Summary
Nós apresentamos um método para gerar cDNA de mRNA ambiental. Em geral, o total de RNA é a primeira coletados do ambiente, rRNA é seletivamente removido, mRNA é seletivamente amplificado, e cDNA sintetizado a partir do pool de mRNA enriquecido é seqüenciado. Seqüências recuperadas podem ser anotados usando técnicas padrão de bioinformática para identificar os genes expressos.
Abstract
Análogo a metagenômica, transcriptômica ambiental (metatranscriptómica) recupera e seqüências de mRNAs ambientais a partir de um assemblage microbiana sem o conhecimento prévio do que genes a comunidade pode estar expressando. Assim, ele fornece a perspectiva mais imparcial sobre a expressão gênica comunidade
Protocol
Trabalhando com RNA
RNases porque são ubíquos e mRNAs degradam rapidamente, precauções padrão para trabalhar em um ambiente livre de ribonuclease devem ser seguidos e as amostras devem ser processados ou conservados, assim como a recolha seguintes possível.
Parte 1: Environmental RNA Collection (concebido para recolher a biomassa na fração de tamanho 0,2-3,0 mm)
Suprimentos necessários:
Tubulação Masterflex
Bomba peristáltica
3 mm de alto volume de filtro plissado cápsula
0,22 mM Supor ou policarbonato 142 milímetros filtro
142 milímetros filtro de torre (Geotech Environmental Equipment)
10-20 L garrafão (graduado)
Pacotes de giro
Nitrogênio líquido
RLT buffer (Qiagen)
Beta-mercaptoetanol
Configuração:
Luvas limpas devem ser usados sempre que manusear os filtros ou tocar qualquer um dos componentes interior do filtro de linha. Fórceps devem ser mantidos em limpa, 50 ml tubos cônicos, de preferência cheio de etanol. Para evitar grandes mudanças no conjunto de transcrição, manter filtragem e manipulação de amostra vezes o mais curto possível.
Coloque uma extremidade do tubo na água na profundidade desejada para a amostragem. No extremo oposto, anexar o alto volume de 3 mm de filtro. Ligue o filtro de 3 mm para a torre de 0,22 mM filtro. Direcionar o fluxo de saída do 0,22 mM em um garrafão de graduado.
Procedimento:
- Executar vários litros de água através do sistema (sem 0,22 mM de filtro) para enxaguar. Quando terminar, remova o tubo da água, enquanto a bomba está funcionando para purgar a água restante da linha.
- Utilizando uma pinça, coloque um filtro de 0,22 mM na torre do filtro e fechar.
- Coloque o fim da linha para trás na água e ligar a bomba. Purgar o ar de ambos os filtros. Controlar o volume de água filtrada com a graduação no garrafão.
- Quando o volume desejado foi filtrada, remova a linha da água e limpar a água restante do sistema.
- Assim que o filtro é seco, rapidamente remover a placa superior do filtro e dobre o filtro. Coloque o filtro em um pacote de giro ou 15 tubo de coleta ml contendo 2 ml de tampão RLT com beta-mercaptoetanol. Snap congelar em nitrogênio líquido.
Parte 2: extração de RNA total de 0,22 mM de filtro
Esta parte utiliza o mini-kit QIAGEN RNeasy com modificações para as instruções do fabricante
- Prepare talão tubos batendo adicionando 8 ml de tampão RLT (beta-mercaptoetanol adicionado) para um tubo de 50 ml. Adicionar 1-2 ml de contas RNA a partir de um kit de extração MoBio Powersoil
- Remover rapidamente o filtro congelados do congelador e, mantendo-o no pacote de giro, quebrá-lo com um martelo. Alternativamente, corte os filtros em pedaços pequenos no tubo de coleta (15ml), utilizando uma lâmina de barbear estéril e adicionar tudo ao tubo preparado (50ml).
- Adicionar o filtro quebrou-se no tubo preparado (50ml), e selar a tampa do tubo com parafilme ou fita de laboratório.
- Vortex por 10 minutos em alta velocidade usando um vortexer com um anexo para tubos de 50 ml.
- Centrifugar o tubo de 50 ml a 5000 rpm por 1 min em temperatura ambiente.
- Remover o máximo possível do lisado e transferi-lo para um tubo de 15 ml.
- Centrifugar o tubo de 15 ml por 5 min a 5000 x g.
