Summary
La prova più elevata labirinto è uno dei test più utilizzato per misurare l'ansia comportamento simile nei topi. Qui, vi presentiamo un film che mostra le procedure dettagliate per lo svolgimento del test.
Abstract
Sebbene il genoma del topo è ora completamente sequenziato, le funzioni della maggior parte dei geni espressi nel cervello non sono noti. L'influenza di un dato gene in un comportamento specifico può essere determinato mediante l'analisi del comportamento dei topi mutanti. Se un gene bersaglio è espressa nel cervello, fenotipo comportamentale dei topi mutanti potrebbe chiarire il meccanismo genetico di comportamenti normali. La prova più elevata labirinto è uno dei test più utilizzato per misurare l'ansia comportamento simile. Il test si basa sulla naturale avversione di topi per le aree aperte ed elevato, così come sul loro comportamento naturale, spontaneo esplorative in ambienti romanzo. L'apparato è costituito da braccia aperte e chiuse le braccia, attraversato nel mezzo perpendicolarmente l'uno all'altro, e una zona centrale. I topi hanno accesso a tutte le armi e sono autorizzati a muoversi liberamente tra di loro. Il numero di voci nelle braccia aperte e il tempo trascorso nei bracci aperti sono utilizzati come indici di spazio aperto ansia indotta nei topi. Purtroppo, le differenze procedurali che esistono tra i laboratori rendono difficile da duplicare e confrontare i risultati tra i laboratori. Qui, vi presentiamo un film dettagliato dimostrare il nostro protocollo per la prova più elevata labirinto. Nel nostro laboratorio, abbiamo valutato più di 90 ceppi di topi mutanti utilizzando il protocollo mostrato nel film. Tali dati saranno comunicati come parte di un database pubblico che stiamo costruendo. Visualizzazione del protocollo intende promuovere una migliore comprensione dei dettagli di tutta la procedura sperimentale, che consente per la standardizzazione dei protocolli utilizzati in diversi laboratori e confronti dei fenotipi comportamentali dei vari ceppi di topi mutanti valutata usando questo test.
Protocol
Protocollo
- L'apparecchio utilizzato per la prova più elevata labirinto è nella configurazione di un + e comprende due braccia aperte (25 x 5 x 0,5 cm) di fronte all'altro e da due bracci perpendicolari chiuso (25 x 5 x 16 cm) con un centro piattaforma (5 x 5 x 0,5 cm). Le braccia aperte sono una piccolissima (0,5 cm) a parete per diminuire il numero di cadute, mentre le braccia chiuse hanno una alta (16 cm) a parete per racchiudere il braccio. L'intero apparato è di 50 cm sopra il pavimento (Ohara & Co., Tokyo) e si trova in un serbatoio vuoto circolare (100 cm di diametro, 35 cm di altezza, normalmente utilizzati per l'attività di Morris water maze) per proteggere i topi che cadono o tentativo di fuga durante l'esperimento. L'apparecchio è realizzato in materiali plastici. La piattaforma è bianco e le pareti sono trasparenti. C'è una variazione di materiali e colori degli apparati di più elevata labirinto.
- I topi sono alloggiati con un 12-h luce / ciclo scuro (luci accese alle 7:00), come descritto in precedenza (Takao & Miyakawa, 2006a). Test del comportamento è effettuata 9:00-6:00. Tutti i topi sperimentali vengono trasferiti al comportamento test sala 30 minuti prima di iniziare il primo trial di abituare alla condizione della sala prove comportamento. L'ordine delle prove è controbilanciato tra genotipi. Ci sono due fini della prova, prova pratica con un animale. Uno è quello di assicurarsi che tutto va bene con il sistema di registrazione. Un altro è quello di mantenere la condizione di test il più uniforme possibile. Vale a dire, il mouse prima in tutta la seduta sarebbe stato un po 'diversa esperienza con gli altri (cioè, nessun rumore prima fatta da operazioni di collaudo e senza spunti odori provenienti da studi precedenti), senza una prova pratica. Gli animali siano mantenuti secondo le linee guida del Comitato di Ricerca Animale dell'Università di Kyoto.
