/tools/ma2bact .

  1. Polyadénylation de l'ARN matrice:
    1. Placez jusqu'à 1000 ng d'ARN total (généralement de 100 à 500 ng) ou jusqu'à 500 ng d'ARNm (typiquement 10 ng-200 ng) dans un tube de micro sans RNase stérile. Utiliser 6,5 pl d'échantillon et aucune RNase eau libre dans le premier tampon.
    2. Incuber 10 min à 70 ° C, de préférence dans un thermocycleur.
    3. Retirer les échantillons d'ARN à partir de l'incubateur à 70 ° C et centrifuger brièvement (~ 5 s) pour recueillir l'échantillon au fond du tube. Placer le mélange sur la glace pendant 3 min.
    4. Préparer Master Mix polyadénylation dans un tube sans nucléase à température ambiante dans l'ordre indiqué sur la feuille de calcul. Assemblez master mix assez pour tous les échantillons dans l'expérience, y compris excédent ≤ 5% pour couvrir les erreurs de pipetage. Vortexer doucement pour faire un mélange homogène sans inactiver l'enzyme, puis centrifuger pendant ~ 5 s pour recueillir le mélange maître au fond du tube.
    5. Transfert 3,5 l de Mix Master polyadénylation à chaque échantillon d'ARN, mélanger soigneusement au vortex doux et suivre avec un tour rapide de recueillir la réaction.
    6. Placer les échantillons dans une étuve à 37 ° C. Réactions Incuber pendant 15 minà 37 ° C, puis centrifuger brièvement pour ramasser la réaction au fond du tube.
    7. Après l'incubation à 37 ° C, placez les réactions sur la glace et procéder immédiatement à la transcription inverse.
  2. Transcription inverse pour synthétiser premier brin d'ADNc:
    1. Préparer inverse Master Mix de transcription dans un tube sans nucléase à température ambiante dans l'ordre indiqué sur la feuille de calcul. Assemblez master mix assez pour tous les échantillons dans l'expérience, y compris excédent ≤ 5% pour couvrir les erreurs de pipetage. Vortexer doucement pour faire un mélange homogène sans inactiver l'enzyme, puis centrifuger pendant ~ 5 s pour recueillir le mélange maître au fond du tube.
    2. Transférer 10 ul de mélange de transcription maître inverse à chaque échantillon, bien mélanger au vortex doux, et suivre avec un tour rapide de recueillir la réaction.
    3. Placer les échantillons dans un incubateur à 42 ° C. Incuber pendant 2 heures à 42 ° C, puis centrifuger brièvement (~ 5 s) de recueillir la réaction au fond du tube.
    4. Placer les tubes sur la glace et de procéder immédiatement à la synthèse du deuxième brin d'ADNc.
  3. Synthèse du second brin d'ADNc:
    1. Sur la glace, préparer un mélange deuxième brin maître en mélangeant les réactifs suivants dans l'ordre indiqué dans la feuille de calcul. Assemblez master mix assez pour tous les échantillons dans l'expérience, y compris excédent ≤ 5% pour couvrir les erreurs de pipetage. Vortexer doucement pour faire un mélange homogène sans inactiver les enzymes, puis centrifuger pendant ~ 5 s pour recueillir le mélange maître au fond du tube.
    2. Transfert 80 pi de Mix Strand second maître à chaque échantillon, bien mélanger au vortex doux, et suivre avec un tour rapide de recueillir la réaction.
    3. Placer les échantillons dans un cycleur thermique 16 ° C. Il est important de refroidir le bloc du thermocycleur à 16 ° C avant d'ajouter les tubes de réaction, car les réactions en soumettant à des températures> 16 ° C sera compromis rendement ARNa.
    4. Incuber 2 heures à 16 ° C Incuber 2 h dans un 16 ° C cycleur thermique. Si la température le couvercle ne peut pas être ajustée pour correspondre à la température de 16 ° C de bloc, couvrir les réactions avec le couvercle chauffant désactivé, ou si le couvercle ne peut pas être désactivé, ne couvrent pas les tubes avec elle.
    5. Placez réactions brièvement glace. Ne laissez pas les réactions sur la glace pendant de longues périodes de temps.
  4. 5.4) Purification d'ADNc:
    1. Toutes les centrifugations dans cette procédure de purification devrait être fait à 10 000 xg (typiquement ~ 10 000 rpm) à température ambiante. Vérifiez la mémoire d'ADNc de liaison pour les précipitations avant de l'utiliser. Si un précipité est visible, il redissout par le réchauffement de la solution à 37 ° C pendant 10 min et vortex vigoureusement. Laisser refroidir à température ambiante avant utilisation.
    2. Avant de commencer la purification d'ADNc, préchauffez le flacon de 10 ml de eau sans nucléase à 50 ° C pendant au moins 10 min.
    3. Ajouter 250 pi de tampon de liaison d'ADNc à chaque échantillon et bien mélanger délicatement par le vortex.
