Summary
Vi presenterar en metod för att generera cDNA från miljö-mRNA. I allmänhet är total RNA först samlades från omgivningen, är rRNA selektivt avlägsnas, mRNA är selektivt förstärks, och cDNA syntetiseras från anrikat mRNA poolen är kartlagt. Återvunna sekvenser kan förses med standard bioinformatiska metoder för att identifiera uttryck gener.
Abstract
Analogt med metagenomik, miljö transkriptomik (metatranscriptomics) hämtar och sekvenser miljö mRNA från en mikrobiell samling, utan kunskap om vilka gener samhället kan uttrycka. Således ger den mest objektiva perspektiv på samhället genuttryck
Protocol
Arbeta med RNA
Eftersom RNaser finns överallt och mRNA snabb nedbrytning, standard försiktighetsåtgärder för att arbeta i en ribonukleas-fri miljö måste följas och prover bör behandlas eller bevaras så snart som möjligt efter insamlingen.
Del 1: Environmental RNA Collection (för att samla in biomassa i 0,2-3,0 ìm Partikelstorleksfraktioner)
Förbrukningsmaterial som behövs:
Masterflex slang
Slangpumpar
3 ìm hög volym veckade kapsel filter
0,22 ìm Supor eller polykarbonat 142 mm filter
142 mm filter tornet (Geotech Environmental Utrustning)
10-20 L Damejeanne (examen)
Whirl Förpackningar
Flytande kväve
RLT buffert (Qiagen)
Beta-merkaptoetanol
Inställningar:
Rengör handskar bör användas när hantering av filter eller röra någon av invändiga komponenter i filtret linjen. Tång bör hållas i rena, 50 ml koniska rör, helst fylld med etanol. För att förhindra att stora förändringar i avskriften poolen, hålla filtrering och urval gånger hantering så kort som möjligt.
Placera ena änden av slangen i vattnet vid önskat djup för provtagning. På den motsatta änden, fäst hög volym 3 mikrometer filter. Anslut den 3 mikrometer filter till 0,22 ìm filter tornet. Direkt övergången från 0,22 ìm i en graderad Damejeanne.
Förfarande:
- Köra flera liter vatten genom systemet (inga 0,22 ìm filter) för att skölja. När du är klar, ta bort slangen från vattnet medan pumpen går för att rensa kvarvarande vatten från linjen.
- Använd pincett, placera en 0,22 ìm filter på filtret tornet och nära.
- Placera änden av linjen tillbaka i vattnet och slå på pumpen. Rensa luften från både filter. Övervaka den mängd vatten som filtreras med graderingen på Damejeanne.
- När önskad volym har filtrerats bort linan från vattnet och rensa återstående vatten från systemet.
- Så snart filtret är torrt, snabbt ta bort den övre filtret skivan och vik filtret. Placera filtret i en virvel pack eller 15 ml provrör med 2 ml RLT buffert med beta-merkaptoetanol. Snap frysa i flytande kväve.
Del 2: Total RNA-extraktion från 0,22 ìm filter
Denna del använder QIAGEN RNeasy mini-kit med ändringar av tillverkarens anvisningar
- Förbered pärla slå rör genom att lägga till 8 ml RLT buffert (beta-merkaptoetanol lagts till) till en 50 ml koniska rör. Tillsätt 1-2 ml av RNA-pärlor från en MoBio Powersoil utvinning kit
- Snabbt bort den frusna filtret från frysen, och hålla den i virveln pack, krossa det med en hammare. Alternativt, skär filtren i små bitar i samlingen röret (15ml) med en steril rakblad och lägga allt till den förberedda röret (50ml).
- Tillsätt krossade filtret förberedda röret (50ml) och försegla röret locket med parafilm eller lab tejp.
- Vortexa i 10 minuter i full fart med hjälp av en vortexer med ett fäste för 50 ml rör.
- Centrifugera 50 ml tub vid 5000 rpm i 1 minut vid rumstemperatur.
- Ta bort så mycket som möjligt av lysat och överför den till ett 15 ml rör.
- Centrifugera 15 ml tub i 5 min vid 5000 x g.
- Överför supernatanten (~ 7 ml) till ett nytt 50 ml rör.