- La sala collaudo comportamento (170 x 210 x 200 cm, Ohara & Co., Tokyo) è insonorizzata e il livello di illuminazione è mantenuta a 100 lux. Un mouse è posizionato nella zona centrale del labirinto con la testa rivolta verso un braccio chiuso. Il test labirinto più elevato viene registrato con una videocamera collegata a un computer, che è controllato da un dispositivo remoto. Il numero di voci (una voce è definito come il centro di massa del mouse entra al braccio) in ogni braccio e il tempo speso nei bracci aperti sono registrati e queste misure servono come indice di ansia comportamento simile.
- I topi sono autorizzati a muoversi liberamente nel labirinto per 10 min. Ogni topo riceve una prova della nostra batteria di test. L'applicazione utilizzata per l'acquisizione e l'analisi dei dati comportamentali (immagine EP) è basato sul programma di pubblico dominio J immagine (sviluppato da Wayne Rasband presso l'Istituto Nazionale di Salute Mentale e disponibile http://rsb.info.nih.gov/ ij / ), che è stato modificato da Tsuyoshi Miyakawa (disponibile tramite O'Hara & Co., Tokyo, Giappone).
- La distanza percorsa, il numero di voci in ogni braccio, il tempo trascorso in ogni braccio, e la percentuale di inserimenti nelle braccia aperte sono calcolati dal programma PE immagine.
- Dopo ogni prova, tutte le armi e la zona centro vengono puliti con acqua eccellente ipocloroso, che è un efficace agente di rimozione degli odori e ha un odore relativamente debole di se stessa rispetto ad altre soluzioni di pulizia, per evitare un pregiudizio basato su stimoli olfattivi. Così possiamo effettuare i test in condizioni controllate per quanto riguarda stimoli olfattivi.
Discussion
Sebbene il genoma del topo è stato sequenziato, le funzioni della maggior parte dei geni non sono noti. Tecniche di modificazione genetica consentono la cancellazione o la manipolazione di altri di uno specifico gene nei topi (Austin et al, 2004;.. Aiba et al, 2007). L'influenza di un dato gene in un comportamento specifico può essere determinato da condurre analisi del comportamento dei topi mutanti (Takao e Miyakawa, 2006b;. Takao et al, 2007).
La prova più elevata labirinto è una delle prove più popolari di tutti i modelli animali attualmente disponibili di ansia (Rodgers e Dalvi, 1997; Crawley, 2007). Questo test per l'ansia comportamento simile è stato utilizzato per lo screening e fenotipizzazione topi transgenici e knockout (Crawley, 1999) e per la scoperta (Hogg et al 1996;. Crawley, 2007). La prova più elevata labirinto ha una forte validità predittiva per lo screening di farmaci ansiolitici (Rodgers e Dalvi, 1997; Mechiel Korte e De Boer, 2003; Crawley, 2007); farmaci ansiolitici specificamente aumentare, e le droghe ansiogeno specificamente diminuire, il numero di voci in le braccia aperte e il tempo trascorso. Il punteggio totale le voci e la distanza totale sono considerate un utile indice di attività generali. Punteggio totale le iscrizioni è anche un indice di ansia, e le percentuali di voci e di tempo speso in ogni braccio costituiscono l'indice di ansia primaria (Rodgers e Dalvi, 1997, Mechiel Korte e De Boer, 2003). Le braccia aperte e chiuse sono considerati per evocare la stessa unità esplorativa, pertanto, di evitare le braccia aperte è considerata una conseguenza della induzione di alti livelli di paura (Rodgers e Dalvi, 1997). Si pensa che l'avversione dei topi per esplorare le braccia aperte del labirinto è causato dalla paura degli spazi aperti ed elevato.