- Transfira o sobrenadante (~ 7 ml) para um tubo novo 50 ml.
- Adicionar um volume (ml ~ 7) de EtOH 100% ao lisado.
- Usando uma seringa de 30 ml que se encaixa dentro do tubo de 50 ml, desenhe o lisado up através de uma agulha de calibre 18-21 e passá-lo de volta ~ 5 vezes. Quando terminar, deixe o lisado na seringa.
- Continue a extração com o kit QIAGEN Mini RNeasy. É útil usar um colector de vácuo aqui, já que o volume lisado (~ 14ml) é muito maior do que o protocolo original do kit (0,7 ml). Alternativamente, o lisado pode ser traçada através adicionando 700 mL para a coluna, a centrifugação, e repetir até que todos os lisado foi aplicada à coluna.
- Colocar uma coluna girar no colector de vácuo e aplicar 700 mL da amostra. Aplique a pressão de vácuo para o colector para sacar o lisado. Continue adicionando o lisado da seringa até que tudo isso tem sido aplicado à coluna.
- Adicionar 700 mL de buffer RW1 para a coluna e desenhar para baixo com pressão de vácuo.
- Adicionar 500 mL tampão RPE para a coluna e desenhar para baixo com pressão de vácuo.
- Adicionar uma segunda alíquota de 500 mL tampão RPE para a coluna e desenhar para baixo com pressão de vácuo.
- Uma vez que a lavagem foi totalmente aspirado para dentro, remover a coluna e colocar em um tubo de coleta.
- Centrifugar o tubo por 1 min a 8000 x g. Descartar por escoamento.
- Centrífuga um adicional de 2 min a 8000 xg para se livrar do EtOH.
- Transferência da coluna para um novo col 2 mltubo de lição. Pipeta mL 35 de RNase água diretamente sobre a membrana. Fechar tubo e deixe descansar por 1 min.
- Centrifugar por 2 min a 8000 x g.
- Quantificar o RNA total por espectrofotometria.
Parte 3. DNAse tratamento
Esta parte utiliza o DNA livre Ambion TURBO kit de acordo com as instruções do fabricante
- Adicionar 3,4 mL 10x DNase I Buffer e 1μl rDNase I da amostra de RNA.
- Incubar a 37 º C por 30min.
- Vortex do Reagente Inativação DNase e adicionar 3,4 mL do reagente para a inativação da amostra.
- Incubar por 2 min à temperatura ambiente com mistura ocasional.
- Giram a 10,000 xg por 1,5 min à temperatura ambiente, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo. Evitar a introdução do reagente inativação dentro do tubo fresco.
Parte 4. Remoção rRNA primeiro
Esta parte utiliza o kit Epicentre mRNA-somente de acordo com as instruções do fabricante
- Delicadamente misturar e centrifugar brevemente o Buffer de mRNA-ONLY Reação 10X antes de usar.
- Em um tubo estéril ml (RNase-free) 0,5, combinam os componentes seguinte reação no gelo:
mRNA-ONLY Tampão de reacção 10X 2,0 mL Inibidor de RNase 0,5 mL Exemplo de RNA total (200 mg ng-10) 16,5 mL Terminator Exonuclease (1 unidade) 1,0 mL Volume total 20,0 mL - Incubar a reação a 30 ° C por 60 min em um termociclador (com tampa aquecida) ou banho-maria.
- Terminar a reação com a precipitação de fenol / EtOH:
- Adicionar RNase H2O para um volume total de 200 mL (= mL 180).
- Extrato: Fenol: Clorofórmio (1:1), um volume (mL = 200). Vortex vigorosamente e depois girar 2-5 min em velocidade máxima.
- Remover fase aquosa (~ mL 200).
- Adicionar 0,1 volumes de 3 acetato de sódio M (20 l) + volume de 2.5 de 100% gelada EtOH (500 mL)
- Incubar a -80 º C por 15-30 min.
- Pellet a 4 º C, velocidade máxima, 30 min; observe a posição do tubo de aspiração depois de amostra (pellet pode ser difícil de ver).
- Elimine o sobrenadante com aspirador ou pipeta.
- Lavar com 70% EtOH 500 mL de gelo frio. Ressuspender em vortex.
- Centrifugar por 10 min em velocidade máxima. Elimine o sobrenadante.
- Centrífuga líquido restante no tubo novamente 10 min em velocidade máxima.