- Tillsätt 1 volym (~ 7 ml) av 100% EtOH till lysat.
- Använd en 30 ml spruta som passar i 50 ml tub, dra lysat upp genom en 18-21 gauge nål och ge det tillbaka ut ~ 5 gånger. När du är klar lämnar lysat i sprutan.
- Fortsätt extraktionen med QIAGEN RNeasy Mini kit. Det är bra att använda ett vakuum grenrör här, eftersom lysat volymen (~ 14ml) är mycket högre än den ursprungliga kit-protokollet (0,7 ml). Alternativt kan lysat dras genom genom att tillsätta 700 l till kolumnen, centrifugering, och upprepa tills alla lysat har tillämpats på kolumnen.
- Placera en spin kolumn på vakuum grenröret och gäller 700 l av provet. Applicera vakuum i grenröret för att dra ner lysat. Fortsätt att lägga till lysat på sprutan förrän allt detta har tillämpats på kolumnen.
- Tillsätt 700 l buffert RW1 till kolumnen och dra ner med vakuum.
- Tillsätt 500 l buffert RPE till kolumnen och dra ner med vakuum.
- Lägg till en andra portion av 500 l buffert RPE till kolumnen och dra ner med vakuum.
- När tvätten har helt dras genom, ta bort kolumnen och lägg i en provröret.
- Centrifugera röret i 1 min vid 8000 x g. Kasta genomströmning.
- Centrifugera ytterligare 2 min vid 8000 xg för att bli av med EtOH.
- Överför kolumn till en ny 2 ml colinsamlingssystem rör. Pipettera 35 ìl RNase-fritt vatten direkt på membranet. Stäng röret och låt stå i 1 min.
- Centrifugera 2 minuter vid 8000 x g.
- Kvantifiera det totala RNA spektrofotometriskt.
Del 3. DNAse behandling
Denna del använder Ambion TURBO DNA-kit enligt tillverkarens anvisningar
- Tillsätt 3,4 l 10x DNas jag Buffer och 1μl rDNase jag till RNA-prov.
- Inkubera vid 37 º C i 30min.
- Vortexa DNas Inaktivering Reagens och tillsätt 3,4 ìl av inaktivering reagens till provet.
- Inkubera 2 minuter vid rumstemperatur med enstaka blandning.
- Snurra på 10,000 xg 1,5 minuter i rumstemperatur, sedan Överför supernatanten till ett nytt rör. Undvika att införa inaktivering reagens i friska röret.
Del 4. Första rRNA borttagning
Denna del använder Epicentrum mRNA-ONLY kit enligt tillverkarens anvisningar
- Blanda försiktigt och kortfattat centrifugera mRNA-ONLY 10X Reaktionsbufferten före användning.
- I en steril (RNase-fria) 0,5 ml tub, kombinera följande reaktion komponenter på is:
mRNA-ONLY 10X Reaktionsbufferten 2,0 l RNas Inhibitor 0,5 l Total RNA Exempel (200 ng-10 mikrogram) 16,5 l Terminator exonuclease (1 enhet) 1,0 l Total volym 20,0 l - Inkubera reaktionen vid 30 ° C i 60 min i en termocykler (med uppvärmda lock) eller vattenbad.
- Avsluta reaktion med fenol / EtOH nederbörd:
- Lägg RNas-fri H2O till en total volym på 200 l (= 180 l).
- Utdrag: Fenol: Kloroform (1:1), en volym (= 200 l). Vortex kraftfullt och sedan snurra 2-5 min i full fart.
- Ta bort vattenfasen (~ 200 l).
- Lägg till 0,1 volymer av 3 M natriumacetat (20 l) + 2,5 volym på 100% iskall EtOH (500 l)
- Inkubera vid -80 º C i 15-30 min.
- Pellets vid 4 º C, toppfart, 30 min, notera positionen av röret för senare aspiration av provet (pellets kan vara svårt att se).
- Kassera supernatanten med aspirator eller pipett.
- Tvätta med 500 l 70% iskall EtOH. Resuspendera genom att vortexa.
- Centrifugera i 10 min i full fart. Kassera supernatanten.
- Centrifugera kvarvarande vätska i röret igen 10 minuter i full fart.
- Aspirera flytande noga och torka pellets helt genom att lämna den öppen för ~ 10 min under huven.
