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Biology

समुद्री माइक्रोबियल पर्यावरण Transcriptomics का उपयोग कर समुदाय से जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण

doi: 10.3791/1086 Published: February 18, 2009

Summary

हम पर्यावरण mRNA से सीडीएनए पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. सामान्य में, कुल शाही सेना पहले पर्यावरण से एकत्र किया जाता है, rRNA चुनिंदा, हटा दिया जाता है mRNA चुनिंदा परिलक्षित होता है, और समृद्ध mRNA पूल से संश्लेषित सीडीएनए अनुक्रम है. बरामद दृश्यों एनोटेट मानक जैव सूचना विज्ञान तकनीक का उपयोग करने के लिए व्यक्त जीनों की पहचान कर सकते हैं.

Abstract

Metagenomics के अनुरूप पर्यावरण (metatranscriptomics) transcriptomics retrieves और जीन क्या समुदाय व्यक्त हो सकता है के पूर्व ज्ञान के बिना एक सूक्ष्म संयोजन से पर्यावरण mRNAs दृश्यों. इस प्रकार यह समुदाय जीन अभिव्यक्ति पर सबसे निष्पक्ष परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है

Protocol

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शाही सेना के साथ कार्य करना

क्योंकि RNases सर्वव्यापी हैं और mRNAs तेजी से नीचा, एक ribonuclease मुक्त वातावरण में काम कर पालन किया जाना चाहिए और नमूने या संसाधित किया जाना चाहिए के रूप में जल्द ही संभव निम्नलिखित संग्रह के रूप में संरक्षित करने के लिए मानक सावधानियों.

भाग 1: पर्यावरण शाही सेना संग्रह (0.2-3.0 सुक्ष्ममापी आकार अंश में बायोमास को इकट्ठा करने के लिए डिज़ाइन)

आपूर्ति की जरूरत है:
Masterflex टयूबिंग
क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पम्प
3 सुक्ष्ममापी उच्च मात्रा pleated कैप्सूल फिल्टर
0.22 सुक्ष्ममापी Supor या polycarbonate 142 मिमी फ़िल्टर
142 मिमी फ़िल्टर टॉवर (Geotech पर्यावरण उपकरण)
10-20 एल काबोइ (स्नातक की उपाधि प्राप्त की)
चक्कर पैक्स
तरल नाइट्रोजन
RLT बफर (Qiagen)
बीटा - mercaptoethanol

सेटअप:
साफ़ दस्ताने जब भी फिल्टर से निपटने या फ़िल्टर लाइन के आंतरिक घटकों के किसी भी छू पहना होना चाहिए. संदंश साफ, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों, अधिमानतः इथेनॉल के साथ भर में रखा जाना चाहिए. प्रतिलेख पूल में बड़े बदलाव को रोकने के लिए, फ़िल्टरिंग रखने के लिए और जितना संभव हो कम नमूना हैंडलिंग बार.

नमूना लेने के लिए वांछित गहराई पर पानी में टयूबिंग की एक छोर रखें. विपरीत छोर पर, उच्च मात्रा 3 सुक्ष्ममापी फिल्टर देते हैं. 3 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर टॉवर फिल्टर सुक्ष्ममापी कनेक्ट. एक स्नातक की उपाधि प्राप्त काबोइ में 0.22 सुक्ष्ममापी से बहिर्वाह प्रत्यक्ष.

प्रक्रिया:

  1. भागो प्रणाली के माध्यम से पानी के कई लीटर (फिल्टर कोई 0.22 सुक्ष्ममापी) कुल्ला. जब समाप्त हो, पानी से टयूबिंग हटाने जबकि पंप के लाइन से शेष पानी शुद्ध चल रहा है.
  2. संदंश का प्रयोग, 0.22 फिल्टर टॉवर और बंद पर फ़िल्टर सुक्ष्ममापी जगह है.
  3. पंक्ति के अंत में वापस पानी प्लेस और पंप पर बारी. दोनों फिल्टर हवा से पर्ज. काबोइ पर स्नातक स्तर की पढ़ाई के साथ फ़िल्टर्ड पानी की मात्रा मॉनिटर.
  4. जब वांछित मात्रा फ़िल्टर्ड किया गया है, पानी से लाइन को हटाने और सिस्टम से शेष पानी शुद्ध.
  5. जैसे ही फिल्टर सूखा है, जल्दी शीर्ष फ़िल्टर थाली हटाने और फिल्टर गुना. एक चक्कर पैक या 15 मिलीलीटर संग्रह बीटा mercaptoethanol के साथ RLT बफर के 2 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में फिल्टर प्लेस. तरल नाइट्रोजन में फ्रीज स्नैप.