- Aspirar cuidadosamente líquido e seco pellet completamente, deixando-a aberta para ~ 10 min sob o capô.
- Ressuspender em 15-20 mL RNase H2O (volume máximo de entrada é de 15 MICROBExpress mL); deixe repousar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Use Bioanalyzer ou Experion para verificar se há contaminação do rRNA e da qualidade de mRNA nesta etapa.
- Este é um ponto de parada em potencial. RNA podem ser armazenadas a -80 º C de armazenamento.
Parte 5. Remoção rRNA segunda
Esta parte utiliza o Ambion MICROBEnrich e kits MICROBExpress acordo com as instruções do fabricante. Ambos os kits podem ser usados várias vezes para aumentar a eficiência dos eucariotas (MICROBEnrich) e procarióticas (MICROBExpress) remoção rRNA. A entrada da RNA total deve ficar entre 20-10 mg. O volume de RNA deve ser inferior a 15 mL. Assim, a entrada ideal é> 150 ng / mL. -
MICROBEnrich
- Pipetar 300 mL de buffer Binding em um tubo de 1,5 ml
- Adicionar 500-100 mg RNA total em um volume máximo de 30μl e vortex suavemente
- Adicionar 2 l da Mix Captura Oligo por 5 mg RNA em tampão de vinculação. Toque suavemente e rapidamente tubo girar a mistura.
- Mistura desnaturar a 70 ° C por 10 min
- Recozer a mistura a 37 ° C por 1 hora. Prepare as contas durante a incubação.
- Prepare Oligo MagBeads (geralmente 25 mL) por lavagem de vez em água livre de nuclease e uma vez em tampão Binding, capturando as contas em um suporte magnético entre lavagens. Armazenar as esferas no gelo. Aquecê-los até o quarto de temperatura 5 min antes do uso.
- Aquecer a solução de lavagem a 37 ° C em bloco de aquecimento.
- Adicione o RNA / capturar Oligo Mix para o MagBeads lavados Oligo. Muito delicadamente misturar o tubo e gire rapidamente.
- Incubar a mistura a 37 ° C por 15 min.
- Colocar o tubo no suporte magnético e aguarde ~ 3 min.
- Aspirar o sobrenadante (contém mRNA) e transferi-lo para um tubo de coleta no gelo.
- Adicionar 100 ul de pré-aquecido a Solução de Lavagem de contas capturado. Suavemente vortex as contas brevemente. Captura de contas e recuperar o sobrenadante. Piscina esta sobrenadante com mRNA no tubo de coleta em gelo (~ 450 mL de volume final).
- Coloque o tubo de coleta no gelo. Se um segundo turno vai ser realizado, volte para a 5.3) seção e repita o procedimento. Em alternativa, mude imediatamente para o kit MICROBExpress (5,18, veja abaixo).
- OlioBeads usado pode ser utilizado uma segunda vez. Regenerar o Oligobeads, incubando-as com 2 volumes (geralmente 50 L) de Regeneração Solução 1 para 1 hr. Capturar as contas em um suporte magnético. Lavá-los duas vezes com 2 volumes de Regeneração Solução 2 (geralmente 50 ul) e ressuspender-los em seu volume original da solução ressuspensão (geralmente 25 mL).
MICROBExpress - Pipetar 200 mL de buffer Binding em um tubo de 1,5 ml.
- Adicionar 20-10 mg RNA total em um volume máximo de 15μl e vortex suavemente.
- Adicionar 4 mL da mistura de Captura Oligo para o RNA em tampão de vinculação. Toque suavemente e rapidamente tubo girar a mistura.
- Mistura desnaturar a 70 ° C por 10 min.
- Recozer mistura a 37 ° C por 15 min Prepare contas durante este incubação.
- Prepare MagBeads Oligo por lavagem de vez em água livre de nuclease seguido de duas lavagens em 50 mL de buffer Binding, capturando as contas em um suporte magnético entre lavagens. Contas ressuspender em 50 mL de buffer Binding e incubar a 37 ° C até o uso.
- Aquecer a solução de lavagem a 37 ° C em bloco de aquecimento
- Vortex lavados Oligo MagBeads suavemente. Adicionar 50 mL MagBeads Oligo a RNA / capturar Mix Oligo. Muito delicadamente misturar o tubo e gire rapidamente.
- Incubar mistura a 37 ° C por 15 min.