- Resuspendera på 15-20 l RNase-fria H2O (max input volym MICROBExpress är 15 l), låt den stå i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Använd Bioanalyzer eller Experion att kontrollera rRNA kontamination och kvalitet mRNA i detta steg.
- Detta är ett potentiellt stopp punkt. RNA kan förvaras vid -80 ° C förvaring.
Del 5. Andra rRNA borttagning
Denna del använder Ambion MICROBEnrich och MICROBExpress kit enligt tillverkarens anvisningar. Båda kit kan användas flera gånger för att öka effektiviteten i eukaryota (MICROBEnrich) och prokaryota (MICROBExpress) rRNA borttagning. Inmatningen av totala RNA bör vara mellan 20-10 mikrogram. Volymen av RNA bör vara mindre än 15 l. Således är det perfekta ingången> 150 ng / l. -
MICROBEnrich
- Pipettera 300 l Bindning buffert i ett 1,5 ml rör
- Lägg till 500-100 mikrogram totala RNA i en maximal volym av 30μl och virveln försiktigt
- Tillsätt 2 l av Capture Oligo Blanda 5 mikrogram RNA i bindande buffert. Knacka röret försiktigt och kortfattat spinn ner blandningen.
- Denaturera blandningen vid 70 ° C i 10 min
- Glödga blandningen vid 37 ° C under 1 timme. Förbered pärlor under inkubationstiden.
- Förbered Oligo MagBeads (vanligtvis 25 l) genom att tvätta en gång i nukleasfritt vatten och en gång i bindande buffert, fånga pärlor på ett magnetiskt står mellan tvättar. Förvara pärlor på is. Värm upp dem till rumstemperatur 5 min före användning.
- Värm Tvätta lösningen till 37 ° C i värmeblock.
- Lägg till RNA / fånga Oligo Blanda till tvättade Oligo MagBeads. Mycket försiktigt blanda röret och snurra kort.
- Inkubera blandningen vid 37 ° C i 15 min.
- Placera röret i den magnetiska stå och vänta på ~ 3 min.
- Sug ut supernatant (innehåller mRNA) och överför den till en samling provrör på is.
- Tillsätt 100 ìl förvärmda Tvätta lösning fångas pärlor. Vortexa försiktigt kulorna kortfattat. Fånga pärlor och återhämta supernatanten. Pool detta supernatanten med mRNA i samlingen röret på is (~ 450 l slutet volym).
- Placera provröret på is. Om en andra omgång kommer att ske, gå tillbaka till 5,3) avsnitt och upprepa proceduren. Alternativt, byt omedelbart till MICROBExpress kit (5,18, se nedan).
- Bilar OlioBeads kan användas en andra gång. Regenerera Oligobeads genom inkubering dem med två volymer (vanligen 50 l) av förnyelse Lösning 1 för 1 tim. Fånga pärlor i en magnetisk monter. Tvätta dem två gånger med 2 volymer Regeneration Lösning 2 (vanligtvis 50 l) och återsuspendera dem i deras ursprungliga volymen av resuspension lösning (oftast 25 l).
MICROBExpress - Pipettera 200 l Bindning buffert i ett 1,5 ml rör.
- Lägg till 20-10 mikrogram totala RNA i en maximal volym av 15μl och skaka försiktigt.
- Tillsätt 4 l av Capture Oligo Blanda till RNA i bindande buffert. Knacka röret försiktigt och kortfattat spinn ner blandningen.
- Denaturera blandningen vid 70 ° C i 10 min.
- Glödga blandningen vid 37 ° C i 15 minuter Förbered pärlor under inkubationstiden.
- Förbered Oligo MagBeads genom att tvätta en gång i nukleasfritt vatten, följt av två tvättar i 50 l Bindning buffert, fånga pärlor på ett magnetiskt står mellan tvättar. Återsuspendera pärlor i 50 l Bindning buffert och inkubera vid 37 ° C fram till användning.
- Värm Tvätta lösningen till 37 ° C i värmeblock
- Vortex tvättas Oligo MagBeads försiktigt. Tillsätt 50 l Oligo MagBeads till RNA / fånga Oligo Mix. Mycket försiktigt blanda röret och snurra kort.