भाग 2: 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर से कुल शाही सेना निष्कर्षण

इस भाग में संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के QIAGEN RNeasy मिनी किट का उपयोग करता है

  1. मनका पिटाई ट्यूबों एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब RLT बफर के 8 मिलीलीटर (जोडी बीटा mercaptoethanol) जोड़कर तैयार करें. एक MoBio Powersoil निकासी किट से शाही सेना मोतियों की 1-2 मिलीलीटर जोड़ें
  2. जल्दी फ्रीजर से जमे हुए फिल्टर को हटाने और यह चक्कर पैक में रखते हुए, यह एक लकड़ी का हथौड़ा के साथ चकनाचूर. वैकल्पिक रूप से, संग्रह ट्यूब में छोटे टुकड़े (15ml) एक बाँझ धार का उपयोग में फिल्टर में कटौती और इसे तैयार ट्यूब है (50ml) सभी ऐड.
  3. तैयार ट्यूब (50ml) बिखर फ़िल्टर जोड़ें, और parafilm या प्रयोगशाला टेप के साथ ट्यूब ढक्कन सील.
  4. शीर्ष गति से 10 मिनट 50 एमएल ट्यूबों के लिए एक अनुलग्नक के साथ एक vortexer का उपयोग कर के लिए भंवर.
  5. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 5000 rpm पर 50 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र.
  6. Lysate के रूप में संभव के रूप में ज्यादा निकालें और यह एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण.
  7. 5000 x जी पर 5 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र
  8. स्थानांतरण एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला (~ 7 मिलीलीटर).
  9. Lysate 100% EtOH से 1 मात्रा (~ 7 मिलीलीटर) जोड़ें.
  10. एक 30 मिलीलीटर सिरिंज कि ​​50 मिलीलीटर ट्यूब में फिट बैठता है है का उपयोग करना, lysate आकर्षित एक 18-21 गेज सुई के माध्यम से है और यह बाहर ~ 5 बार वापस से गुजारें. जब समाप्त हो, सिरिंज में lysate छोड़ दें.
  11. निष्कर्षण QIAGEN RNeasy मिनी किट के साथ जारी रखें. यह उपयोगी है एक निर्वात कई गुना यहाँ का उपयोग करने के लिए, lysate मात्रा (14ml ~) के बाद से मूल किट प्रोटोकॉल (0.7 मिलीलीटर) की तुलना में ज्यादा है. वैकल्पिक रूप से, lysate 700 μl स्तंभ के लिए जोड़ने, centrifuging, और दोहरा जब तक lysate के सभी स्तंभ के लिए लागू किया गया है द्वारा के माध्यम से तैयार किया जा सकता है.
  12. वैक्यूम कई गुना पर एक स्पिन स्तंभ प्लेस और नमूने के 700 μl लागू. वैक्यूम करने के लिए नीचे lysate आकर्षित करने के लिए कई गुना दबाव लागू करें. सिरिंज से lysate जोड़ने जब तक यह सब स्तंभ के लिए लागू किया गया है जारी रखें.
  13. स्तंभ के लिए 700 μl बफर RW1 जोड़ें और वैक्यूम दबाव के साथ नीचे आकर्षित.
  14. स्तंभ के लिए 500 μl बफर RPE जोड़ें और वैक्यूम दबाव के साथ नीचे आकर्षित.
  15. स्तंभ के लिए 500 μl बफर RPE के एक दूसरे विभाज्य जोड़ें और वैक्यूम दबाव के साथ नीचे आकर्षित.
  16. एक बार पूरी तरह से धोने के माध्यम से तैयार किया गया है, स्तंभ और एक संग्रह ट्यूब में जगह हटा दें.
  17. 8000 x जी पर 1 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
  18. 8000 में एक अतिरिक्त 2 मिनट EtOH से छुटकारा पाने के XG अपकेंद्रित्र.
  19. एक नया 2 मिलीलीटर कर्नल स्तंभ स्थानांतरणरूपांतर ट्यूब. पिपेट झिल्ली पर सीधे 35 RNase मुफ्त पानी के μl. ट्यूब बंद करो और 1 मिनट के लिए खड़े हो जाओ.
  20. 8000 x जी पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
  21. कुल शाही सेना spectrophotometrically यों.

भाग 3. DNase उपचार

यह हिस्सा निर्माता के निर्देशों के अनुसार Ambion टर्बो डीएनए मुक्त किट का उपयोग करता है

  1. शाही सेना नमूना 3.4 μl 10x DNase मैं बफर और 1μl मैं rDNase जोड़ें.
  2. 30min के लिए 37 º सी में सेते हैं.
  3. भंवर नमूना DNase निष्क्रियता अभिकर्मक और निष्क्रियता अभिकर्मक के 3.4 μl जोड़ने.
  4. कभी कभी मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 2 मिनट सेते हैं.
  5. कमरे के तापमान में 1.5 मिनट के लिए 10,000 XG पर स्पिन, तो एक नया ट्यूब पर स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. ताजा ट्यूब में निष्क्रियता अभिकर्मक शुरू करने से बचें.