- Colocar o tubo no suporte magnético e aguarde ~ 3 min.
- Aspirar o sobrenadante (contém mRNA) e transferi-lo para um tubo de coleta no gelo.
- Adicionar 100 ul de pré-aquecido a Solução de Lavagem de contas capturado. Suavemente vortex as contas brevemente.
- Captura de contas e recuperar o sobrenadante. Piscina esta sobrenadante com mRNA no tubo de coleta em gelo (~ 350 mL de volume final).
- Se um segundo turno vai ser realizado, volte para a seção 5.18) e repita o procedimento. Em alternativa, proceder imediatamente a mRNA precipitação.
- Precipitar e mRNA ressuspender:
- Para o mRNA pooled adicionar 35 mL de acetato de sódio e adicionar 7 mL de glicogênio.
- Adicionar 1175 mL EtOH a frio de gelo de 100% e vortex completamente.
- Precipitar a -20 ° C por pelo menos 1h.
- Centrifugar por 30 min a 10.000 x g.
- Decantar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante.
- Adicionar 750 mL de gelo EtOH a frio 70% e brevemente vortex.
- Centrifugar por 5 min a 10.000 xg e descartar o sobrenadante.
- Fazer um segundo 70% EtOH lavar.
- Respin brevemente o tubo depois de retirar o segundo 70% EtOH lavar.
- Remova cuidadosamente qualquer sobrenadante com uma pipeta.
- O ar seco do sedimento por 5 min.
- Ressuspender o sedimento em 25 mL de RNA tampão TE ou água livre de RNase
- Reidratar RNA por 15 min em temperatura ambiente.
- Vortex vigorosamente a amostra se necessário.
- Se for necessário remover contas restantes, tubo lugar em suporte magnético para ~ 3min e mover mRNA enriquecido a nova tubo RNase livre.
- Use Bioanalyzer ou Experion para verificar se há contaminação do rRNA e da qualidade de mRNA nesta etapa.
- Este é um ponto de parada em potencial. RNA podem ser armazenadas a -80 º C de armazenamento.
Parte 6: A amplificação de mRNA
Esta parte utiliza o kit Ambion MessageAmp II-Bactérias acordo com as instruções do fabricante. Calcule mestre mistura on-line em www.ambion.com/tools/ma2bact .
- Poliadenilação de RNA modelo:
- Lugar até 1000 ng de RNA total (tipicamente 100-500 ng) ou até 500 ng mRNA (normalmente 10 ng-200 ng) em um tubo de microcentrífuga estéril RNase-free. Use 6,5 mL de amostra e sem água RNase livre no primeiro buffer.
- Incubar por 10 min a 70 ° C, de preferência em um termociclador.
- Remova a amostras de RNA a partir do 70 ° C incubadora e uma breve centrifugação (~ 5 s) para coletar amostra no fundo do tubo. Coloque a mistura em gelo por 3 min.
- Prepare Mix Master poliadenilação em um tubo de nuclease livres à temperatura ambiente na ordem mostrada na folha de cálculo. Montar master mix suficiente para todas as amostras do experimento, incluindo ≤ excesso de 5% para cobrir erros de pipetagem. Suavemente vortex para fazer uma mistura homogênea, sem inativação da enzima, então centrifugar por 5 s ~ para recolher o master mix na parte inferior do tubo.
- Transferência de 3,5 mL da mistura de poliadenilação mestre para cada amostra de RNA, homogeneizar em vortex gentil e seguir com um giro rápido para coletar a reação.
- Coloque as amostras a 37 ° C incubadora. Reações incubar por 15 mina 37 ° C, em seguida, centrifugar rapidamente para recolher a reacção na parte inferior do tubo.
- Após a incubação 37 ° C, coloque as reações sobre o gelo e proceder imediatamente à transcrição reversa.
- Transcrição reversa para sintetizar Strand cDNA Primeiro:
- Prepare Mix Master Transcrição reversa em um tubo de nuclease livres à temperatura ambiente na ordem mostrada na folha de cálculo. Montar master mix suficiente para todas as amostras do experimento, incluindo ≤ excesso de 5% para cobrir erros de pipetagem. Suavemente vortex para fazer uma mistura homogênea, sem inativação da enzima, então centrifugar por 5 s ~ para recolher o master mix na parte inferior do tubo.
