Summary
Biz çevre mRNA cDNA üreten için bir yöntem sunuyoruz. Genel olarak, toplam RNA ilk çevreden toplanan, rRNA seçici kaldırılır mRNA seçici yükseltilir ve zenginleştirilmiş mRNA havuzu sentezlenen cDNA dizisi. Kurtarılan dizileri ifade genleri tanımlamak için standart biyoinformatik teknikleri kullanarak açıklamalı olabilir.
Abstract
Metagenomics benzer, çevre transkriptomik (metatranscriptomics) alır ve topluluk ifade ne olabilir genler hakkında önceden bilgi sahibi olmadan bir mikrobiyal birleşmesi dizileri çevre mRNA'ların. Böylece toplum gen ekspresyonu en tarafsız bir bakış açısı sağlar
Protocol
RNA ile Çalışmak
RNases her yerde ve mRNA'ların takip edilmeli ve örnekleri işleme ya da kısa sürede mümkün aşağıdaki topluluğu olarak korunması gereken bir Ribonükleaz ortamda çalışmak için, standart önlemlerin hızla düşmeye Çünkü.
Bölüm 1: Çevre RNA Collection (0.2-3.0 mikron boyut fraksiyonunda biyokütle toplamak için tasarlanmış)
Malzemeleri gerekli:
Masterflex boru
Peristaltik Pompa
3 mikron yüksek hacimli pilili kapsül filtre
0.22 mikron Supor veya polikarbonat 142 mm filtre
142 mm filtre kule (Geotech Çevre Ekipmanları)
10-20 L Damacana (mezun oldu)
Jakuzziler Paketleri
Sıvı nitrojen
RLT tampon (Qiagen)
Beta-mercaptoethanol
Kurulum:
Filtrelerin kullanımı ya da filtre hattı iç bileşenlerin herhangi dokunmadan zaman Temizlik eldiven giyilmelidir. Forseps tercihen etanol ile dolu, temiz, 50 ml konik tüpler, tutulmalıdır. Transkript havuzu büyük değişiklikler önlemek için, filtreleme ve numune alma süreleri mümkün olduğunca kısa tutmak.
Örnekleme için istenilen derinlikte suya hortumun bir ucunu yerleştirin. Ters taraftan, yüksek hacimli 3 mikron filtre takın. 3 mikron, 0.22 mikron filtre kule filtre takın. 0.22 mikron mezun bir damacana içine çıkışı Doğrudan.
Prosedür:
- Durulama sistemi aracılığıyla su birkaç litre (0.22 mikron hiçbir filtre) çalıştırın. Bittiğinde hattan kalan suyu temizlemek için pompa çalışırken, su hortumu çıkarın.
- Forseps kullanarak, 0.22 mikron filtre kulesi ve yakın filtre koyun.
- Suya geri satırın sonuna yerleştirin ve pompa açın. Hava filtreleri, hem temizleyin. Damacana mezuniyet ile filtrelenmiş su hacmi izleyin.
- Istenen birimde filtre, su hattı kaldırmak ve sistemden kalan su tasfiye.
- En kısa sürede filtre kuru olarak, hızlı bir şekilde üst filtre plaka kaldırmak ve filtre katlayın. Bir koşuşturma paketi veya beta-merkaptoetanol RLT tampon 2 ml içeren 15 ml toplama tüpünün içine filtre koyun. Sıvı nitrojen içinde dondurarak oturtun.
Bölüm 2: 0.22 mikron filtre Total RNA ekstraksiyonu
Bu bölüm, üreticinin talimatlarına değişiklikler QIAGEN RNeasy mini kiti kullanan
- RLT tampon 8 (beta merkaptoetanol eklendi) ml, 50 ml konik tüp ekleyerek boncuk yenerek tüpleri hazırlayın. MoBio Powersoil ekstraksiyon kiti RNA boncuk 1-2 ml
- Dondurucu hızla dondurulmuş filtreyi kaldırmak ve koşuşturma paketi tutarak, bir çekiç ile paramparça. Alternatif olarak, filtreler, steril bir jilet kullanarak toplama tüpüne küçük parçalara (15ml) kesilmiş ve hazırlanmış tüp (50ml) tüm ekleyin.