भाग 4. प्रथम rRNA हटाने

यह हिस्सा निर्माता के निर्देशों के अनुसार mRNA केवल किट Epicentre का उपयोग करता है

  1. धीरे मिश्रण और संक्षेप में बफर mRNA केवल 10X रिएक्शन पहले अपकेंद्रित्र उपयोग करने के लिए.
  2. एक बाँझ (RNase मुक्त) 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में, बर्फ पर निम्न प्रतिक्रिया घटक गठबंधन:
    mRNA केवल 10X रिएक्शन बफर 2.0 μl
    RNase अवरोध करनेवाला 0.5 μl
    कुल शाही सेना नमूना (200 μg एनजी 10) 16.5 μl
    टर्मिनेटर exonuclease (1 यूनिट) 1.0 μl
    कुल मात्रा 20.0 μl
  3. 30 पर प्रतिक्रिया सेते ° सी thermocycler में 60 मिनट (गर्म ढक्कन के साथ) या पानी के स्नान के लिए.
  4. Phenol / EtOH तेज़ी के साथ प्रतिक्रिया बर्खास्त:
    1. RNase मुक्त 200 μl की कुल मात्रा (= 180 μl) H2O जोड़ें.
    2. निकालें: Phenol: क्लोरोफॉर्म (01:01), 1 मात्रा (= 200 μl). भंवर सख्ती और फिर शीर्ष गति से 2-5 मिनट स्पिन.
    3. जलीय चरण (~ 200 μl) निकालें.
    4. 3 एम सोडियम एसीटेट (20 μl) + 100% बर्फ ठंड EtOH 2.5 मात्रा (500 μl) के 0.1 मात्रा में जोड़ें
    5. -80 º सी में 15-30 मिनट के लिए सेते हैं.
    6. 4 º सी, शीर्ष गति, 30 मिनट पर गोली, नमूना के बाद आकांक्षा (गोली को देखने के करने के लिए मुश्किल हो सकता है) के लिए ट्यूब की स्थिति पर ध्यान दें.
    7. Aspirator या विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    8. 500 μl 70% बर्फ के ठंडे EtOH के साथ धोएं. Vortexing द्वारा Resuspend.
    9. शीर्ष गति से 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    10. फिर ट्यूब शीर्ष गति से 10 मिनट में अपकेंद्रित्र शेष तरल.
    11. तरल सावधानी Aspirate और गोली इसे छोड़ने ~ हुड के अंतर्गत 10 मिनट के लिए खुला के द्वारा पूरी तरह से सूखे.
    12. 15-20 μl RNase मुक्त H2O में Resuspend (MICROBExpress की अधिकतम इनपुट मात्रा 15 μl है), इसे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ.
    13. Bioanalyzer या Experion प्रयोग rRNA और इस कदम पर mRNA के प्रदूषण की गुणवत्ता की जांच करने के लिए के लिए.
    14. यह एक संभावित रोक बिंदु है. आरएनए -80 º सी भंडारण पर संग्रहीत किया जा सकता है.

भाग 5. दूसरी rRNA हटाने

यह हिस्सा निर्माता के निर्देशों के अनुसार Ambion MICROBEnrich और MICROBExpress किट का उपयोग करता है. दोनों किट कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है यूकेरियोटिक की दक्षता (MICROBEnrich) और prokaryotic (MICROBExpress) rRNA हटाने में वृद्धि. कुल शाही सेना के इनपुट 2-10 μg के बीच होना चाहिए . शाही सेना की मात्रा कम से कम 15 μl होना चाहिए. इस प्रकार, आदर्श इनपुट> 150 एनजी / μl है . -