- Transferência de 10 ml da mistura de Transcrição reversa Mestre para cada amostra, homogeneizar em vortex gentil, e siga com uma rotação rápida de recolher a reação.
- Colocar as amostras em 42 ° C incubadora. Incubar por 2 horas a 42 ° C, em seguida, centrifugar rapidamente (~ 5 s) para recolher a reacção na parte inferior do tubo.
- Colocar os tubos em gelo e imediatamente prosseguir para a segunda vertente de síntese de cDNA.
- Síntese Strand cDNA segunda:
- Sobre o gelo, prepare um Mix Master Segundo Strand, misturando os reagentes a seguir na ordem mostrada na folha de cálculo. Montar master mix suficiente para todas as amostras do experimento, incluindo ≤ excesso de 5% para cobrir erros de pipetagem. Suavemente vortex para fazer uma mistura homogênea, sem inativação das enzimas, então centrifugar por 5 s ~ para recolher o master mix na parte inferior do tubo.
- Transferência de 80 mL da mistura Segundo Strand mestre para cada amostra, homogeneizar em vortex gentil, e seguir com uma rotação rápida de recolher a reação.
- Colocar as amostras em um 16 ° C cycler térmico. É importante para resfriar o bloco do termociclador a 16 ° C antes de adicionar os tubos de reação porque sujeitando as reações a temperaturas> 16 ° C irá comprometer o rendimento ARNA.
- Incubar por 2 horas a 16 ° C Incubar 2 horas em um 16 ° C ciclador térmico. Se a temperatura da tampa não pode ser ajustado para coincidir com o 16 ° temperatura do bloco C, cobrir as reações com a tampa aquecida desligado, ou se a tampa não pode ser desligado, não cobrem os tubos com ele.
- Coloque reações em breve gelo. Não deixe as reações sobre o gelo por longos períodos de tempo.
- 5.4) Purificação cDNA:
- Todas as centrifugações neste processo de purificação deve ser feito a 10.000 xg (tipicamente ~ rpm 10.000) em temperatura ambiente. Verificar o buffer cDNA Binding para a precipitação antes de usá-lo. Se um precipitado é visível, dissolver-lo pelo aquecimento da solução a 37 ° C por até 10 min e vórtex vigorosamente. Esfriar a temperatura ambiente antes de usar.
- Antes de iniciar a purificação do DNA, pré-aqueça o frasco de 10 ml de água livre de nuclease a 50 ° C durante pelo menos 10 min.
- Adicionar 250 mL de tampão de ligação cDNA de cada amostra e misture delicadamente vórtex.
- Centrifugar por 1 min ~ a 10.000 g, ou até que a mistura é através do filtro. Descartar o fluxo através de e substituir o cartucho de cDNA filtro no tubo de lavagem.
- Aplicar 500 mL tampão de lavagem para cada cartucho de cDNA Filter. Centrifugar por 1 min ~ a 10.000 g, ou até que todos o tampão de lavagem é através do filtro. Descartar o fluxo através de e girar o cartucho de cDNA de filtro para um minuto para remover traços de EtOH.
- Transferência de cartucho de filtro cDNA a um tubo de eluição cDNA. Eluir cDNA com 20 l de 50 ° C água livre de nuclease. É importante o uso de água livre de nuclease que é a 50 ° C para a eluição cDNA. Água mais fria será menos eficiente na eluição do cDNA e água mais quente (> 55 ° C) podem resultar em rendimento ARNA reduzida.
- Para o centro do filtro no cartucho cDNA Filter, aplicar 20 l de pré-aquecido (50 ° C) de água livre de nuclease. Deixe em temperatura ambiente por 2 min e então centrifugar por ~ 1,5 min a 10.000 xg, ou até toda a água livre de nuclease é através do filtro. O cDNA dupla fita será agora no eluir (~ mL 16).
- O cDNA purificado pode ser armazenado durante a noite a -80 ° C neste momento, se desejar.
- Transcrição in vitro para sintetizar ARNA
- É recomendado o uso de um forno de hibridização por causa de sua temperatura uniforme, e porque é extremamente importante que a condensação não se forma no interior dos tubos. Recomendamos vivamente a 14 horas de incubação reação IVT para maximizar o rendimento ARNA. Para o rendimento mais elevado Arna, conduzir o IVT em um volume de reação 40 mL final.