- Hazırlanan tüp (50ml) paramparça filtre ekleyin ve parafilm veya laboratuar bant ile tüp kapağı mühür.
- Vorteks, 50 ml tüpler için bir ek ile bir vortexer kullanarak en yüksek hızda 10 dakika.
- Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 5000 rpm'de 50 ml tüp santrifüjleyin.
- Lizat mümkün olduğu kadar çıkarın ve 15 ml tüp transfer.
- 5000 x g. az 5 dakika için 15 ml tüp Santrifüj
- Transfer yeni bir 50 ml tüp supernatant (~ 7 ml).
- Lizat% 100 EtOH 1 hacmi (~ 7 ml) ekleyin.
- 50 ml tüp sığar 30 ml şırınga kullanarak, bir 18-21 gauge iğne ile lizat çizmek ve ~ 5 kez dışarı geçmek. Bittiğinde, şırınga içinde lizat bırakın.
- Ekstraksiyon QIAGEN RNeasy Mini kiti ile devam edin. Lizat hacmi (~ 14ml) orijinal kiti protokolü (0.7 ml) daha yüksek, çünkü burada bir vakum manifoldu kullanmak yararlı olur. Alternatif olarak, lizat, sütun 700 ul ekleyerek santrifüj ve tüm lizat sütun uygulanana kadar tekrar çekilir olabilir.
- Bir spin kolon vakum manifoldunun üzerine yerleştirin ve örnek 700 ul geçerlidir. Lizat aşağı çekmek için manifoldu vakum basınç uygulayın. Tüm sütun uygulanana kadar şırınga lizat eklemeye devam edin.
- 700 ul tampon RW1 sütun ekleyin ve vakum basıncı ile aşağı çekmek.
- 500 ul tampon RPE sütun ekleyin ve vakum basıncı ile aşağı çekmek.
- 500 ul tampon RPE ikinci bir kısım sütun ekleyin ve vakum basıncı ile aşağı çekmek.
- Yıkama tamamen çekilir edildikten sonra, bir toplama tüpüne sütun ve yerde çıkarın.
- 1 dakika için 8000 x g. tüp Santrifüj Flow-through atın.
- EtOH kurtulmak xg 8000 ek bir 2 dakika santrifüjleyin.
- Yeni bir 2 ml col sütun aktarıntoplama noktasına tüp. Pipet 35 ul membran doğrudan RNaz içermeyen su. Tüp kapatılır ve 1 dakika boyunca bekletin.
- 8000 x g. az 2 dakika santrifüj
- Spektrofotometrik toplam RNA sayısal olarak.
Bölüm 3. DNAz tedavi
Bu bölüm, üreticinin talimatlarına göre Ambion TURBO DNA serbest kiti kullanıyor
- RNA örnek 3.4 ul 10x DNaz I Tampon ve 1μl rDNase I ekleyin.
- 30 dakika 37 º C'de inkübe edin.
- Vortex 3.4 inaktivasyon reaktif ul örnek DNaz inaktivasyonu Reaktif ve eklemek.
- Ara sıra karıştırma ile oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 1,5 dakika 10.000 xg'de Spin, daha sonra yeni bir tüp süpernatantı aktarın. Taze tüpe inaktivasyon reaktif tanıtan kaçının.
Bölüm 4. İlk rRNA kaldırma
Bu bölüm, üreticinin talimatlarına göre Epicentre mRNA SADECE kiti kullanan
- Hafifçe karıştırın ve kısaca kullanmak için önce mRNA SADECE 10X Reaksiyon Tamponu santrifüj.
- Steril (RNaz-free) 0.5 ml tüp, buz üzerinde aşağıdaki reaksiyon bileşenleri bir araya getirir:
mRNA SADECE 10X Reaksiyon Tamponu 2.0 ul RNaz İnhibitör 0.5 ul Total RNA Örnek (200 ng-10 mg) Ul 16.5 Terminator eksonükleaz (1 Adet) 1.0 ul Toplam hacim 20.0 ul - Tepki inkübe 30 ° C bir termalcycler 60 dk (ısıtmalı kapak ile) veya su banyosu.