MICROBEnrich

  1. एक 1.5ml ट्यूब में पिपेट 300 μl बंधन बफर
  2. 30μl और धीरे भंवर की एक अधिकतम मात्रा में 5-100 μg कुल शाही सेना जोड़ें
  3. बंधन बफर में 5 μg शाही सेना के लिए कैद oligo मिक्स की 2 μl जोड़ें. ट्यूब धीरे ठोकर और संक्षेप में नीचे मिश्रण स्पिन.
  4. Denature मिश्रण में 70 ° 10 मिनट के लिए सी
  5. 37 में ° 1 घंटे के लिए सी मिश्रण पानी रखना. इस ऊष्मायन के दौरान मोती तैयार करें.
  6. Nuclease मुक्त पानी में एक बार धोने और बाध्यकारी बफर में एक बार, washes के बीच एक चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों पर कब्जा करके oligo MagBeads (आमतौर पर 25 μl) तैयार करें. बर्फ पर मोती स्टोर. उन्हें प्रयोग करने से पहले कमरे के तापमान 5 मिनट के लिए गर्म.
  7. 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में धो समाधान हीट.
  8. आरएनए जोड़ें / oligo धोया oligo MagBeads के लिए मिक्स कब्जा. बहुत धीरे मिश्रण ट्यूब और संक्षिप्त स्पिन.
  9. 37 में मिश्रण डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  10. चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब प्लेस और ~ 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
  11. Aspirate (mRNA शामिल हैं) सतह पर तैरनेवाला और बर्फ पर एक संग्रह ट्यूब के लिए यह हस्तांतरण.
  12. पर कब्जा कर लिया मोती के पूर्व गर्म धो समाधान के 100 μl जोड़ें. धीरे संक्षिप्त भंवर मोती. मोतियों पर कब्जा है और सतह पर तैरनेवाला पुनर्प्राप्त. इस सतह पर तैरनेवाला संग्रह ट्यूब में बर्फ (~ 450 μl अंत मात्रा) पर mRNA के साथ पूल.
  13. संग्रह ट्यूब बर्फ पर रखें. यदि एक दूसरे दौर प्रदर्शन किया जा रहा है, 5.3 करने के लिए वापस जाने के लिए) अनुभाग और प्रक्रिया को दोहराने. वैकल्पिक रूप से, MICROBExpress किट (5.18, नीचे देखें) के लिए तुरंत स्विच.
  14. खेतों में प्रयुक्त किए गए OlioBeads दूसरी बार इस्तेमाल किया जा सकता है. उन्हें पुनर्जनन एक समाधान के 2 (आमतौर पर 50 μl) 1 घंटा के लिए संस्करणों के साथ incubating Oligobeads पुनर्जन्म. एक चुंबकीय स्टैंड में मोती कैप्चर. उन्हें दो बार पुनर्जनन 2 समाधान (आमतौर पर 50 μl) के 2 संस्करणों के साथ और उन्हें उनके Resuspension समाधान के मूल मात्रा (आमतौर पर 25 μl) में resuspend धो.
    MICROBExpress
  15. एक 1.5ml ट्यूब में पिपेट 200 μl बंधन बफर.
  16. 2-10 μg कुल शाही सेना 15μl और धीरे भंवर की एक अधिकतम मात्रा में जोड़ें.
  17. बंधन बफर में शाही सेना को कैद oligo मिक्स के 4 μl जोड़ें. ट्यूब धीरे ठोकर और संक्षेप में नीचे मिश्रण स्पिन.
  18. 70 में denature मिश्रण ° सी 10 मिनट के लिए.
  19. 37 में मिश्रण पानी रखना डिग्री सेल्सियस के लिए 15 मिनट ऊष्मायन के दौरान मोती तैयार है.
  20. Oligo MagBeads nuclease मुक्त पानी में एक बार धोने से तैयार 50 μl बंधन बफर में दो washes के द्वारा पीछा किया, washes के बीच एक चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों पर कब्जा. 50 μl बंधन और 37 पर बफर सेते में Resuspend मोती डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक.
  21. 37 तक धो समाधान हीट डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में
  22. भंवर oligo MagBeads धीरे धोया. शाही सेना के लिए / oligo मिक्स पर कब्जा 50 μl oligo MagBeads जोड़ें. बहुत धीरे मिश्रण ट्यूब और संक्षिप्त स्पिन.
  23. 37 पर डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं.
  24. चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब प्लेस और ~ 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
  25. Aspirate (mRNA शामिल हैं) सतह पर तैरनेवाला और बर्फ पर एक संग्रह ट्यूब के लिए यह हस्तांतरण.
  26. पर कब्जा कर लिया मोती के पूर्व गर्म धो समाधान के 100 μl जोड़ें. धीरे संक्षिप्त भंवर मोती.
  27. मोतियों पर कब्जा है और सतह पर तैरनेवाला पुनर्प्राप्त. इस सतह पर तैरनेवाला संग्रह ट्यूब में बर्फ (~ 350 μl अंत मात्रा) पर mRNA के साथ पूल.
  28. यदि एक दूसरे दौर प्रदर्शन किया जा रहा है, 5.18 अनुभाग) के लिए वापस जाने के लिए और प्रक्रिया को दोहराने. वैकल्पिक रूप से, तुरंत आगे बढ़ने के लिए तेज़ी mRNA.
  29. वेग और resuspend mRNA:
    1. जमा mRNA 35 μl सोडियम एसीटेट जोड़ने और 7 μl Glycogen जोड़ें.
    2. 1175 μl बर्फ ठंड 100% EtOH और अच्छी तरह भंवर जोड़ें.
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 के लिए वेग.
    4. 10.000 x जी पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
    5. ध्यान छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    6. 750 μl बर्फ ठंड 70% EtOH और भंवर संक्षिप्त जोड़ें.
    7. 10.000 XG में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    8. एक दूसरे 70% EtOH धो मत करो.
    9. संक्षेप में discarding के बाद दूसरा 70% EtOH धोने ट्यूब respin.
    10. ध्यान से एक विंदुक के साथ किसी भी सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
    11. एयर 5 मिनट के लिए गोली सूखी.
    12. 25 μl ते बफर या RNase मुफ्त पानी में शाही सेना गोली Resuspend
    13. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए शाही सेना rehydrate.
    14. यदि आवश्यक सख्ती नमूना भंवर.
  30. यदि यह आवश्यक है 3min ~ के लिए चुंबकीय स्टैंड पर शेष मोती, जगह ट्यूब को हटाने और नए RNase मुक्त ट्यूब को समृद्ध mRNA चाल.
  31. Bioanalyzer या Experion प्रयोग rRNA और इस कदम पर mRNA के प्रदूषण की गुणवत्ता की जांच करने के लिए के लिए.
  32. यह एक संभावित रोक बिंदु है. आरएनए -80 º सी भंडारण पर संग्रहीत किया जा सकता है.

भाग 6: mRNA प्रवर्धन

यह हिस्सा निर्माता के निर्देशों के अनुसार Ambion MessageAmp-II जीवाणु किट का उपयोग करता है. परिकलित मास्टर पर ऑनलाइन घोला जा सकता है www.ambion.com/tools/ma2bact .