- Inkubera mix vid 37 ° C i 15 min.
- Placera röret i den magnetiska stå och vänta på ~ 3 min.
- Sug ut supernatant (innehåller mRNA) och överför den till en samling provrör på is.
- Tillsätt 100 ìl förvärmda Tvätta lösning fångas pärlor. Vortexa försiktigt kulorna kortfattat.
- Fånga pärlor och återhämta supernatanten. Pool detta supernatanten med mRNA i samlingen röret på is (~ 350 l slutet volym).
- Om en andra omgång kommer att ske, gå tillbaka till avsnitt 5.18) och upprepa proceduren. Alternativt, omedelbart gå till mRNA nederbörd.
- Fällning och återsuspendera mRNA:
- Den poolade mRNA Tillsätt 35 l natriumacetat och tillsätt 7 l glykogen.
- Lägg till 1175 l iskallt 100% EtOH och skaka ordentligt.
- Fällning vid -20 ° C i minst 1 timme.
- Centrifugera 30 min vid 10,000 x g.
- Försiktigt dekantera och kassera supernatanten.
- Tillsätt 750 l iskallt 70% EtOH och skaka en kort stund.
- Centrifugera i 5 min på 10,000 xg och kassera supernatanten.
- Gör en andra 70% EtOH tvätt.
- Kortfattat respin röret efter kasta den andra 70% EtOH tvätt.
- Ta försiktigt bort alla supernatanten med en pipett.
- Lufttorka pellets i 5 minuter.
- Resuspendera RNA pelleten i 25 l TE buffert eller RNas fritt vatten
- Rehydrera RNA i 15 min i rumstemperatur.
- Vortex provet kraftfullt om det behövs.
- Om det är nödvändigt undanröja kvarvarande kulor, placera röret på magnetiska står för ~ 3min och flytta berikat mRNA till nya RNas fria rör.
- Använd Bioanalyzer eller Experion att kontrollera rRNA kontamination och kvalitet mRNA i detta steg.
- Detta är ett potentiellt stopp punkt. RNA kan förvaras vid -80 ° C förvaring.
Del 6: mRNA Amplification
Denna del använder Ambion MessageAmp II-bakterier kit enligt tillverkarens anvisningar. Beräkna huvudmixar online på www.ambion.com/tools/ma2bact .
- Polyadenylation av mall RNA:
- Placera upp till 1000 ng av Total RNA (normalt 100-500 ng) eller upp till 500 ng mRNA (typiskt 10 ng-200 ng) i en steril RNase-fri mikrofugrör. Använd 6,5 l av prov och ingen RNas fritt vatten i den första bufferten.
- Inkubera 10 minuter vid 70 ° C, helst i en termocykler.
- Ta bort RNA-prover från 70 ° C inkubator och centrifugera kort (~ 5 s) för att samla prov på botten av röret. Lägg blandningen på is i 3 min.
- Förbered Blanda polyadenylation Master i ett nukleasfritt röret vid rumstemp i den ordning som visas på beräkningen arket. Montera nog Master Mix för alla prover i försöket, däribland ≤ 5% överskott för att täcka pipettering fel. Vortexa försiktigt för att göra en homogen blandning utan att inaktivera enzymet, centrifugera sedan i ~ 5 s för att samla Master Mix i botten av röret.
- Överför 3,5 l av polyadenylation Master Mix till varje RNA-prov, blanda försiktigt genom att vortexa och följa med en snabb dragning för att samla reaktionen.
- Placera proverna i en 37 ° C inkubator. Inkubera reaktioner i 15 minvid 37 ° C, centrifugera kort att samla reaktionen vid botten av röret.
- Efter 37 ° C inkubering, placera reaktioner på isen och genast fortsätta till omvänd transkription.
- Omvänd transkription att syntetisera First Strand cDNA:
- Förbered Omvänd Blanda Transkription Master i ett nukleasfritt röret vid rumstemp i den ordning som visas på beräkningen arket. Montera nog Master Mix för alla prover i försöket, däribland ≤ 5% överskott för att täcka pipettering fel. Vortexa försiktigt för att göra en homogen blandning utan att inaktivera enzymet, centrifugera sedan i ~ 5 s för att samla Master Mix i botten av röret.