- Fenol / EtOH yağış reaksiyon sonlandıralım:
- Toplam hacmi (= 180 ul) 200 ul RNaz ücretsiz H2O ekleyin.
- Kloroform Özü: Fenol: (1:1), 1 hacim (= 200 ul). Vortex şiddetle ve 2-5 dakika sonra en yüksek hızda dönerler.
- Sulu faz (~ 200 ul) çıkarın.
- 3 M sodyum asetat (20 ul) + 2.5% 100 buz soğuk EtOH hacmi (500 ul) 0.1 hacimleri ekle
- -80 º C'de 15-30 dakika inkübe edin.
- 4 ° C, en yüksek hız, 30 dk Pelet; örnek daha sonra aspirasyonu (pelet görmek zor olabilir) için tüp pozisyonu unutmayın.
- Aspiratör veya pipet ile süpernatant atın.
- 500 ul% 70 buz EtOH ile yıkayınız. Vorteks tarafından süspanse edin.
- En yüksek hızda 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatant atın.
- Tüp yine en yüksek hızda 10 dakika kalan sıvı santrifüjleyin.
- Dikkatli bir şekilde sıvı aspire ve pelet başlık altında yaklaşık 10 dakika süreyle açık bırakarak tamamen kuru.
- 15-20 ul RNaz ücretsiz H2O yeniden süspanse (MICROBExpress maksimum giriş hacminin 15 ul), oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
- Bioanalyzer veya Experion bu aşamada mRNA rRNA kirlenme ve kalite kontrol etmek için kullanın.
- Bu durum potansiyel bir durak noktası. RNA -80 º C depoda saklanabilir.
Bölüm 5. İkinci rRNA kaldırma
Bu bölüm, üreticinin talimatlarına göre Ambion MICROBEnrich ve MICROBExpress kitleri kullanıyor . Her iki kitleri ökaryotik verimlilik (MICROBEnrich) ve prokaryotik (MICROBExpress) rRNA kaldırma artırmak için birden fazla kez kullanılabilir . Toplam RNA giriş 2-10 mg arasında olmalıdır. RNA hacmi en az 15 ul olmalıdır. Bu nedenle, ideal bir giriş> 150 ng / ml. -
MICROBEnrich
- Pipet 300 ul Cilt tampon 1.5ml bir tüpe
- 30μl ve hafifçe vorteks maksimum hacmi 5-100 mg total RNA ekle
- Cilt tamponunda 5 mg RNA Yakalama Oligo Mix 2 ul ekleyin. Tüp hafifçe dokunun ve kısaca karışımı aşağı doğru döndürün.
- 10 dakika denatüre karışımı 70 ° C
- 37 ° C'de 1 saat süreyle karışımı Tavlama. Bu inkübasyon sırasında boncuk hazırlayın.
- Oligo MagBeads (genellikle 25 ul) kez nükleaz ücretsiz su yıkama ve Cilt tampon kez yıkar arasında manyetik bir stand boncuk yakalama hazırlayın. Boncuk buz üzerinde saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığında 5 dakika kadar ısıtın.
- Yıkama solüsyon ısı 37 ° C ısıtma bloğu.
- RNA Ekle / yıkanmış Oligo MagBeads Oligo Mix yakalamak. Çok tüp hafifçe karıştırın ve kısaca döndürün.
- 37 ° karışımı ° C 'de 15 dakika inkübe edin.
- Tüp manyetik stand koyun ve yaklaşık 3 dakika bekleyin.
- Aspire süpernatant (mRNA içerir) ve buz üzerinde bir toplama tüpüne aktarın.
- Yakalanan boncuk için, önceden ısıtılmış Yıkama çözüm 100 ul ekleyin. Kısaca yavaşça girdap boncuk. Boncuk Yakalama ve supernatant kurtarmak. Buz toplama tüpü mRNA (~ 450 ul sonu hacmi) Havuz süpernatant.
- Buz üzerinde toplama tüpü yerleştirin. Ikinci turu yapılacak ise) 5.3 bölümüne gidin ve işlemi tekrarlayın. Alternatif olarak, MICROBExpress kiti (5.18, aşağıya bakınız) hemen geçiş yapın.
