Summary
Die erhöhten Plus-Labyrinth-Test ist eine der am häufigsten verwendeten Tests zur Messung von Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen. Hier präsentieren wir einen Film zeigen, die Modalitäten für die Durchführung des Tests.
Abstract
Obwohl die Maus-Genom ist nun vollständig sequenziert sind die Funktionen der meisten Gene im Gehirn exprimiert nicht bekannt. Der Einfluss eines bestimmten Gens zu einem bestimmten Verhalten durch Verhaltensanalyse von mutierten Mäusen bestimmt werden. Wenn ein Ziel-Gen im Gehirn exprimiert wird, könnte Verhaltensphänotyp des mutierten Mäusen verdeutlichen die genetischen Mechanismen der normalen Verhaltensweisen. Die erhöhten Plus-Labyrinth-Test ist eine der am häufigsten verwendeten Tests zur Messung von Angst-ähnliches Verhalten. Der Test basiert auf der natürlichen Abneigung der Mäuse für einen offenen und erhöhten Flächen, sowie auf ihre natürliche spontane Erkundungsverhalten in neue Umgebungen. Der Apparat besteht aus offenen Armen und geschlossenen Arme, in der Mitte senkrecht zueinander gekreuzt und einem mittleren Bereich. Mäuse haben Zugang zu allen von den Armen gegeben und dürfen sich frei bewegen zwischen ihnen. Die Zahl der Eintritte in die offenen Arme und die Zeit in den offenen Armen verbracht werden als Indizes von Freiflächen-induzierte Angst bei Mäusen verwendet. Leider machen die verfahrensrechtlichen Unterschiede zwischen den Labors gibt es schwierig zu kopieren und vergleichen Sie die Ergebnisse von Labor zu Labor. Hier präsentieren wir eine ausführliche Film demonstriert unser Protokoll für den erhöhten Plus-Labyrinth-Test. In unserem Labor haben wir mehr als 90 Stämme von mutierten Mäusen unter Verwendung des Protokolls in dem Film gezeigt, beurteilt. Diese Daten werden als Teil einer öffentlichen Datenbank, die wir jetzt bauen werden offen gelegt werden. Visualisierung des Protokolls wird die Förderung eines besseren Verständnisses der Details des gesamten experimentellen Verfahren, ermöglicht eine Standardisierung der Protokolle in verschiedenen Labors und Vergleiche der Verhaltens-Phänotypen der verschiedenen Stämme von mutierten Mäusen beurteilten mit Hilfe dieses Tests.
Protocol
Protokoll
- Die Geräte für die erhöhten Plus-Labyrinth-Test verwendet wird in der Konfiguration der a + und besteht aus zwei offenen Armen (25 x 5 x 0,5 cm) einander gegenüber und senkrecht zu zwei geschlossenen Armen (25 x 5 x 16 cm) mit einem Zentrum Plattform (5 x 5 x 0,5 cm). Die offenen Armen haben einen sehr kleinen (0,5 cm) Wand, um die Anzahl der Stürze zu verringern, während die geschlossenen Arme eine hohe (16 cm) Wand haben, um den Arm legen. Die gesamte Apparatur wird 50 cm über dem Boden (Ohara & Co., Tokyo) und ist in eine leere Rundbecken (100 cm Durchmesser, 35 cm hoch; normalerweise für den Morris Water Maze Aufgabe verwendet) platziert, um die Mäuse, oder Sturz zu schützen Versuch, während des Experiments zu entkommen. Der Apparat besteht aus Kunststoff. Die Plattform ist weiß und die Wände sind transparent. Es ist eine Variation in Materialien und Farben der Vorrichtung der erhöhten Plus-Labyrinth.
- Mäuse mit einer 12-h Licht / Dunkel-Zyklus (Licht an um 07.00 Uhr) untergebracht sind, wie zuvor beschrieben (Takao & Miyakawa, 2006a). Behavioral Tests erfolgt zwischen 9:00 Uhr durchgeführt und 06.00 Uhr. Alle experimentellen Mäuse sind, um das Verhalten Testraum 30 min vor Beginn der ersten Studie, die an die Bedingung des Verhaltens Testraum gewöhnen übertragen. Die Reihenfolge der Versuche wird über Genotypen gegenüber. Es gibt zwei Zwecke der Testversuch mit einer Praxis Tier. Eines ist sicher, dass alles in Ordnung mit der Aufnahme ist. Ein weiterer Grund ist die Testbedingungen so einheitlich wie möglich zu halten. Das heißt, würde die erste Maus in der gesamten Sitzung etwas anders Zustand mit anderen (dh ohne vorherige Geräusche, die durch Tests Operationen und kein Geruch Hinweise aus früheren Studien gemacht) Erfahrung, ohne eine solche Praxis-Studie. Die Tiere sind nach den Richtlinien der Animal Research Committee der Kyoto University gepflegt.