    4. Centrifuger pendant ~ 1 min à 10000 g, ou jusqu'à ce que le mélange est à travers le filtre. Jeter l'effluent à travers et remplacer la cartouche d'ADNc de filtre dans le tube de lavage.
    5. Appliquer 500 ul de tampon de lavage à chaque cartouche filtre ADNc. Centrifuger pendant ~ 1 min à 10000 g, ou jusqu'à ce que tous le tampon de lavage à travers le filtre. Jeter l'effluent à travers et tourner la cartouche d'ADNc de filtre pour une minute supplémentaire pour enlever des traces de EtOH.
    6. Transfert d'ADNc Cartouche filtre à un tube d'élution d'ADNc. Eluer ADNc avec 20 ul de 50 ° C eau sans nucléase. Il est important d'utiliser une eau sans nucléase qui est à 50 ° C pour l'élution d'ADNc. L'eau froide sera moins efficace à élution de l'ADNc, et l'eau plus chaude (> 55 ° C) peut entraîner des rendements ARNa réduite.
    7. Pour le centre du filtre dans la cartouche filtre ADNc, appliquer 20 ul de préchauffé (50 ° C) eau sans nucléase. Laisser à température ambiante pendant 2 min, puis centrifuger pendant ~ 1,5 min à 10000 xg, ou jusqu'à ce que toute l'eau sans nucléase est à travers le filtre. L'ADNc double brin sera désormais dans l'éluer (~ 16 pl).
    8. L'ADNc purifié peut être stockée pendant la nuit à -80 ° C à ce moment si désiré.
  5. La transcription in vitro pour synthétiser ARNa
    1. Il est recommandé d'utiliser un four à hybridation en raison de leur température uniforme, et parce qu'il est extrêmement important que la condensation ne forme pas de l'intérieur des tubes. Nous recommandons fortement une incubation de 14 h de réaction d'IVT pour maximiser le rendement ARNa. Pour le meilleur rendement Arna, la conduite du FPI dans un volume réactionnel 40 ul finale.
    2. A température ambiante, assembler un Master Mix IVT par addition de réactifs dans l'ordre indiqué sur la feuille de calcul. Bien mélanger en douceur vortex. Centrifuger brièvement (~ 5 s) au colCours du Master Mix IVT au fond du tube et le placer sur la glace.
    3. Transfert IVT Mix Master à chaque échantillon en suivant les directives de la feuille de calcul, bien mélanger au vortex doux, centrifuger brièvement pour recueillir la réaction, et placer les tubes dans un incubateur à 37 ° C.
    4. Incuber pendant 14 heures à 37 ° C.
    5. Après l'incubation, ajouter eau sans nucléase à chaque échantillon ARNa pour porter le volume final de 100 pl. Mélanger au vortex doux. Placez le ARNa dilué sur la glace si l'étape de purification ARNa sera fait immédiatement. Alternativement, le ARNa peuvent être stockés à -20 ° C.
  6. Purification ARNa
  7. Toutes les centrifugations dans cette section doit être fait à 10,000 xg (typiquement ~ 10 000 rpm).
  8. Avant de commencer la purification ARNa préchauffer le flacon de 10 ml de eau sans nucléase à 55 ° C pendant> 10 min.
  9. Ajouter 350 ul d'Arna Binding Buffer à chaque échantillon ARNa. Mélanger au vortex doux, et passez à l'étape suivante immédiatement.
  10. Ajouter 250 ul d'ACS EtOH à 100% de qualité à chaque échantillon Arna, et mélanger par pipetage le mélange de haut en bas trois fois. Ne pas vortexer pour mélanger. Procéder immédiatement à l'étape suivante dès que vous avez mélangé les EtOH dans chaque échantillon.
  11. Placer une cartouche filtrante ARNa dans un tube de prélèvement Arna, et la pipette chaque mélange échantillon au centre du filtre dans la cartouche filtre ARNa.
  12. Centrifuger pendant ~ 1 min à 10000 x g. Continuez jusqu'à ce que le mélange est passé au travers du filtre. Jeter l'effluent à travers et remplacer le filtre à cartouche en ARNa le tube de collecte ARNa.
  13. Appliquer 650 ul de tampon de lavage à chaque cartouche ARNa filtre. Centrifuger pendant ~ 1 min à 10000 xg, ou jusqu'à ce que toute la solution de lavage est à travers le filtre. Jeter l'effluent à travers et tourner la cartouche du filtre ARNa pour une période supplémentaire ~ 1 min pour éliminer les traces d'EtOH.
  14. Transfert cartouche du filtre (s) à un tube ARNa collection fraîche. Pour le centre du filtre, ajouter 75 ul eau sans nucléase qui est préchauffé à 50-60 ° C. Remplacez le récipient d'eau sans nucléase dans l'incubateur 50-60 ° C.
  15. Laisser à température ambiante pendant 2 min, puis centrifuger pendant ~ 1,5 min à 10000 xg, ou jusqu'à ce que la solution passe par le filtre.
  16. Répéter l'élution avec un second 75 ul d'eau sans nucléase. Le ARNa seront désormais dans le tube de prélèvement ARNa dans ~ 150 pi de eau sans nucléase. Jeter le ARNa filtre à cartouche.
  17. Boutique ARNa à -80 ° C et à minimiser répétés de congélation-décongélation.