- İkinci OlioBeads ikinci kez kullanılabilir. Yenileme Çözüm 1 1 saat 2 cilt (genellikle 50 ul) ile onları kuluçka Oligobeads yenileyin. Manyetik bir stand boncuk yakalayın. 2 cilt Yenileme Çözüm 2 (genellikle 50 ul) ile iki kez yıkayın ve Tekrar Süspansiyonu çözüm orijinal hacmi (genellikle 25 ul) onları tekrar süspansiyon haline getirin.
MICROBExpress - Pipet 200 ul Cilt tampon 1.5ml bir tüp içine.
- 15μl ve hafifçe vorteks maksimum hacmi 2-10 mg total RNA ekleyin.
- Cilt tampon RNA Yakalama Oligo Mix 4 ul ekleyin. Tüp hafifçe dokunun ve kısaca karışımı aşağı doğru döndürün.
- Denatüre karışımı 70 ° C 10 dak.
- 15 dakika inkübasyon sırasında boncuk hazırlayın 37 ° C karışımı Tavlama.
- Nükleaz serbest su bir kez yıkanarak Oligo MagBeads hazırlayın yıkar arasında manyetik bir stand boncuk yakalayan 50 ul Cilt tampon iki yıkar. 37 50 ul Cilt tampon ve inkübe yeniden süspanse boncuk ° C kullanana kadar.
- Yıkama çözüm Isı 37 ° C ısıtma bloğu
- Vortex hafifçe Oligo MagBeads yıkanır. RNA / Oligo Mix yakalamak için 50 ul Oligo MagBeads ekleyin. Çok tüp hafifçe karıştırın ve kısaca döndürün.
- 15 dakika için 37 ° C 'karışımı inkübe edin.
- Tüp manyetik stand koyun ve yaklaşık 3 dakika bekleyin.
- Aspire süpernatant (mRNA içerir) ve buz üzerinde bir toplama tüpüne aktarın.
- Yakalanan boncuk için, önceden ısıtılmış Yıkama çözüm 100 ul ekleyin. Kısaca yavaşça girdap boncuk.
- Boncuk Yakalama ve supernatant kurtarmak. Buz toplama tüpü mRNA (~ 350 ul sonu hacmi) Havuz süpernatant.
- Ikinci turu yapılacak ise, bölüm 5.18) geri dönün ve işlemi tekrarlayın. Alternatif olarak, yağış mRNA hemen geçin.
- Çökelme ve tekrar süspansiyon mRNA:
- Için toplanmış mRNA 35 ul Sodyum Asetat ekleyin ve 7 ul Glikojen ekleyin.
- 1175 ul buz gibi% 100 EtOH ve iyice vorteks ekleyin.
- -20 ° C'de en az 1s çöktürün.
- 10.000 x g. az 30 dakika santrifüj
- Dikkatlice süzün ve supernatant atın.
- 750 ul buz% 70 EtOH ve vorteks kısaca ekleyin.
- 10.000 xg'de 5 dakika santrifüj ve supernatant atın.
- % 70 ikinci EtOH yıkama yapın.
- Kısaca atarak sonra tüp% 70 ikinci EtOH yıkama respin.
- Herhangi bir süpernatant bir pipet yardımıyla dikkatlice çıkarın.
- Hava 5 dakika pelet kurulayın.
- 25 ul TE tampon veya RNaz ücretsiz su RNA pelletini tekrar
- Oda sıcaklığında 15 dakika RNA rehidrate.
- Şiddetle gerekirse vorteksleyin örnek.
- Gerekirse manyetik stand ~ 3min kalan boncuklar, yer tüp kaldırmak ve yeni RNaz ücretsiz tüp zenginleştirilmiş mRNA taşımak.
- Bioanalyzer veya Experion bu aşamada mRNA rRNA kirlenme ve kalite kontrol etmek için kullanın.
- Bu durum potansiyel bir durak noktası. RNA -80 º C depoda saklanabilir.
Bölüm 6: mRNA Amplifikasyon
Bu bölüm, üreticinin talimatlarına göre Ambion MessageAmp II-Bakteri kiti kullanıyor . Master çevrimiçi karışımları hesaplayın www.ambion.com/tools/ma2bact .