  1. टेम्पलेट शाही सेना के Polyadenylation:
    1. कुल शाही सेना के 1000 एनजी (आमतौर पर 100-500 एनजी) या एक बाँझ microfuge RNase मुक्त ट्यूब में 500 एनजी mRNA (आमतौर पर 10 एनजी 200 एनजी) के लिए ऊपर रखें. पहले बफर में नमूने के 6.5 μl और कोई RNase मुफ्त पानी का प्रयोग करें.
    2. 70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट सेते हैं, अधिमानतः एक thermocycler में.
    3. 70 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और अपकेंद्रित्र संक्षिप्त (~ 5 एस) से शाही सेना के नमूने निकालें ट्यूब के नीचे नमूना इकट्ठा. 3 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण रखें.
    4. गणना पत्रक पर दिखाया क्रम में एक nuclease मुक्त कमरे Temp पर ट्यूब में Polyadenylation मास्टर मिक्स तैयार. सभी नमूनों के लिए प्रयोग में पर्याप्त मास्टर मिश्रण ≤ 5% pipetting त्रुटि को कवर व्यय सहित इकट्ठे. धीरे एंजाइम को निष्क्रिय बिना एक समरूप मिश्रण बनाने भंवर, तो ~ 5 एस के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे मास्टर मिश्रण इकट्ठा.
    5. Polyadenylation मास्टर मिक्स के प्रत्येक शाही सेना के नमूने के लिए 3.5 μl स्थानांतरण, कोमल vortexing द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से और एक त्वरित स्पिन के साथ पालन करने के लिए प्रतिक्रिया इकट्ठा.
    6. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में नमूने रखें. 15 मिनट के लिए सेते प्रतिक्रियाओं37 डिग्री सेल्सियस, तो संक्षेप में अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे प्रतिक्रिया इकट्ठा.
    7. 37 ° सी ऊष्मायन के बाद, बर्फ पर प्रतिक्रियाओं जगह और रिवर्स प्रतिलेखन करने के लिए तुरंत आगे बढ़ना.
  2. ट्रांसक्रिप्शन रिवर्स करने के लिए पहले Strand सीडीएनए Synthesize:
    1. गणना पत्रक पर दिखाया क्रम में एक nuclease मुक्त कमरे Temp पर ट्यूब में रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिक्स तैयार करें. सभी नमूनों के लिए प्रयोग में पर्याप्त मास्टर मिश्रण ≤ 5% pipetting त्रुटि को कवर व्यय सहित इकट्ठे. धीरे एंजाइम को निष्क्रिय बिना एक समरूप मिश्रण बनाने भंवर, तो ~ 5 एस के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे मास्टर मिश्रण इकट्ठा.
    2. प्रत्येक नमूने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिक्स 10 μl स्थानांतरण, कोमल vortexing मिश्रण अच्छी तरह से, और एक त्वरित स्पिन के साथ पालन करने के लिए प्रतिक्रिया इकट्ठा.
    3. एक 42 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में नमूने रखें. 42 पर 2 घंटा के लिए सेते ° सी, तो संक्षेप में अपकेंद्रित्र (~ 5 एस) ट्यूब के नीचे प्रतिक्रिया इकट्ठा.
    4. बर्फ पर ट्यूबों प्लेस और तुरंत दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण के लिए आगे बढ़ना.
  3. दूसरा Strand सीडीएनए संश्लेषण:
    1. बर्फ पर गणना शीट में दिखाया क्रम में निम्नलिखित अभिकर्मकों मिश्रण द्वारा एक दूसरा Strand मास्टर मिक्स तैयार. सभी नमूनों के लिए प्रयोग में पर्याप्त मास्टर मिश्रण ≤ 5% pipetting त्रुटि को कवर व्यय सहित इकट्ठे. धीरे निष्क्रिय एंजाइमों के बिना एक समरूप मिश्रण बनाने भंवर, तो ~ 5 एस के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे मास्टर मिश्रण इकट्ठा.
    2. प्रत्येक नमूने के लिए दूसरा Strand मास्टर मिक्स के 80 μl स्थानांतरण, कोमल vortexing मिश्रण अच्छी तरह से, और एक त्वरित स्पिन के साथ पालन करने के लिए प्रतिक्रिया इकट्ठा.
    3. एक 16 डिग्री सेल्सियस थर्मल cycler में नमूने रखें. यह 16 से डिग्री प्रतिक्रिया ट्यूबों जोड़ने क्योंकि तापमान के लिए प्रतिक्रियाओं 16> डिग्री सेल्सियस ARNA उपज समझौता होगा subjecting से पहले सी थर्मल cycler ब्लॉक शांत करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    4. 16 पर 2 घंटा सेते ° 16 ° सी थर्मल cycler में सी सेते 2 घंटा. यदि ढक्कन तापमान 16 डिग्री सेल्सियस ब्लॉक तापमान मैच समायोजित नहीं कर सकते हैं, गर्म ढक्कन बंद कर दिया साथ प्रतिक्रियाओं कवर, या अगर ढक्कन नहीं दिया जा सकता है बंद ट्यूबों के साथ यह कवर नहीं है.
    5. बर्फ पर प्रतिक्रियाओं संक्षिप्त रखें. समय की लंबी अवधि के लिए बर्फ पर प्रतिक्रियाओं मत छोड़ो.
  4. 5.4) सीडीएनए शोधन:
    1. यह शोधन प्रक्रिया में सभी centrifugations के कमरे Temp पर 10,000 XG (आमतौर पर ~ +१०,००० rpm) में किया जाना चाहिए. वर्षा के लिए इसे का उपयोग करने से पहले सीडीएनए बंधन बफर की जाँच करें. यदि एक वेग दिखाई देता है, यह 37 ° 10 मिनट तक के लिए सी समाधान वार्मिंग और सख्ती vortexing redissolve. उपयोग करने से पहले कमरे Temp के लिए कूल.
    2. सीडीएनए शुद्धि की शुरुआत से पहले, पहले से गरम करना Nuclease मुक्त जल का 10 मिलीलीटर की बोतल 50 ° कम से कम 10 मिनट के लिए सी.
    3. प्रत्येक नमूने के सीडीएनए बंधन बफर के 250 μl जोड़ें और धीरे vortexing मिश्रण अच्छी तरह से.
    4. ~ 1 मिनट के लिए 10,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र, या जब तक मिश्रण फिल्टर के माध्यम से है. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और धोने ट्यूब में सीडीएनए फ़िल्टर कारतूस की जगह.