Nel 1984, Handley e Mithani riferito sul lavoro preliminare con l'elevato X (più) test del labirinto descritto sopra. L'apparato sperimentale originale è stato sollevato 70 centimetri sopra il pavimento, e comprendeva due chiuse e due braccia aperte, ognuna delle quali misura 45 cm di lunghezza per 10 cm di larghezza. Nei loro studi iniziali, hanno segnalato il rapporto di aperto / totale voci braccio (Handley e Mithani, 1984). Successivamente, altri indici sono stati sviluppati che includevano il numero di voci tra le braccia chiuse e aperte e il tempo trascorso nei bracci chiusi e aperti per i ratti (Pellow et al, 1985; Pellow e File, 1986) e topi (Lister, 1987) .
Modifiche alla prova più elevata labirinto incluso allungamento di entrambe le braccia aperte (50 x 10 cm) e le braccia chiuso (50 x 10 x 40 cm) con alte mura e un tetto aperto sulle braccia chiuse, e il labirinto intera è stata elevata ad un'altezza di 50 cm (Pellow et al, 1985; Pellow e File, 1986). Attualmente, nel nostro laboratorio, la più elevata di prova labirinto è configurato in forma di +, con due braccia aperte (25 x 5 cm, con un lievissimo, 0,5 cm, parete) di fronte all'altro e perpendicolari a due braccia chiuso (25 x 5 x 16 cm), ed è sollevato 50 cm sopra il pavimento (Miyakawa et al, 1996; Manabe et al, 2000; Miyakawa et al, 2001; Seeger et al, 2004; Morishima et al, 2005; Miyamoto et al, 2005; Arrow et al, 2006; Hattori et al, 2007; Niemann et al, 2007; Sano et al, 2008; Horii et al, 2008; Fukuda et al, 2008; Ikeda et al, 2008). Il mouse è posizionato al centro del + (5 cm x 5 cm) ed è permesso di esplorare il labirinto liberamente. Se 5 minuti di registrazione è comune, il comportamento è registrato per 10 minuti nel nostro protocollo per aumentare la possibilità di rilevare il fenotipo. Le braccia aperte e chiuse elevato indurre un conflitto di esplorazione (Mechiel Korte e De Boer, 2003; Crawley, 2007).
Le misure della prova più elevata labirinto vengono registrati da un osservatore durante l'esperimento. Nel nostro laboratorio, il test viene registrato con una videocamera collegata ad un computer e dei dati comportamentali (Immagine EP) vengono acquisiti e analizzati utilizzando il programma PE immagine. Numero di voci sulla braccia aperte contro il numero di voci braccio totale, e il tempo trascorso sulle braccia aperte rispetto a braccia chiuse, di fornire le misure di ansia comportamento simile.
Abbiamo valutato più di 90 ceppi di topi mutanti geneticamente modificati utilizzando il protocollo mostrato nel film e hanno un grande insieme di dati grezzi per più di 5000 topi (compresi wild-type e topi mutanti). Nella nostra batteria di test, wild-type fratellini sono di solito usati come controllo. Come un ceppo di fondo, i topi C57BL/6J sono ampiamente utilizzati. Abbiamo raccolto i dati di topi C57BL/6J nei test comportamentali. I valori ottenuti dai topi C57BL/6J nel nostro test labirinto più elevate sono le seguenti (n = 914; media ± SEM); distanza totale percorsa: 1.547,55 14,27 centimetri; durata del tempo trascorso: 56,49 2,42 s (braccia aperte), 384,02 3,13 s (braccia chiuso), 161,90 2,17 s (centro labirinto); rapporto tra tempo trascorso in braccia aperte: 9,19 0,36%, il rapporto del tempo trascorso tra le braccia chiuse: 63,82 0,52%, il numero di voci: 7.64 0.21 (braccia aperte), 24,32 0,28 (braccia chiuso); voci braccio% aperto: 21.9 0.05, chiuso% voci braccia: 78.1 0.05. Topi C57BL/6J passare meno tempo a braccia aperte che chiuse in armi (p <0.0001, n = 914, appaiati-t test). Questo indica che i topi C57BL/6J tendono ad evitare le braccia aperte, e che il tempo trascorso in braccia aperte è un indice valido di ansia comportamento simile. Inoltre, l'ordine delle prove è controbilanciato tra genotipi, perché il numero di prova riguarda il tempo trascorso in braccia aperte e la piattaforma centrale. Cioè, gli indici di tutti aumentare durante i topi 3 e 4 rispetto al primo topi (p = 0,0089, n = 476) (dati non pubblicati). Con il nostro protocollo, l'analisi di più di 1661 topi hanno mostrato che l'ordine sequenziale dei topi testati in una gabbia non influenza significativamente il tempo di permanenza aperto braccio (dati non pubblicati). Cioè, le performance dei topi prima preso dalla gabbia non molto diverse da quelle del secondo, il terzo o il topo scorso.