- Şablonu RNA Polyadenylation:
- Toplam RNA 1000 ng (genellikle 100-500 ng) veya steril bir RNaz ücretsiz mikrofuge'de tüp içine kadar 500 ng mRNA (genellikle 10 ng-200 ng) kadar yerleştirin. Ilk tampon 6.5 örnek ul ve hiçbir RNaz ücretsiz su kullanın.
- Tercihen bir termalcycler, 70 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Tüpün dibinde örnek toplamak için 70 ° C inkübatör ve santrifüj kısa bir süre (~ 5 s) RNA örnekleri çıkarın. 3 dakika buz karışımı yerleştirin.
- Hesaplama tablosunun gösterildiği sırada oda sıcaklığında bir nükleaz ücretsiz tüp Polyadenylation Master Mix hazırlayın. ≤ 5% tutarı düşmek pipetleme hata karşılamak için deney de dahil olmak üzere tüm örnekler için yeterli master mix, birleştirin. Enzim inaktive olmadan homojen bir karışım yapmak için yavaşça girdap, sonra tüpün alt kısmında ana karışımı toplamak için ~ 5 s için santrifüj.
- Her RNA örnek Polyadenylation Master Mix 3.5 ul transfer nazik vorteks ile iyice karıştırın ve tepki toplamak için hızlı bir spin ile takip edin.
- 37 ° C inkübatör örnekleri yerleştirin. 15 dakika boyunca inkübe reaksiyonlar37 ° C, daha sonra kısaca tüpün alt kısmında reaksiyon toplamak için santrifüj.
- 37 ° C de inkübasyon sonra reaksiyonlar, buz koyun ve hemen ters transkripsiyon devam.
- İlk Strand cDNA sentez Ters Transkripsiyon:
- Hesaplama tablosunun gösterildiği sırada oda sıcaklığında nükleaz ücretsiz tüp Ters Transkripsiyon Master Mix hazırlayın. ≤ 5% tutarı düşmek pipetleme hata karşılamak için deney de dahil olmak üzere tüm örnekler için yeterli master mix, birleştirin. Enzim inaktive olmadan homojen bir karışım yapmak için yavaşça girdap, sonra tüpün alt kısmında ana karışımı toplamak için ~ 5 s için santrifüj.
- Nazik vorteks ile iyice karıştırın ve tepki toplamak için hızlı bir dönüş ile takip, her numune için Ters Transkripsiyon Master Mix 10 ul aktarın.
- 42 ° C inkübatör örnekleri yerleştirin. 2 saat inkübe 42 ° C, daha sonra tüpün alt kısmında tepki toplamak için kısaca santrifüj (~ 5 s).
- Tüpler buz üzerine yerleştirin ve hemen ikinci iplikçik cDNA sentezi devam edin.
- İkinci Strand cDNA Sentezi:
- Buz, hesaplama tablosunda gösterilen sıraya göre aşağıdaki reaktifler karıştırılarak İkinci Strand Master Mix hazırlamak. ≤ 5% tutarı düşmek pipetleme hata karşılamak için deney de dahil olmak üzere tüm örnekler için yeterli master mix, birleştirin. Enzimleri inaktive olmadan homojen bir karışım yapmak için yavaşça girdap, sonra tüpün alt kısmında ana karışımı toplamak için ~ 5 s için santrifüj.
- Nazik vorteks ile iyice karıştırın ve tepki toplamak için hızlı bir dönüş ile takip İkinci Strand Master Mix, her numune için 80 ul aktarın.
- 16 ° C termal cycler örnekleri yerleştirin. 16 ° C arası sıcaklıklarda reaksiyonlar> 16 ° C Arna verim uzlaşma olacak tabi, çünkü reaksiyon tüpleri eklemeden önce termal cycler blok soğutmak için önemlidir.
- 2 saat inkübe 16 ° C - 16 ° C termal cycler inkübe 2 saat. Kapak sıcaklığı 16 ° C blok sıcaklığı maç ayarlanır mümkün değilse, kapalı ısıtmalı kapak reaksiyonlar kapağı, ya da kapağı açılamaz eğer off-tüpler kapsamaz.
- Buz kısaca reaksiyonlar yerleştirin. Reaksiyonlar için buz üzerinde uzun süre bırakmayın.