- Överför 10 ìl av omvänd transkription Master Mix till varje prov och blanda väl genom varsam vortexa och följa med en snabb dragning för att samla reaktionen.
- Placera proverna i en 42 ° C inkubator. Inkubera i 2 tim vid 42 ° C, centrifugera kort (~ 5 s) för att samla in reaktionen vid botten av röret.
- Placera rören på is och omedelbart gå vidare till den andra delen cDNA syntes.
- Andra programområdet cDNA syntes:
- På is, förbereda ett andra Mix Strand Mästaren genom att blanda följande reagenser i den ordning som visas i beräkningen arket. Montera nog Master Mix för alla prover i försöket, däribland ≤ 5% överskott för att täcka pipettering fel. Vortexa försiktigt för att göra en homogen blandning utan att inaktivering av enzymer, centrifugera sedan i ~ 5 s för att samla Master Mix i botten av röret.
- Överför 80 ìl av det andra ledet i Master Mix till varje prov och blanda väl genom varsam vortexa och följa med en snabb dragning för att samla reaktionen.
- Placera proverna i en 16 ° C thermocykelapparat. Det är viktigt att kyla värmecykelblocket till 16 ° C innan du lägger till reaktionsrören eftersom utsätta reaktioner för temperaturer> 16 ° C kommer att kompromissa ARNA avkastning.
- Inkubera 2 tim vid 16 ° C Inkubera 2 hr i en 16 ° C thermocykelapparat. Om locket temperaturen inte kan justeras för att matcha 16 ° C blockera temperatur, täcka reaktioner med den uppvärmda lock avstängd, eller om locket inte kan stängas av, inte täcker rören med det.
- Placera reaktioner på is kort. Låt inte reaktionerna på is under lång tid.
- 5,4) cDNA Rening:
- Alla centrifugering i denna rening förfarande bör göras vid 10000 xg (oftast ~ 10.000 rpm) vid rumstemp. Kontrollera cDNA bindningsbuffert för fällning innan du använder den. Om en fällning är synlig, lös upp det genom att värma lösningen till 37 ° C i upp till 10 min och vortexa kraftigt. Kyl till rumstemperatur före användning.
- Innan du börjar cDNA rening, förvärma 10 ml flaska nukleasfritt vatten till 50 ° C under minst 10 min.
- Tillsätt 250 ìl av cDNA Bindning buffert i varje prov och blanda väl genom att försiktigt vortexa.
- Centrifugera i ~ 1 min vid 10000 g, eller tills blandningen är genom filtret. Kassera genomströmning och ersätta det cDNA filterpatronen i tvätt röret.
- Applicera 500 l tvättbuffert i varje cDNA filterpatronen. Centrifugera i ~ 1 min vid 10000 g, eller tills alla tvättbufferten är genom filtret. Kassera genomströmning och snurra cDNA filter för en extra minut för att avlägsna spår av EtOH.
- Överför cDNA Filterpatroner till ett cDNA Elution Tube. Eluera cDNA med 20 l på 50 ° C nukleasfritt Vatten. Det är viktigt att använda nukleasfritt vatten som är 50 ° C för cDNA eluering. Kallare vatten kommer att vara mindre effektivt vid eluering av cDNA, och varmare vatten (> 55 ° C) kan leda till minskad ARNA avkastning.
- Till mitten av filtret i cDNA filterpatron, gäller 20 l förvärmd (50 ° C) nukleasfritt Vatten. Låt stå i rumstemperatur i 2 min och centrifugera sedan ~ 1,5 min vid 10000 xg, eller tills alla nukleasfritt vatten genom filtret. Den dubbel-strängat cDNA kommer nu att i eluera (~ 16 l).
- Det renade cDNA kan lagras över natten vid -80 ° C på denna punkt om så önskas.
- In Vitro Transkription att syntetisera ARNA
- Det rekommenderas att använda en hybridisering ugn på grund av deras jämn temperatur, och eftersom det är oerhört viktigt att kondens inte bildas inuti rören. Vi rekommenderar starkt en 14 tim IVT reaktion inkubation att maximera ARNA avkastning. För högsta ARNA avkastning, genomföra IVT i en 40 l sista reaktion volym.