- À temperatura ambiente, montar um Mix Master IVT adicionando os reagentes na ordem listada na folha de cálculo. Misture bem delicadamente vórtex. Brevemente centrífuga (~ 5 s) para colcionar o Mix Master IVT na parte inferior do tubo e colocar no gelo.
- Transferência IVT Mix Master para cada amostra seguindo as orientações da folha de cálculo, misturar bem em vortex gentil, centrifugar rapidamente para recolher a reacção, e colocar os tubos em uma incubadora de 37 ° C.
- Incubar por 14 horas a 37 ° C.
- Após a incubação, adicionar água livre de nuclease para cada amostra ARNA para trazer o volume final de 100 ml. Misturar bem em vortex gentil. Coloque o ARNA diluída no gelo se a etapa de purificação ARNA será feito imediatamente. Alternativamente, o ARNA podem ser armazenadas a -20 ° C.
- Purificação ARNA
- Todas as centrifugações nesta seção deve ser feito a 10.000 xg (tipicamente ~ rpm 10.000).
- Antes de iniciar a purificação ARNA pré-aquecer o frasco de 10 ml de água livre de nuclease a 55 ° C por> 10 min.
- Adicionar 350 uL de tampão ARNA vinculação para cada amostra ARNA. Misturar bem em vortex gentil, e prossiga para a próxima etapa imediatamente.
- Adicionar 250 L de ACS EtOH grade 100% a cada amostra de Arna, e misture por pipetagem a mistura de cima e para baixo 3 vezes. Não vortex para misturar. Proceder de imediato para o passo seguinte assim que a mistura do etanol em cada amostra.
- Coloque um filtro de cartucho ARNA em um tubo de coleta Arna, e pipetar cada mistura de amostra para o centro do filtro no filtro ARNA Cartucho.
- Centrifugar por 1 min ~ a 10.000 x g. Continue até que a mistura passou através do filtro. Descartar o fluxo através de e substitua o cartucho de filtro ARNA no tubo de coleta ARNA.
- Aplicar 650 mL tampão de lavagem para cada filtro ARNA Cartucho. Centrifugar por 1 min ~ a 10.000 xg, ou até que toda a solução de lavagem é através do filtro. Descartar o fluxo através de e girar a ARNA filtro cartucho para um adicional de ~ 1 min para remover traços de EtOH.
- Transferência do filtro cartucho (s) para um novo tubo Colecção ARNA. Para o centro do filtro, adicionar 75 água livre de nuclease mL que é pré-aquecido a 50-60 ° C. Substitua o recipiente de água livre de nuclease no 50-60 ° C incubadora.
- Deixe em temperatura ambiente por 2 min e então centrifugar por ~ 1,5 min a 10.000 xg, ou até que a solução é através do filtro.
- Repita a eluição com um mL 75 segundo de água livre de nuclease. O ARNA será agora no tubo de coleta ARNA em ~ 150 mL de água livre de nuclease. Descartar a ARNA filtro de cartucho.
- Loja ARNA a -80 ° C e minimizar repetidos de congelamento e descongelamento.
Parte 7: síntese de cDNA
Esta parte utiliza a Promega Universal RiboClone kit Sistema de cDNA Synthesis com ligeira modificação com as instruções do fabricante. Padrão de entrada 2 mg, por 454 seqüenciamento, recomenda-se começar com 10 mg. Se a concentração é muito baixo, o ARNA pode ser concentrada ou com precipitação EtOH ou concentração de vácuo. Se 10 mg é usado como entrada RNA, em seguida, todos os reagentes escala por um fator de enzimas 5O vêm em unidades diferentes a cada lote, assim volumes têm de ser calculados a cada vez.
- Síntese Strand primeiro:
- Tome um tubo de 0,5 ml da PCR e adicionar:
amostra de mRNA 2 g (ou 10 g se for utilizado para seqüenciamento 454) Primer Hex aleatória (0,5 mg / ml) 2 l Água livre de nuclease ao volume 0 (ou não é amostra foi diluída) Volume Total 15 mL - Calor da reação a 70 ° C por 10 min. Frio o tubo em gelo por 5 min e girar rapidamente para recolher a solução no fundo do tubo.
- Adicione os seguintes componentes na ordem mostrada:
Amostra 15 mL Tampão Strand primeira 5X 5 mL RNasin Ribonuclease Inibidor 40 u 1 ml ... 40 u / mL Volume Total 21 mL - Mix reaction e brevemente spin. Mistura de calor a 37 ° C por 5 min.