- 5.4) cDNA Arıtma:
- Tüm bu arıtma işlemi santrüfüj oda sıcaklığında 10.000 xg (genelde ~ 10.000 rpm) yapılmalıdır. Yağış cDNA Cilt Tampon kullanmadan önce kontrol edin. Bir çökelti görünmüyorsa, 37 ° C 10 dakika kadar çözüm ısınma ve şiddetle vorteks çözülür. Kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun.
- CDNA arıtma başlamadan önce, 50 ° C, en az 10 dakika ön ısıtma Nükleazlar-Su 10 ml şişe.
- Her bir örnek için 250 ul cDNA Bağlama Buffer ekleyin ve hafifçe karıştırın iyice karıştırın.
- ~ 1 dakika 10.000 g de santrifüj, veya karışımı filtresi aracılığıyla kadar. Flow-through atın ve yıkama tüpü cDNA Filtre Kartuşu değiştirin.
- Her cDNA Filtre Kartuşu 500 ul Yıkama Tamponu uygulayın. ~ 1 dakika 10.000 g de santrifüj, veya tüm Yıkama Tampon filtresi aracılığıyla kadar. Flow-through atın ve EtOH eser miktarda kaldırmak için ek bir dakika için cDNA Filtre Kartuşu spin.
- CDNA Elüsyon Tüp cDNA Filtre Kartuşu aktarın. 20 ul 50 ° C Nükleazlar-Su ile cDNA Zehir. CDNA yürütülmesi için 50 Nükleazlar-Su ° C kullanmak önemlidir. Soğuk su cDNA salınımlı daha az, verimli ve sıcak su (> 55 ° C) azaltılmış Arna verim neden olabilir.
- CDNA Filtresi Kartuş filtre merkezine 20 ul, önceden ısıtılmış (50 ° C) Nükleazlar-Su geçerlidir. 2 dakika süreyle oda sıcaklığında bırakın ve ardından 10,000 xg'de ~ 1.5 dakika santrifüj kadar veya tüm Nükleazlar ücretsiz su filtresi aracılığıyla. Çift telli cDNA Zehir (~ 16 ul) olacaktır.
- Istenirse saflaştırılmış cDNA -80 ° C'de bu noktada geceleme saklanabilir.
- In Vitro Transkripsiyon Arna sentez
- Üniform sıcaklık nedeniyle bir melezleşme fırın kullanılması önerilir ve bu yoğunlaşma tüpler içinde olmadığını, son derece önemlidir çünkü. Önemle Arna verimi en üst düzeye çıkarmak için 14 saat IVT tepki inkübasyon önerilir. Arna verimi en yüksek, 40 ul son reaksiyon hacmi IVT yürütmek.
- Oda sıcaklığında, hesaplama tablosu ekranda listelenen sipariş reaktifleri ekleyerek bir IVT Master Mix monte edin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız. Col Santrifüj kısa bir süre (~ 5 s)buz tüpü ve yer altındaki IVT Master Mix bilirsiniz.
- Hesaplama tablosunun yönergeleri izleyerek her örnek Transferi IVT Master Mix, nazik bir vorteks ile iyice karıştırın, tepki toplamak için kısa süreli santrifüj ve tüpler 37 ° C inkübatör.
- 37 ° 14 saat inkübe ° C
- Inkübasyondan sonra, son hacmi 100 ul getirmek için her Arna örnek Nükleazlar-su ekleyin. Nazik vorteks ile iyice karıştırın. Arna arıtma adımı hemen yapılabilir eğer buz üzerinde seyreltilmiş Arna yerleştirin. Alternatif olarak, Arna -20 ° C'de saklanabilir
- Arna Arıtma
- Bu bölümde tüm santrüfüj 10.000 xg (genelde ~ 10.000 rpm) yapılmalıdır.
- Başlamadan önce Arna arıtma ön ısıtma Nükleazlar-Su 10 ml şişe ile 55 ° C> 10 dk.
- Her Arna örnek Arna Bağlama Buffer 350 ul ekleyin. Nazik vorteks ile iyice karıştırın ve hemen bir sonraki adıma geçin.