- Das Verhalten Testraum (170 x 210 x 200 cm, Ohara & Co., Tokyo) ist schallisoliert und die Helligkeit liegt bei 100 lux gehalten. Eine Maus ist im mittleren Bereich des Labyrinths mit dem Kopf in Richtung einer geschlossenen Arm gerichtet sein muß. Das Elevated Plus Maze Test erfasst mit einer Videokamera an einen Computer angeschlossen, die von einem Remote-Gerät gesteuert wird. Die Anzahl der Einträge (ein Eintrag als das Zentrum der Masse der Maus in den Arm definiert) in jedem Arm und die Zeit in den offenen Armen verbracht werden aufgezeichnet und diese Messungen dienen als Index der Angst-ähnliches Verhalten.
- Mäuse sind erlaubt, sich frei bewegen das Labyrinth für 10 min. Jede Maus erhält eine Studie in unserem Test-Batterie. Die Anwendung zur Erfassung und Analyse der Verhaltensdaten (Image EP) verwendet wird, auf den öffentlichen Bereich Image J-Programm (entwickelt von Wayne Rasband am National Institute of Mental Health und verfügbar auf http://rsb.info.nih.gov/ ij / ), die von Tsuyoshi Miyakawa (verfügbar über O'Hara & Co., Tokyo, Japan) geändert wurde.
- Die Strecke, die Anzahl der Einträge in jedem Arm, verbrachte die Zeit in jedem Arm, und der prozentuale Anteil der Eintritte in die offenen Arme sind von der Bild-EP-Programm berechnet.
- Nach jedem Versuch, alle Armen und im mittleren Bereich mit super unterchlorige Wasser, dass eine effiziente Geruchsbeseitigung Agent ist und relativ schwache Geruch von sich selbst im Vergleich zu anderen Reinigungslösungen, um eine Vorspannung auf Geruchssinn basiert verhindern gereinigt. So können wir die Tests unter kontrollierten Bedingungen bezüglich Geruchssinn leiten.
Discussion
Obwohl die Maus-Genom sequenziert wurde, sind die Funktionen der meisten Gene nicht bekannt. Gentechnischer Methoden erlauben das Löschen oder sonstige Manipulation eines bestimmten Gens in Mäusen (Austin et al, 2004;.. Aiba et al, 2007). Der Einfluss eines bestimmten Gens zu einem bestimmten Verhalten kann dann durch die Durchführung Verhaltensanalysen des mutierten Mäusen (.; Takao et al, 2007 Takao und Miyakawa, 2006b) ermittelt werden.
Die erhöhten Plus-Labyrinth-Test ist einer der beliebtesten Tests aller derzeit verfügbaren Tiermodellen der Angst (Rodgers und Dalvi, 1997; Crawley, 2007). Dieser Test für Angst-ähnliches Verhalten hat für das Screening und Phänotypisierung transgener und Knockout-Mäusen (Crawley, 1999) und für die Wirkstoffentwicklung eingesetzt (. Hogg et al 1996; Crawley, 2007). Die erhöhten Plus-Labyrinth-Test hat eine starke prognostische Validität für das Screening von Anxiolytika (Rodgers und Dalvi, 1997; Mechiel Korte und De Boer, 2003; Crawley, 2007); Anxiolytika gezielt zu erhöhen, und anxiogenen Medikamente gezielt zu verringern, die Anzahl der Einträge in die offenen Arme und die Zeit dort verbracht. Die Gesamtzahl der Einträge Partitur und Gesamtstrecke werden als ein brauchbarer Index der allgemeinen Aktivität. Insgesamt Einträge der Gäste ist auch ein Index der Angst, und die Prozentsätze der Einträge und die Uhrzeit in jedem Arm verbracht bilden den Index der primären Angst (Rodgers und Dalvi, 1997, Mechiel Korte und De Boer, 2003). Die offenen und geschlossenen Arme sind als die gleichen explorative Laufwerk hervorrufen, daher Vermeidung des offenen Armen wird als eine Folge der Induktion von höheren Ebenen der Angst (Rodgers und Dalvi, 1997). Es wird vermutet, dass die Abneigung von Mäusen um die offenen Arme des Labyrinths zu entdecken, ist von der Angst vor offenen und erhöhten Räumen verursacht.