    5. प्रत्येक सीडीएनए फ़िल्टर कारतूस 500 μl धो बफर लागू करें. ~ 1 मिनट के लिए 10,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र, या जब तक सभी धो बफर फिल्टर के माध्यम से होता है. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और EtOH की मात्रा का पता लगाने को हटाने के लिए एक अतिरिक्त मिनट के लिए सीडीएनए फ़िल्टर कारतूस स्पिन.
    6. एक सीडीएनए Elution ट्यूब सीडीएनए फ़िल्टर कारतूस स्थानांतरण. 50 डिग्री सेल्सियस Nuclease मुक्त जल के 20 μl के साथ सीडीएनए Elute. यह महत्वपूर्ण है सीडीएनए elution के लिए Nuclease मुक्त जल कि 50 में डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें. ठंडा पानी कम सीडीएनए eluting में कुशल, और hotter पानी (> 55 डिग्री सेल्सियस) कम ARNA उपज में परिणाम कर सकते हैं. जाएगा
    7. सीडीएनए फ़िल्टर कारतूस में फिल्टर के केंद्र के लिए preheated (50 डिग्री सेल्सियस) Nuclease मुक्त जल के 20 μl लागू होते हैं. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दो और फिर 10,000 XG पर ~ 1.5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, या जब तक सभी Nuclease मुक्त पानी फिल्टर के माध्यम से है. डबल असहाय सीडीएनए अब elute (~ 16 μl) में किया जाएगा.
    8. -80 डिग्री में इस बिंदु पर सी शुद्ध सीडीएनए रातोंरात संग्रहीत कर सकते हैं अगर वांछित.
  5. इन विट्रो प्रतिलेखन में ARNA synthesize करने के लिए
    1. यह उनके समान तापमान की वजह से एक संकरण ओवन का प्रयोग करने की सिफारिश की है, और क्योंकि यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि संक्षेपण ट्यूबों के अंदर फार्म नहीं करता है. हम दृढ़ता से एक 14 घंटा IVT प्रतिक्रिया ARNA उपज को अधिकतम ऊष्मायन सलाह देते हैं. उच्चतम ARNA उपज के लिए, एक 40 μl अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में IVT आचरण.
    2. कमरे Temp पर गणना पत्रक पर सूचीबद्ध क्रम में अभिकर्मकों जोड़कर एक IVT मास्टर मिक्स इकट्ठा. धीरे vortexing से अच्छी तरह मिक्स. अपकेंद्रित्र कर्नल संक्षिप्त (~ 5 एस)ट्यूब और बर्फ पर जगह के नीचे IVT मास्टर मिक्स lect.
    3. स्थानांतरण IVT मास्टर प्रत्येक नमूना गणना पत्रक के दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए मिक्स, कोमल vortexing द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से, संक्षेप में अपकेंद्रित्र की प्रतिक्रिया एकत्र करने के लिए, और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ट्यूबों की जगह.
    4. 37 पर 14 घंटा के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
    5. ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक ARNA नमूना Nuclease मुक्त जल जोड़ने के लिए 100 μl अंतिम मात्रा लाने के लिए. कोमल vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स. बर्फ पर पतला ARNA प्लेस अगर ARNA शुद्धि कदम तुरंत किया जाएगा है. वैकल्पिक रूप से, ARNA -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता
  6. ARNA शोधन
  7. इस खंड में सभी centrifugations 10.000 XG (आमतौर पर ~ १०००० rpm) में किया जाना चाहिए.
  8. 55 से ARNA शुद्धि Nuclease मुक्त जल का 10 मिलीलीटर की बोतल पहले से गरम करना शुरू करने से पहले डिग्री सेल्सियस> 10 मिनट के लिए.
  9. प्रत्येक ARNA नमूने के ARNA बंधन बफर के 350 μl जोड़ें. कोमल vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स, और अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना.
  10. मिश्रण pipetting ऊपर और नीचे 3 बार ACS ग्रेड 100% प्रत्येक ARNA नमूने के EtOH के 250 μl, और मिश्रण जोड़ें. मिश्रण भंवर मत करो. अगले कदम के लिए तुरंत के रूप में जल्द ही के रूप में आप प्रत्येक नमूने में EtOH मिश्रित आगे बढ़ें.
  11. एक ARNA संग्रह ट्यूब में एक ARNA फ़िल्टर कारतूस प्लेस, और ARNA फ़िल्टर कारतूस में फिल्टर के केंद्र पर प्रत्येक नमूना मिश्रण विंदुक.
  12. 10,000 एक्स जी पर ~ 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जारी रखें जब तक मिश्रण फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया गया है. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और ARNA संग्रह ट्यूब में ARNA फ़िल्टर कारतूस की जगह.
  13. 650 μl धो प्रत्येक ARNA फ़िल्टर कारतूस करने के लिए बफर लागू करें. 10,000 XG पर ~ 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, या जब तक सभी धोने के समाधान फिल्टर के माध्यम से होता है. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और ~ 1 मिनट अतिरिक्त EtOH की मात्रा का पता लगाने को हटाने के लिए ARNA फ़िल्टर कारतूस स्पिन.
  14. स्थानांतरण फ़िल्टर कारतूस (ओं) को एक ताजा ARNA संग्रह ट्यूब. फिल्टर के केंद्र के लिए, 75 μl Nuclease मुक्त जल कि 50-60 के लिए preheated है डिग्री सेल्सियस जोड़ें 50-60 ° सी इनक्यूबेटर में Nuclease मुक्त जल के कंटेनर बदलें.
  15. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दो और फिर 10,000 XG पर ~ 1.5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, या जब तक समाधान फिल्टर के माध्यम से है.
  16. Nuclease मुक्त जल के एक दूसरे 75 μl के साथ elution दोहराएँ. ARNA अब ~ Nuclease मुक्त जल के 150 μl में ARNA संग्रह ट्यूब में हो जाएगा. ARNA फ़िल्टर कारतूस त्यागें.
  17. -80 पर स्टोर ARNA डिग्री सेल्सियस और कम से कम दोहराया फ्रीज विगलन.