- 3 kez aşağı karışım pipetleme ve 250 her Arna örnek ACS sınıf% 100 EtOH, ul ve karışımı ekleyin. Karıştırmak için vorteks etmeyin. EtOH her numune içine karışık olarak bir sonraki adıma en kısa sürede hemen geçin.
- Bir Arna Toplama Tüp bir Arna Filtre Kartuşu yerleştirin ve üzerine her örnek karışımı Arna Filtresi Kartuş filtre merkezi pipetle.
- Santrifüj ~ 1 dakika 10.000 x g. Karışımı filtre geçti kadar devam edin. Flow-through atın ve Arna Arna Toplama Tüp Filtre Kartuşu değiştirin.
- 650 ul Yıkama Tampon her Arna Filtre Kartuşu uygulayın. ~ 1 dakika 10.000 xg'de santrifüj, veya tüm yıkama solüsyonu filtresi aracılığıyla kadar. Flow-through atın ve bir ek ~ 1 dk EtOH eser miktarda kaldırmak için Arna Filtre Kartuşu döndürün.
- Taze Arna Toplama Tüp Transfer Filtre Kartuşu (ler). Filtre merkezine, 50-60 için önceden ısıtılmış 75 ul Nükleazlar-Su ° C ekleyin 50-60 ° C inkübatör Nükleazlar-Su kabı değiştirin.
- 2 dakika süreyle oda sıcaklığında bırakın ve ardından 10,000 xg'de ~ 1.5 dakika santrifüj kadar veya çözüm filtre ile.
- Nükleazlar serbest Su ikinci bir 75 ul elüsyon tekrarlayın. Arna Arna ~ 150 ul Nükleazlar serbest Su Toplama Tüp olacaktır. Arna Filtre Kartuşu atın.
- Mağaza Arna az -80 ° C ve donma-çözülme tekrarlanan en aza indirir.
Bölüm 7: cDNA sentezi
Bu bölüm, üreticinin talimatlarına göre hafif bir değişiklik ile Promega Evrensel RiboClone cDNA Sentezi Sistemi kiti kullanır. Standart giriş 2 mg, 454 sıralaması için, 10 mg ile başlamak tavsiye edilir. Konsantrasyonu çok düşükse, Arna EtOH yağış veya vakum konsantrasyonu ya da konsantre olabilir. 10 mg RNA girdi olarak kullanılması durumunda, daha sonra her parti farklı birimler gelir 5The enzimlerin bir faktör tarafından gönderilen tüm reaktifler büyütmek, böylece miktarlar her zaman hesaplanacak var .
- İlk Strand Sentezi:
- 0,5 ml PCR tüpü alın ve ekleyin:
mRNA örnek 2 mg (veya 10 mg 454 sıralama için kullanılan) Rastgele Hex Primer (0.5 mg / ml) 2 ul Nükleazlar ücretsiz su hacmi 0 (ya da olmayan numune seyreltik oldu) Toplam Hacim 15 ul - Reaksiyon 10 dakika süreyle 70 ° C ısıtın. 5 dakika buz tüpü Chill ve tüpün alt kısmında çözüm toplamak için kısaca döndürün.
- Gösterildiği sırada aşağıdaki bileşenleri ekleyin:
Örnek 15 ul İlk Strand 5X Tampon 5 ul RNasin Ribonükleaz İnhibitörü 40 u Ul 1 ... 40 u / ml Toplam Hacim 21 ul - Mix reaction ve spin kısaca. Isı karışım 37 ° C 5 dk.
- Aşağıdaki bileşenleri ekleyin:
1. adımı örnek 21.0 ul Sodyum Pirofosfat, 40 mM 2.5 ul AMV Ters Trancriptase 30 u Ul 1.5 ... 22 u / ml Nükleazlar ücretsiz su 0.0 ul Toplam Hacim 25.0 ul - 1 saat 37 ° C hibridizasyon fırında reaksiyon inkübe edin.
- Buz üzerinde kuluçka yeri reaksiyonu sonra.