Partie 7: synthèse de l'ADNc

Cette partie utilise le kit Promega universelle RiboClone ADNc Synthesis System avec une légère modification aux instructions du fabricant. Standard Input 2 ug; pour 454 séquençage, il est recommandé de commencer avec 10 ug. Si la concentration est trop faible, le ARNa peut être concentrée soit avec des précipitations EtOH ou de concentration sous vide. Si 10 ug est utilisé comme entrée, puis l'ARN ampleur tous les réactifs par un facteur d'enzymes 5Le viennent dans différentes unités de chaque lot, donc les volumes doivent être calculés à chaque fois.

  1. Synthèse du premier brin:
    1. Prenez un tube de 0,5 ml PCR et ajouter:
      échantillon d'ARNm 2 ug (ou 10 ug si elles sont utilisées pour 454 séquençage)
      Primer Hex aléatoire (0,5 mg / ml) 2 pl
      Nucléase eau libre au volume 0 (ou non n'est échantillon a été diluées)
      Volume total 15 ul
    2. La chaleur de la réaction à 70 ° C pendant 10 min. Réfrigérer tube sur la glace pendant 5 min et centrifuger brièvement pour recueillir la solution au fond du tube.
    3. Ajouter les éléments suivants dans l'ordre indiqué:
      Exemple 15 ul
      Tampon 5X First Strand 5 pl
      RNasine Ribonucléase Inhibitor 40 u 1 pl ... 40 U / pl
      Volume total 21 ul
    4. Mélanger reaction et brièvement spin. Chauffer le mélange à 37 ° C pendant 5 min.
    5. Ajouter les éléments suivants:
      Exemple de l'étape 1 21,0 ul
      Pyrophosphate de sodium, 40 mM 2,5 pi
      Transcriptase inverse AMV 30 u 1,5 pl ... 22 U / pl
      Eau sans nucléase 0,0 ul
      Volume total 25,0 ul
    6. Incuber pendant 1 h de réaction à 37 ° C dans un four à hybridation.
    7. Après réaction lieu d'incubation sur la glace.
  2. Deuxième volet de synthèse:
    1. Ajouter les éléments suivants:
      Premier volet de réaction 25,0 ul
      Deuxième volet 2.5X Tampon 40,0 ul
      BSA, 1 mg / ml 5,0 ul
      ADN polymérase I 23 u 3,0 ul
      RNase H 0,8 u 0,5 ul ... 1,5 U / ul
      Eau sans nucléase 26,5 ul
      Volume total 100,0 ul
    2. Mélanger délicatement en tapotant le tube. Incuber les réactions à 14 ° C pendant 2 h dans un thermocycleur. Il est important de refroidir le thermocycleur à 14 ° C avant d'ajouter les tubes de réaction. Ne laissez pas la réaction se-dessus de 14 ° C avant ou pendant la réaction.
    3. Pour terminer la réaction, ajouter 2 unités d'ADN polymérase T4 par l'ARNm entrée xg à la réaction. Incuber pendant 10 min à 14 ° C.
    4. Arrêter la réaction en ajoutant 10 pl de 500 mM DEPC traitées EDTA et placer sur la glace.
    5. Nettoyer l'ADNc en utilisant soit une précipitation EtOH ou le Promega Wizard ADN de nettoyage du système conformément aux instructions du fabricant. Conserver les échantillons à -80 ° C. ADNc double brin peut être directement pyrosequenced à ce point.