- Adicione os seguintes componentes:
Amostra da etapa 1 21,0 mL Pirofosfato de sódio, 40 mM 2,5 mL AMV reverssa Trancriptase 30 u 1,5 mL ... 22 u / mL Água livre de nuclease 0,0 mL Volume Total 25,0 mL - Incubar a reação por 1 hora a 37 ° C em forno de hibridização.
- Após a reação de incubação colocar no gelo.
- Tome um tubo de 0,5 ml da PCR e adicionar:
- Segunda-Strand Synthesis:
- Adicione os seguintes componentes:
Strand primeiro-reação 25,0 mL Segundo Strand Buffer de 2.5X 40,0 mL BSA, 1 mg / ml 5,0 mL DNA polimerase I 23 u 3,0 mL RNase H 0,8 u 0,5 mL ... 1,5 u / mL Água livre de nuclease 26,5 mL Volume Total 100,0 mL - Misture delicadamente sacudindo o tubo. Incubar as reações a 14 ° C por 2 h em um termociclador. É importante para resfriar o termociclador a 14 ° C antes de adicionar os tubos de reação. Não deixe que a reação se acima de 14 ° C, antes ou durante a reação.
- Para terminar a reação, adicionar 2 unidades de Polimerase DNA T4 por mRNA mg de entrada para a reação. Incubar por 10 min a 14 ° C.
- Pare a reação adicionando 10 ml de 500 DEPC mM EDTA tratados e colocar no gelo.
- Limpe o cDNA usando uma precipitação EtOH ou o Assistente do Sistema DNA Promega Limpeza de acordo com as instruções do fabricante. Armazene as amostras à temperatura de -80 ° C. Dupla fita de cDNA podem ser diretamente pyrosequenced neste momento.
- Adicione os seguintes componentes:
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Discussion
A investigação da expressão gênica por comunidades microbianas naturais tem se tornado comum nos últimos anos como um meio para explorar os papéis e funções ecológicas dos microrganismos. Usado em combinação com a detecção, quantificação e caracterização de microrganismos marinhos, análises de expressão gênica pode ser usada para ligar filogenia para funcionar em comunidades microbianas naturais. Muitas técnicas para orientar a expressão do gene funcional contar com sondas específicas ou conjuntos primário projetado para genes de seqüência conhecida. Em contraste, transcriptômica ambiental pode ser usado para examinar a expressão gênica sem restrições impostas pela seqüência de dados existentes e com preferência para aqueles genes sendo ativamente expressa. Análise do conjunto de mRNA no ambiente pode, portanto, fornecem uma das formas mais eficazes de descobrir conexões entre as atividades-chave e os organismos que mediam-los.
A aplicação inicial de transcriptômica ambientais desde que uma das primeiras vistas da composição e dinâmica da piscina mRNA bacteriana em três ecossistema natural. Análise dos genes expressos em bibliotecas transcrição de ambos os litorais um pântano de sal (Sapelo Island, GA) e um alcalino, hipersalinos lago (Mono Lake CA) revelou seqüências de genes de interesse biogeoquímicos, incluindo as variantes ambientais de vários genes funcionais, tais como quitinases e enxofre genes de oxidação que são específicos a cada um destes ecossistemas. Ele também forneceu evidências para a novela, os processos inesperados, como a degradação microbiana de poliaminas vascular de plantas e de algas derivadas de carbono como uma possível e fontes de nitrogênio.
Como técnicas moleculares evoluir para reduzir as limitações associadas ao trabalho com RNA a partir de amostras ambientais e de tecnologias de seqüenciamento melhorar, transcriptômica ambiental tornou-se uma técnica mais amplamente utilizada. Ela tem sido usada para examinar as funções de microorganismos na superfície do oceano 6 e comparar o dia ea noite a expressão do gene funcional dentro do mesmo ambiente 7. Transcriptômica ambientais também podem ser usados para a obtenção de uma melhor compreensão das respostas microbianas a determinados fatores ambientais e biogeoquímica. Genes ou funções descoberto usando esta técnica pode servir como alvos para estudos mais quantitativa da expressão do gene, tais como microarrays e PCR quantitativo.
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Acknowledgments
O financiamento foi fornecido pela The Gordon e Betty Moore Foundation concede e da National Science Foundation conceder MCB-0702125.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega Corp. | A7280 |
References
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