- På rumstemp, montera en IVT Master Mix genom att lägga reagens i den ordning som anges på beräkningen arket. Blanda väl genom att försiktigt vortexa. Centrifugera kort (~ 5 s) till colavmarkerar funktionen IVT Master Mix längst ner i röret och placera på is.
- Överför IVT Master Mix till varje prov följa riktlinjerna för beräkningen blad, blanda försiktigt genom att vortexa, centrifug kort att samla reaktionen, och placera rören i en 37 ° C inkubator.
- Inkubera i 14 tim vid 37 ° C.
- Efter inkubationen, tillsätt nukleasfritt vatten till varje ARNA prov för att få den slutliga volymen till 100 l. Blanda noggrant genom försiktig vortexa. Placera den utspädda ARNA på is om ARNA reningssteget kommer att ske omedelbart. Alternativt kan ARNA förvaras vid -20 ° C.
- ARNA Rening
- Alla centrifugering i detta avsnitt bör göras på 10,000 xg (oftast ~ 10.000 rpm).
- Innan du börjar ARNA rening förvärma 10 ml flaska nukleasfritt vatten till 55 ° C> 10 min.
- Tillsätt 350 ìl ARNA Bindning buffert i varje ARNA prov. Blanda noggrant genom varsam vortexa och fortsätt till nästa steg direkt.
- Tillsätt 250 l av ACS kvalitet 100% EtOH till varje ARNA prov, och blanda genom att pipettera blandningen upp och ner tre gånger. Inte vortexblandare att blanda. Genast fortsätta till nästa steg så fort du har blandat den EtOH i varje prov.
- Placera en ARNA filtret i en ARNA provröret och pipettera varje prov blandningen på mitten av filtret i ARNA filterpatronen.
- Centrifugera i ~ 1 min vid 10000 x g. Fortsätt tills blandningen har passerat genom filtret. Kassera genomströmning och ersätta ARNA filterpatronen i ARNA provröret.
- Applicera 650 l tvättbuffert i varje ARNA filterpatronen. Centrifugera i ~ 1 min vid 10000 xg, eller tills alla tvättar lösningen genom filtret. Kassera genomströmning och snurra ARNA filter för en ytterligare ~ 1 min för att avlägsna spår av EtOH.
- Överföring filterpatron (s) till en ny ARNA provröret. Till mitten av filtret, lägga till 75 l nukleasfritt Vatten som förvärms till 50-60 ° C. Byt ut behållare med nukleasfritt Vatten i 50-60 ° C inkubator.
- Låt stå i rumstemperatur i 2 min och centrifugera sedan ~ 1,5 min vid 10000 xg, eller tills lösningen är genom filtret.
- Upprepa upplösning med en andra 75 ìl nukleasfritt Vatten. Den ARNA kommer nu att i ARNA provröret i ~ 150 ìl nukleasfritt Vatten. Kasta ARNA filterpatronen.
- Förvara ARNA vid -80 ° C och minimera upprepad frysning-tining.
Del 7: cDNA syntes
Denna del använder Promega Universal RiboClone cDNA kit Syntes System med liten ändring på tillverkarens instruktioner. Standard ingång 2 mikrogram, för 454 sekvensering, rekommenderas att börja med 10 mikrogram. Om koncentrationen är för låg, kan ARNA koncentreras med antingen EtOH nederbörd eller vakuum koncentration. Om 10 mikrogram används som RNA-ingång sedan skala alla reagenser upp med en faktor 5The enzymer finns i enheter olika varje parti, och därmed volymerna måste beräknas varje gång.
- Första Strand Syntes:
- Ta en 0,5 ml PCR-rör och lägg till:
mRNA prov 2 mikrogram (eller 10 mikrogram om den används för 454 sekvensering) Slumpmässiga Hex Primer (0,5 mg / ml) 2 l Nukleasfritt fritt vatten till volym 0 (eller icke är prov var utspädd) Total volym 15 l - Värm reaktionen till 70 ° C i 10 min. Chill röret på is i 5 min och spinn kort att samla in lösningen i botten av röret.
- Lägg till följande komponenter i angiven ordning:
Exempel på 15 l Första Strand 5X buffert 5 l RNasin ribonukleasinhibitor 40 u 1 l ... 40 u / l Total volym 21 l - Blanda reaction och spin kort. Värm blandningen vid 37 ° C i 5 min.