भाग 7: सीडीएनए संश्लेषण

निर्माता के निर्देशों के मामूली संशोधन के साथ यह हिस्सा Promega यूनिवर्सल RiboClone सीडीएनए संश्लेषण सिस्टम किट का उपयोग करता है . मानक इनपुट μg 2, 454 अनुक्रमण के लिए, यह 10 μg के साथ शुरू की सिफारिश की है . यदि एकाग्रता बहुत कम है, ARNA या तो EtOH वर्षा या वैक्यूम एकाग्रता के साथ ध्यान केंद्रित किया जा सकता है है. यदि 10 μg शाही सेना इनपुट के रूप में प्रयोग किया जाता है तो प्रत्येक बैच अलग इकाइयों में आते हैं 5The एंजाइमों का एक पहलू द्वारा सभी अभिकर्मकों पैमाने पर, इस प्रकार मात्रा हर बार की गणना है.

  1. पहले Strand संश्लेषण:
    1. एक 0.5 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब ले लो और जोड़:
      mRNA नमूना 2 μg (या 10 μg अगर 454 अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया)
      रैंडम हेक्स प्राइमर (0.5 मिलीग्राम / एमएल) 2 μl
      Nuclease मुफ्त पानी की मात्रा करने के लिए 0 (या गैर नमूना पतला था)
      कुल मात्रा 15 μl
    2. 70 से प्रतिक्रिया हीट डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए. 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब चिल और संक्षेप में स्पिन करने के लिए ट्यूब के नीचे समाधान इकट्ठा.
    3. दिखाया क्रम में निम्नलिखित घटकों को जोड़ें:
      नमूना 15 μl
      पहले Strand 5X बफर 5 μl
      RNasin Ribonuclease 40 यू अवरोध करनेवाला 1 μl ... 40 यू / μl
      कुल मात्रा 21 μl
    4. मिक्स reaction और स्पिन संक्षिप्त. हीट मिश्रण में 37 ° सी 5 मिनट के लिए.
    5. निम्नलिखित घटकों को जोड़ें:
      चरण 1 से नमूना 21.0 μl
      सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 40 मिमी 2.5 μl
      AMV रिवर्स 30 यू Trancriptase 1.5 μl ... 22 यू / μl
      Nuclease मुफ्त पानी 0.0 μl
      कुल मात्रा 25.0 μl
    6. 37 डिग्री सेल्सियस संकरण ओवन में 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं.
    7. बर्फ पर ऊष्मायन जगह प्रतिक्रिया के बाद.
  2. दूसरा Strand संश्लेषण:
    1. निम्नलिखित घटकों को जोड़ें:
      पहले - Strand प्रतिक्रिया 25.0 μl
      दूसरा Strand 2.5X बफर 40.0 μl
      BSA, 1 मिलीग्राम / एमएल 5.0 μl
      पोलीमरेज़ डीएनए मैं 23 यू 3.0 μl
      RNase 0.8 यू एच 0.5 μl ... 1.5 यू / μl
      Nuclease मुफ्त पानी 26.5 μl
      कुल मात्रा 100.0 μl
    2. ट्यूब flicking द्वारा धीरे मिलाएं. 14 में प्रतिक्रियाओं सेते ° सी thermocycler में 2 घंटे के लिए. यह महत्वपूर्ण है ° प्रतिक्रिया ट्यूबों जोड़ने से पहले सी 14 के लिए thermocycler शांत. प्रतिक्रिया ° पहले सी या प्रतिक्रिया के दौरान 14 से ऊपर प्राप्त मत करो.
    3. प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए, प्रति μg इनपुट प्रतिक्रिया के लिए mRNA टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ की 2 इकाइयों में जोड़ें. 14 में 10 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
    4. 500 मिमी EDTA इलाज और DEPC जगह पर बर्फ की 10 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो.
    5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार या तो एक EtOH वर्षा या Promega विज़ार्ड प्रणाली डीएनए क्लीनअप का उपयोग सीडीएनए साफ करें. -80 पर स्टोर नमूनों डिग्री सेल्सियस सीडीएनए डबल असहाय इस बिंदु पर सीधे pyrosequenced किया जा सकता है.