Im Jahr 1984 berichteten Handley und Mithani auf Vorarbeiten mit der erhöhten X (plus) Labyrinth-Test beschrieben. Die ursprüngliche Prüfgerät wurde 70 cm über dem Boden erhoben, und bestand aus zwei geschlossenen und zwei offenen Armen, von denen jede 45 cm lang und 10 cm breite gemessen. In ihrer ersten Studien, berichteten sie das Verhältnis von offen / total arm Einträge (Handley und Mithani, 1984). Anschließend wurden andere Indizes entwickelt, enthalten die Anzahl der Einträge in den geschlossenen und offenen Armen und die Zeit in der geschlossenen und offenen Armen für Ratten (Pellow et al, 1985; Pellow und File, 1986) verbrachte und Mäuse (Lister, 1987) .
Änderungen an den Elevated Plus Maze Test beinhaltet eine Verlängerung sowohl der offenen Armen (50 x 10 cm) und geschlossenen Arme (50 x 10 x 40 cm) mit hohen umgebenden Wände und offenem Dach auf die geschlossenen Arme, und das gesamte Labyrinth wurde erhöht zu einer Höhe von 50 cm (Pellow et al, 1985; Pellow und File, 1986). Derzeit in unserem Labor ist das Elevated Plus Maze Test Apparat in der Form a + konfiguriert, mit zwei offenen Armen (25 x 5 cm, mit einem sehr leichten, 0,5-cm-, Wand-) einander gegenüber und senkrecht zu zwei Manabe et al, 2000;; Miyakawa et al, 2001; Seeger et al, 2004; Morishima et al, 2005 geschlossenen Arme (25 x 5 x 16 cm) und ist 50 cm über dem Boden (Miyakawa et al, 1996 erhöht; Miyamoto et al, 2005; Pfeil et al, 2006; Hattori et al, 2007; Niemann et al, 2007; Sano et al, 2008; Horii et al, 2008; Fukuda et al, 2008; Ikeda et al; 2008). Die Maus ist in der Mitte der + (5 cm x 5 cm) platziert und erlaubt ist, um das Labyrinth frei erkunden. Obwohl 5 min Aufnahme ist üblich, ist das Verhalten für 10 min in unserem Protokoll aufgezeichnet, um die Möglichkeit, den Phänotyp zu erkennen zu erhöhen. Die offenen und geschlossenen angehobenen Armen induzieren ein Explorations-Konflikt (Mechiel Korte und De Boer, 2003; Crawley, 2007).
Die Maßnahmen der erhöhten Plus-Labyrinth-Test werden durch einen Beobachter während des Experiments aufgezeichnet. In unserem Labor wird der Test mit einer Videokamera an einen Computer angeschlossen und die Verhaltensdaten (Image EP) werden erfasst und analysiert mit dem Image EP-Programm aufgenommen. Anzahl der Einträge auf den offenen Armen im Vergleich zur Anzahl der insgesamt Arm-Einträge, und die Zeit auf den offenen Armen gegenüber geschlossenen Armen verbracht, liefern die Maßnahmen der Angst-ähnliches Verhalten.
Wir beurteilen mehr als 90 Stämme von gentechnisch mutierten Mäusen unter Verwendung des Protokolls in dem Film gezeigt und haben eine große Menge von Rohdaten für mehr als 5000 Mäuse (einschließlich Wildtyp-und mutierten Mäusen). In unserem Test-Batterie sind Wildtyp-Geschwister in der Regel als Kontrolle verwendet. Als Hintergrund-Stamm, sind C57BL/6J-Mäuse weit verbreitet. Wir sammelten die Daten von C57BL/6J-Mäuse in den Verhaltenstests. Die Werte aus C57BL/6J-Mäuse in unserer Elevated Plus Maze Test erhalten sind wie folgt (n = 914; bedeuten, SEM); insgesamt zurückgelegte Strecke: 1.547,55 14.27 cm; Dauer der Zeit: 56,49 2,42 s (offenen Armen), 384,02 3,13 s (geschlossenen Arme), 161,90 2,17 s (Labyrinth-Zentrum); verbrachte Verhältnis der Zeit in die offenen Arme: 9.19 0.36%, das Verhältnis der Zeit in der geschlossenen Armen verbracht: 63,82 0,52%; Anzahl der Einträge: 7.64 0.21 (offenen Armen), 24,32 0,28 (geschlossenen Arme);% geöffnet Arm Einträge: 21,9 0,05% geschlossenen Arme Einträge: 78,1 0,05. C57BL/6J-Mäuse verbringen weniger Zeit in offenen Armen als in geschlossenen Arme (p <0,0001, n = 914, paired-t test). Dies deutet darauf hin, dass C57BL/6J-Mäuse um die offenen Arme meiden, und dass die Zeit in die offenen Arme ist ein gültiger Index der Angst-ähnliches Verhalten. Darüber hinaus ist die Reihenfolge der Versuche über Genotypen ausgeglichen, weil der Prozess Anzahl wirkt sich auf die Zeit in den offenen Armen und der Center-Plattform ausgegeben. Das heißt, die Indizes aller zu erhöhen während die 3. und 4. Mäusen im Vergleich zum 1. Mäusen (p = 0,0089, n = 476) (unveröffentlichte Daten). Mit unserem Protokoll, zeigte die Analyse von mehr als 1661 Mäuse, die die Reihenfolge der Mäuse in einem Käfig getestet keinen signifikanten Einfluss auf den offenen Arm Verweildauer (unveröffentlichte Daten). Das heißt, die Leistungen der ersten Mäuse aus dem Käfig genommen nicht wesentlich von denen der zweiten unterscheiden, die dritte oder die letzte Mäusen.