Anche se la prova più elevata labirinto e il chiaro / scuro prova transizione sono entrambi utilizzati per valutare l'ansia, come il comportamento, i risultati non sono sempre coerenti tra loro (Holmes et al, 2000; Tujimura et al, 2008; Nakajima et al, in press ) Ad esempio, proencefalo specifici calcineurina-topi knockout trascorrere una diminuzione della quantità di tempo nella camera di luce nella luce / buio prova di transizione, ma una maggiore quantità di tempo tra le braccia aperte nella prova più elevata labirinto (Miyakawa et al. , 2003). L'analisi fattoriale della nostra batteria di test comportamentali indica che il test labirinto più elevate e la luce / buio prova transizione valutare diversi aspetti di ansia comportamento simile, come ad esempio luminoso spazio-ansia alla luce / buio prova di transizione e open-space ansia-come comportamento nel test a campo aperto (Takao e Miyakawa, 2006b; Yamasaki et al, 2006). Di conseguenza, sia il chiaro / scuro prova di transizione e il test più elevata labirinto sono inclusi nella nostra batteria di test comportamentali.
Tiger e colleghi hanno riportato che le variabili incontrollate e sperimentazioni che caratterizzano i mutanti possono dare risultati che sono specifici di un laboratorio di particolare (Crabbe et al., 1999). Le differenze procedurali che esistono tra i laboratori rendono difficile da replicare o confrontare i risultati tra di loro. Stabilire documentazione visiva del protocollo intende promuovere una migliore comprensione delle procedure sperimentali, permettendo per la standardizzazione dei protocolli utilizzati in laboratori e confronti tra i fenotipi comportamentali dei vari ceppi di topi mutanti valutata usando questi test. Abbiamo già pubblicato un protocollo film della luce / buio prova di transizione (Takao e Miyakawa, 2006a). Allo stesso modo, i filmati di altri protocolli, come ad esempio per il test a campo aperto, il porsolt costretto prova nuotare, e prove di condizionamento alla paura che usiamo nella nostra batteria di test comportamentali sono attualmente in corso per la pubblicazione di articoli di giornale futuro video.
Disclosures
Tutte le procedure sono state approvate con l'uso degli animali e del Comitato cura dell'Università di Kyoto.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalle sovvenzioni-in-Aid per la Ricerca Scientifica della Società giapponese per la promozione della scienza (JSP), Grant-in-Aid dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia in Giappone, Grants-in- aiuto BIRD e CREST del Giappone Scienza e della Tecnologia Agenzia, Grant-in-Aid da Neuroinformatica Giappone Center (NIJC), RIKEN e da Grant-in-Aid per la ricerca scientifica sulle Settori prioritari-Integrativa Brain Research (Shien) - da MEXT in Giappone. Ringraziamo O'hara & Co. e Mariko Hayashi per la loro assistenza nella creazione di questo film.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated plus maze | Tool | O’hara Co. | (none) |
References
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