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Discussion

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प्राकृतिक माइक्रोबियल समुदायों द्वारा जीन अभिव्यक्ति की जांच सूक्ष्मजीवों के पारिस्थितिक भूमिकाओं और कार्यों का पता लगाने के लिए एक साधन के रूप में हाल के वर्षों में आम बन गया है. पता लगाने, मात्रा का ठहराव और समुद्री सूक्ष्मजीवों के लक्षण वर्णन के साथ संयोजन में उपयोग किया, जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण फाइलोजेनी लिंक करने के लिए प्राकृतिक माइक्रोबियल समुदायों में समारोह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति लक्ष्यीकरण के लिए कई तकनीकों विशिष्ट जांच या प्राइमर ज्ञात अनुक्रम के जीनों के लिए तैयार सेट पर भरोसा करते हैं. इसके विपरीत, पर्यावरण transcriptomics मौजूदा अनुक्रम डेटा और उन जीनों के लिए सक्रिय व्यक्त किया जा रहा वरीयता के साथ लगाया बाधाओं के बिना जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वातावरण में mRNA पूल का विश्लेषण इसलिए महत्वपूर्ण गतिविधियों और जीवों कि उन्हें मध्यस्थता के बीच की खोज कनेक्शन के सबसे प्रभावी तरीके से प्रदान कर सकते हैं.

पर्यावरण transcriptomics के प्रारंभिक आवेदन एक प्राकृतिक पारिस्थितिकी तंत्र 3 में बैक्टीरिया mRNA पूल की संरचना और गतिशीलता के पहले दृश्य में से एक प्रदान की है. प्रतिलेख पुस्तकालयों में दोनों एक तटीय नमक (Sapelo द्वीप, GA) मार्श और एक alkaline, hypersaline झील (मोनो झील सीए) से व्यक्त जीनों के विश्लेषण के जीन दृश्यों biogeochemical ब्याज chitinases और सल्फर के रूप में कई कार्यात्मक जीन पर्यावरण वेरिएंट सहित, का पता चला ऑक्सीकरण जीन है कि इन पारितंत्रों में से प्रत्येक के लिए विशिष्ट थे. यह भी एक संभव कार्बन और नाइट्रोजन स्रोतों के रूप में संवहनी संयंत्र और algal व्युत्पन्न polyamines के माइक्रोबियल गिरावट के जैसे उपन्यास, अप्रत्याशित प्रक्रियाओं के लिए साक्ष्य प्रदान की है.

आणविक तकनीक के रूप में विकसित करने के लिए पर्यावरणीय नमूनों से शाही सेना के साथ काम कर रहे हैं और अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में सुधार के साथ जुड़े सीमाओं को कम, पर्यावरण transcriptomics एक अधिक व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता तकनीक बन गया है. यह सतह 6 सागर में सूक्ष्मजीवों के कार्यों की जांच करने के लिए और एक ही पर्यावरण के भीतर 7 दिन और रात कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. पर्यावरण transcriptomics भी विशिष्ट पर्यावरणीय कारकों और biogeochemistry माइक्रोबियल प्रतिक्रियाओं का एक बेहतर समझ पाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जीन या इस तकनीक का उपयोग कर कार्यों की खोज जीन प्रोटीन और मात्रात्मक पीसीआर के रूप में अभिव्यक्ति की अधिक मात्रात्मक अध्ययन के लिए लक्ष्य के रूप में में सेवा कर सकते हैं.

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Acknowledgments

अनुदान गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन अनुदान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान MCB 0702125 द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PowerSoil Bead Tubes kit MoBio 12866-25-PBT
RNeasy Mini Kit kit Qiagen 74104
TURBO DNA-free kit Ambion AM1907
mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit kit Epicentre Biotechnologies MOP51010/MOP51024
MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit kit Ambion AM1905
MICROBEnrich kit kit Ambion AM1901
MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit kit Ambion AM1790
Universal RiboClone cDNA Synthesis System kit Promega Corp. C4360
Wizard DNA Clean-Up System kit Promega Corp. A7280

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References

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  2. Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
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समुद्री माइक्रोबियल पर्यावरण Transcriptomics का उपयोग कर समुदाय से जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण
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Poretsky, R. S., Gifford, S., Rinta-Kanto, J., Vila-Costa, M., Moran, M. A. Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics. J. Vis. Exp. (24), e1086, doi:10.3791/1086 (2009).More

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