Obwohl die erhöhten Plus-Labyrinth-Test und der Hell / Dunkel-Übergangs-Test sowohl für die Beurteilung der Angst-Verhalten eingesetzt werden, sind die Ergebnisse nicht immer zwischen ihnen (in Übereinstimmung Holmes et al, 2000; Tujimura et al, 2008; Nakajima et al, in press ) Zum Beispiel verbringen Vorderhirn-spezifischen Calcineurin-Knockout-Mäusen eine verminderte Menge an Zeit in das Licht Kammer in der Hell / Dunkel-Übergangs-Test, aber eine erhöhte Menge an Zeit in die offenen Arme in die Elevated Plus Maze Test (Miyakawa et al. , 2003). Factor Analyse unserer Verhaltenstest Batterie anzeigt, dass die erhöhten Plus-Labyrinth-Test und der Hell / Dunkel-Übergangs-Test verschiedene Aspekte von Angst-ähnliches Verhalten, wie hell-Raum-Angst in der Hell / Dunkel-Übergang Test-und Open-Space-Angst-wie beurteilen Verhalten im Freiland testen (Takao und Miyakawa, 2006b; Yamasaki et al, 2006). Dementsprechend sind sowohl die Hell / Dunkel-Übergangs-Test und der erhöhten Plus-Labyrinth-Test in unserem Verhalten Testbatterie beinhaltete.
Crabbe und seine Kollegen berichteten, dass unkontrollierte Variablen und Experimente charakterisieren Mutanten können die Ergebnisse, die spezifisch für ein bestimmtes Labor (Crabbe et al., 1999) sind zu erhalten. Die verfahrensrechtlichen Unterschiede zwischen den Labors gibt es schwierig zu replizieren oder vergleichen Sie die Ergebnisse unter ihnen. Gründung visuelle Dokumentation des Protokolls wird die Förderung eines besseren Verständnisses der experimentellen Verfahren, beurteilt ermöglicht eine Standardisierung der Protokolle über Labors und für Vergleiche des Verhaltens Phänotypen verschiedener Stämme von mutierten Mäusen verwendet mit diesen Tests. Wir zuvor veröffentlichten Film Protokoll der Hell / Dunkel-Übergangs-Test (Takao und Miyakawa, 2006a). Ebenso, Filme von anderen Protokollen, wie für den offenen Feldversuch, der Porsolt Swim Test gezwungen, und Angstkonditionierung Tests, die wir in unserem Verhalten Testbatterie werden derzeit zur Veröffentlichung als zukünftige Video Zeitschriftenartikeln gemacht.
Disclosures
Alle Verfahren wurden durch die Verwendung von Tieren und Pflege Ausschuss der Universität Kyoto gebilligt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von Grants-in-Aid for Scientific Research des japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften (JSPS), Grant-in-Aid vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan, Grants-in- Hilfe von BIRD und CREST der Japan Science and Technology Agency, Grant-in-Aid aus Neuroinformatik Japan Center (NIJC), RIKEN und von Grant-in-Aid for Scientific Research auf Schwerpunktbereiche-Integrative Hirnforschung (Shien) - von MEXT in Japan. Wir danken O'hara & Co. und Mariko Hayashi für ihre Unterstützung bei der Erstellung dieser Film.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated plus maze | Tool | O’hara Co. | (none) |
References
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