- 0,5 ml PCR tüpü alın ve ekleyin:
- İkinci Strand Sentez:
- Aşağıdaki bileşenleri ekleyin:
İlk Strand tepki 25.0 ul İkinci Strand 2.5X Tampon 40.0 ul BSA, 1 mg / ml 5.0 ul DNA Polimeraz I 23 u 3.0 ul RNaz H 0.8 u Ul 0.5 ... 1.5 U / ml Nükleazlar ücretsiz su Ul 26.5 Toplam Hacim 100.0 ul - Tüp hafifçe vurarak hafifçe karıştırın. 14 reaksiyonlar inkübe ° C 2 saat süreyle bir termalcycler. 14 ° C reaksiyon tüpleri eklemeden önce PCR soğutmak için önemlidir. Reaksiyon 14 ° C önce veya reaksiyon sırasında yukarıda olsun izin vermeyin.
- Reaksiyon sonlandırmak için, reaksiyon mikrogram giriş mRNA başına 2 adet T4 DNA Polimeraz ekleyin. 14 yaşında 10 dakika boyunca inkübe ° C
- Buz üzerinde 500 mM EDTA tedavi DEPC yeri ve 10 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- CDNA üreticinin talimatlarına göre bir EtOH yağış veya Promega Sihirbazı DNA Temizleme Sistemi kullanarak temizleyin. Mağaza numuneler -80 ° C CDNA Çift iplikli doğrudan bu noktada pyrosequenced olabilir.
- Aşağıdaki bileşenleri ekleyin:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen ekspresyonu doğal mikrobiyal topluluklar tarafından soruşturma mikroorganizmaların ekolojik rolleri ve fonksiyonları keşfetmek için bir araç olarak son yıllarda yaygın hale gelmiştir. Deniz mikroorganizmaların tespiti, ölçme ve karakterizasyonu ile birlikte kullanıldığında, gen ekspresyon analizi, doğal mikrobiyal topluluklar fonksiyonu filogeni bağlantı kullanılabilir. Fonksiyonel gen ekspresyonu hedefleyen için pek çok teknikler dizisi bilinen genler için tasarlanmış spesifik problar veya primer setleri güveniyor. Buna karşılık, çevre transkriptomik gen ekspresyonu mevcut verilerin sırasını ve aktif olarak ifade edilen bu genlerin tercih getirilen kısıtlamalar olmadan incelemek için kullanılabilir. Bu nedenle ortamda mRNA havuz analizi, temel faaliyetleri ve aracılık organizmalar arasındaki bağlantıları keşfetmek en etkili yollarından biri sağlayabilir.
Çevre transkriptomik ilk uygulama, ilk kez doğal bir ekosistem 3 bakteriyel mRNA havuzu kompozisyon ve dinamikleri sağladı . Bir kıyı tuzlaların (Sapelo Island, GA) ve alkalin, hypersaline göl (Mono Lake CA) her iki transkript kütüphanelerde genlerin analizi biyojeokimyasal ilgi gen dizileri, chitinases ve kükürt gibi çeşitli fonksiyonel genlerin çevresel türevleri de dahil olmak üzere ortaya çıkardı bu ekosistemlerin her biri için özel oksidasyon genler. Ayrıca, olası bir karbon ve azot kaynağı olarak vasküler bitki ve alg kökenli poliaminler mikrobiyal bozulması gibi roman, beklenmedik süreçler için kanıt sağlamıştır.
Çevre örneklerinden RNA ile çalışma ve teknolojiler geliştirmek sıralama ile ilgili kısıtlamaları azaltmak için moleküler teknikler geliştikçe, çevre transkriptomik daha yaygın olarak kullanılan bir teknik haline gelmiştir. Yüzeyinde okyanus 6 mikroorganizmaların işlevleri incelemek ve aynı ortamda 7 içinde gece ve gündüz fonksiyonel gen ekspresyonu karşılaştırmak için kullanılır olmuştur. Çevre transkriptomik da belirli çevresel faktörler ve Biyojeokimya mikrobiyal yanıtları daha iyi bir anlayış kazanmak için kullanılabilir. Bu tekniği kullanarak keşfetti Genler veya fonksiyonlar mikroarray'ler ve kantitatif PCR gibi gen ekspresyonu kantitatif çalışmalar için hedef olarak hizmet verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansman Gordon ve Betty Moore Vakfı hibe ve Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-0702125 tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega Corp. | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