- Lägg till följande komponenter:
Prov från steg 1 21,0 l Natrium pyrophosphate, 40 mm 2,5 l AMV Omvänd Trancriptase 30 u 1,5 l ... 22 u / l Nukleasfritt fritt vatten 0,0 l Total volym 25,0 l - Inkubera reaktion för 1 h vid 37 ° C i hybridisering ugn.
- Efter inkubation plats reaktion på is.
- Ta en 0,5 ml PCR-rör och lägg till:
- Andra Strand Syntes:
- Lägg till följande komponenter:
Första Strand reaktion 25,0 l Andra programområdet 2,5 X Buffer 40,0 l BSA, 1 mg / ml 5,0 l DNA-polymeras I 23 u 3,0 l RNas H 0,8 u 0,5 l ... 1,5 u / l Nukleasfritt fritt vatten 26,5 l Total volym 100,0 l - Blanda försiktigt genom att ställa röret. Inkubera reaktioner vid 14 ° C i 2 tim på en termocykler. Det är viktigt att kyla termocykler till 14 ° C innan du tillsätter reaktionsrören. Låt inte reaktionen bli över 14 ° C före eller under reaktionen.
- För att avsluta reaktionen, tillsätt 2 enheter T4 DNA-polymeras per mikrogram ingång mRNA reaktionen. Inkubera 10 minuter vid 14 ° C.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 ìl av 500 mm DEPC behandlas EDTA och lägg på is.
- Rengör cDNA med hjälp av antingen en EtOH nederbörd eller Promega guiden DNA-Rensning system enligt tillverkarens anvisningar. Förvara proverna vid -80 ° C. Dubbel-strängat cDNA kan vara direkt pyrosequenced på denna punkt.
- Lägg till följande komponenter:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersökningen av genuttryck av naturliga mikrobiella samhällen har blivit vanligt på senare år som ett sätt att utforska den ekologiska roller och funktioner av mikroorganismer. Används i kombination med att upptäcka, kvantifiering och karakterisering av marina mikroorganismer kan analyser av genuttryck användas för att länka fylogeni att fungera i naturliga mikrobiella samhällen. Många metoder för inriktning funktionell genuttryck beroende på specifika prober eller ställer primer avsedd för gener kända sekvens. Däremot kan miljön transkriptomik användas för att undersöka genuttryck utan begränsningar av befintliga sekvens data och med företräde för dem som gener aktivt uttryckt. Analys av mRNA poolen i miljön kan därför ge en av de mest effektiva sätten att upptäcka sambanden mellan centrala aktiviteter och de organismer som förmedlar dem.
Den första tillämpningen av miljö transkriptomik som en av de första synpunkter sammansättning och dynamik bakteriell mRNA poolen i ett naturligt ekosystem 3. Analys av uttryck gener i avskrift bibliotek från både kustnära salt marsh (Sapelo Island, Georgien) och en alkalisk, hypersaline sjö (Mono Lake CA) visade gensekvenser av biogeokemiska intresse, däribland miljö-varianter av flera funktionella gener som kitinaser och svavel oxidation gener som var specifika för vart och ett av dessa ekosystem. Det gav också bevis för nya, oväntade processer såsom den mikrobiella nedbrytningen av kärlväxter och alger-derived polyaminer som en möjlig kol och källor kväve.
Som molekylära tekniker utvecklas för att minska de begränsningar som är förknippade med att arbeta med RNA från miljöprover och sekvensering teknik förbättras, har miljö-transkriptomik blivit en allt vanligare teknik. Det har använts för att undersöka funktioner av mikroorganismer i ytan havet 6 och att jämföra dag och natt funktionell genuttryck i samma miljö 7. Miljö transkriptomik kan också användas för att få en bättre förståelse av mikrobiella reaktioner på specifika miljöfaktorer och biogeokemi. Gener eller funktioner som upptäcktes med denna teknik kan tjäna som mål för mer kvantitativa studier av genuttryck som microarrays och kvantitativ PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansiering gavs av The Gordon och Betty Moore Foundation och National Science Foundation MCB-0.702.125.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega Corp. | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