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Discussion

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L'enquête de l'expression génique par les communautés microbiennes naturelles est devenue courante ces dernières années comme un moyen d'explorer les rôles et les fonctions écologiques des micro-organismes. Utilisé en combinaison avec la détection, la quantification et la caractérisation des micro-organismes marins, des analyses d'expression génique peut être utilisé pour relier la phylogénie de fonctionner dans les communautés microbiennes naturelles. De nombreuses techniques pour cibler l'expression des gènes fonctionnels s'appuient sur des sondes spécifiques ou des ensembles d'amorces conçues pour les gènes de séquence connue. En revanche, la transcriptomique de l'environnement peut être utilisé pour examiner l'expression des gènes, sans les contraintes imposées par les données de séquence existante et avec une préférence pour ces gènes sont activement exprimés. Analyse de la piscine ARNm dans l'environnement peut donc fournir l'un des moyens les plus efficaces de connexions entre la découverte des activités clés et les organismes qui les médiateurs.

L'application initiale de la transcriptomique environnementaux fournis l'une des premières vues de la composition et la dynamique de la piscine ARNm bactérien dans un écosystème naturel 3. L'analyse des gènes exprimés dans les bibliothèques de la transcription à la fois du marais côtier de sel (Sapelo Island, Géorgie) et une pile alcaline, hypersalin lac (lac Mono CA) a révélé des séquences de gènes d'intérêt biogéochimiques, y compris les variantes de l'environnement de plusieurs gènes fonctionnels, tels que les chitinases et de soufre gènes d'oxydation qui sont spécifiques à chacun de ces écosystèmes. Il a également fourni des preuves de roman, des procédés inattendus tels que la dégradation microbienne des polyamines plantes et d'algues dérivés vasculaires comme le carbone possible et sources d'azote.

Comme les techniques moléculaires évoluer pour réduire les limitations associées à travailler avec l'ARN à partir d'échantillons de l'environnement et améliorer les technologies de séquençage, la transcriptomique l'environnement est devenue une technique plus largement utilisé. Il a été utilisé pour examiner les fonctions des microorganismes dans la surface de l'océan 6 et de comparer l'expression des gènes et des jours de nuit fonctionnelle au sein du même environnement 7. Transcriptomique de l'environnement peut aussi être utilisé pour acquérir une meilleure compréhension des réponses microbiennes à des facteurs environnementaux et la biogéochimie. Les gènes découverts ou des fonctions en utilisant cette technique peut servir de cibles pour des études plus quantitatives de l'expression génique comme les microréseaux et PCR quantitative.

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Acknowledgments

Le financement a été fourni par la Gordon and Betty Moore Foundation et subventions de la National Science Foundation accorde MCB-0702125.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PowerSoil Bead Tubes kit MoBio 12866-25-PBT
RNeasy Mini Kit kit Qiagen 74104
TURBO DNA-free kit Ambion AM1907
mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit kit Epicentre Biotechnologies MOP51010/MOP51024
MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit kit Ambion AM1905
MICROBEnrich kit kit Ambion AM1901
MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit kit Ambion AM1790
Universal RiboClone cDNA Synthesis System kit Promega Corp. C4360
Wizard DNA Clean-Up System kit Promega Corp. A7280

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References

  1. Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257, (5072), 967-967 (1992).
  2. Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
  3. Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71, (7), 4121-4121 (2005).
  4. Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87, (5), 1663-1663 (1990).
  5. Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437, (7057), 376-376 (2005).
  6. Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (10), 3805-3805 (2008).
  7. Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11, (6), 1358-1375 (2009).
Analysant l'expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement
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Poretsky, R. S., Gifford, S., Rinta-Kanto, J., Vila-Costa, M., Moran, M. A. Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics. J. Vis. Exp. (24), e1086, doi:10.3791/1086 (2009).More

Poretsky, R. S., Gifford, S., Rinta-Kanto, J., Vila-Costa, M., Moran, M. A. Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics. J. Vis. Exp. (24), e1086, doi:10.3791/1086 (2009).

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